Mediator это крупный из многих субъединиц комплекс, который был открыт вследствие усилий понять, как RNA polymerase II (Pol II)-обеспечиваемая транскрипция регулируется с помощью транскрипционных факторов у дрожжей (Nonet and Young, 1989; Kelleher et al., 1990; Thompson et al., 1993; Kim et al., 1994). Комплекс, состоящий примерно из 30 полипептидов (Fig. 1), законсервирован от дрожжей до человека и играет важную роль в регуляции транскрипции. Многие лаб. использовали разнообразные процедуры, чтобы выделить Mediator комплексы у млекопитающих, который назывался TRAP/SMCC, NAT, ARC, DRIP, Srb/MED, PC2, CRSP и у мышей Mediator (Jiang et al., 1998; Sun et al., 1998; Boyer et al., 1999; Ito et al., 1999; Kingston, 1999; Naar et al., 1999; Rachez et al., 1999; Ryu et al., 1999; Malik et al., 2000). В 2004, предложена унифицированная номенклатура для Mediator, состоящего из MED1 - MED31, вместе с cyclin-dependent kinase (CDK) 8-cyclin C парой и несколькими паралогами, такими как MED1-like (MED1L), MED12L, MED13L и CDK19 (Bourbon et al., 2004). Комплекс Mediator может быть подразделен на 4 самостоятельных модуля, наз. головным, средним, хвостовым и CDK8 киназным модулем, который содержит CDK8 (или его паралог CDK19), cyclin C, MED12 (или MED12L) и MED13 (или MED13L) субъединицы (Malik and Roeder, 2010;Taatjes, 2010). Важно, что субъединичный состав Mediator может варьировать и не ограничивается одиночной изоформой. Напр., иммуноистощение комплекса Mediator из экстрактов ядер HeLa с помощью anti-CDK8 антител показало, что Mediator состоит, по крайней мере, из двух главных изоформ, отличающихся по присутствию или отсутствию CDK8 субмодуля (Wang et al., 2001). Кроме того, MED1 и MED26 присутствуют не во всех изолированных изоформах (Malik and Roeder, 2010). Fig. 1.

После первоначального открытия Mediator,исследования в основном сфокусировались на том, как комплекс Mediator передает сигналы от транскрипционных факторов к Pol II аппарату (machineries) и general transcription factors (GTFs). Эти исследования привели к формулировке модели 'моста', согласно которой Mediator соединяет транскрипционный фактор и Pol II аппарат и способствует образованию пре-иниационного комплекса (Biddick and Young, 2005; Bjorklund and Gustafsson, 2005; Malik and Roeder, 2005). Однако вскоре стало ясно, что многие пути, ответственные за рост, дифференцировку клеток или развитие ткани, способны конвергировать на одной или более из почти 30 субъединиц Mediator посредством регуляторов транскрипции, это подтвердило, что Mediator действует как централизованный 'hub' или 'интегратор' для регуляции транскрипции (Malik and Roeder, 2010; Carlsten et al., 2013). Недавно исследования выявили новые функции Mediator, подчеркивая его участие почти на всех стадиях Pol II транскрипции, включая эпигенетическую регуляцию, транскрипционную элонгацию, терминацию, процессинг мРНК, активацию некодирующей РНК и образование супер энхансера (Fig. 2). Недавние доказательства также подтвердили роль комплекса Mediator в онтогенетических аномалиях, раке и метаболических нарушениях. Очевидно, что Mediator действует как главный координатор, регулирующий множественные аспекты транскрипции, чтобы гарантировать правильные интенсивность, паттерн и время глобальной экспрессии гена как во время развития, так и у взрослых. Fig. 2.

Molecular mechanisms of Mediator function in transcriptional control

Помимо взаимодействия со многими транскрипционными факторами, растет число исследований, указывающих, что комплекс Mediator может служить в качестве контактной поверхности (interface) для множественных транскрипционных кофакторов, некодирующих РНК и др. факторов (Table 1).

Table 1.
Interactions between Mediator subunits and well-defined factors and their role in physiological/developmental processes

Interactions with master regulators of cell fate

Некоторые связывающие ДНК транскрипционные факторы, также наз. 'главными регуляторами', обладают способностью детерминировать клон-специфические программы транскрипции. Напр., MyoD, PPARγ и Runx2 контролируют генетические программы, приводящие к дифференцировке в скелетные мышцы, адипоциты и остеоциты, соотв. (Davis et al., 1987; Tontonoz et al., 1995; Komori, 2002). Недавно, 4 'Yamanaka' фактора [Oct4 (также известен как Pou5f1), Sox2, c-Myc и Klf4], как было установлено, непосредственно перепрограммируют многие типы соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig et al., 2008). Кроме того, многие клон-специфические или неспецифические транскрипционные факторы были использованы для превращения фибробластов в определенные клеточные судьбы, такие как кардиомиоциты, клетки крови, нейроны и гепатоциты (Ieda et al., 2010; Szabo et al., 2010; Vierbuchen et al., 2010; Huang et al., 2011; Sekiya and Suzuki, 2011). Общей темой является то, что как только ключевые регуляторы транскрипции были идентифицированы и принуждены к избыточной экспрессии, то клеточные судьбы оказались перепрограммированы (т.e. изменены). С момента открытия комплекса Mediator, многие такие основные регуляторы были найдены в качестве мишени для одной или более субъединиц Mediator в отношении своей транскрипционной активности, это привело к мнению, что комплекс Mediator действует как главный координатор детерминации клеточных судеб. Напр., MED1 подвергается целенаправленному воздействию с помощью адипоцитарного основного регулятора PPARγ (Fig. 1) (Ge et al., 2002). Более поздние исследования подтвердили, что ассоциация между MED1 и эритроидным регулятором GATA1 предопределяет развитие клона кровяных клеток (Stumpf et al., 2006). Важно, что действия PPARγ и GATA1, скорее всего, разделены по времени и пространству в ходе развития, поэтому вряд ли возможно, что эти два фактора будут действовать одновременно на клеточный клон и приводить к неправильным (confused) качественным характериситам клеток.

Субъединицы Mediator также могут играть противоположные роли в спецификации клонов. Мы недавно продемонстрировали, что присутствие или отсутствие MED23 в мезенхимных стволовых клетках может тонко настраивать или расстраивать программы из двух генов, приводя к двум отличающимся клеточным судьбам, а именно к адипоцитам и гладкомышечным клеткам (Fig. 1) (Wang et al., 2009; Yin et al., 2012). Дополнительные примеры клональной регуляции с помощью Mediator включают взаимодействие между мастером регулятором хондрогенеза Sox9 и MED12 и MED25 (Zhou et al., 2002; Nakamura et al., 2011), и взаимодействие между фактором плюрипотентности Nanog и MED12 (Fig. 1) (Tutter et al., 2009). Т.о., в своей роли в качестве интерфейса между транскрипционными факторами и Pol II транскрипционным аппаратом комплекс Mediator способен контролировать многие главные регуляторы спецификации различных клеточных клонов, подтверждая идею, что Mediator может быть квалифицирован как главный координатор спецификации клеточных клонов. Необходимо отметить, однако, в качестве мастера координатора субъединицы Mediator могут быть необходимы для определенного мастера регулятора, чтобы управлять клеточным клоном, но избыточная экспрессия субъединицы может быть недостаточна, чтобы изменить клеточную судьбу.

Mediator and the cohesin complex for cell type-specific gene activity

Образование петли ДНК, способствующее коммуникации между энхансером, связанными с транскрипционными факторами, и общим аппаратом транскрипции. Такое образование петли может быть обусловлено частично с помощью комплекса cohesin (Dorsett, 2011; Remeseiro et al., 2013). Иммунопреципитация хроматина сопровождаемая секвенированием (ChIP-seq) и биохимический анализ выявили, что Mediator сотрудничает с комплексом cohesin, чтобы связывать энхансеры со стержнем промотора, активируя транскрипцию различных наборов генов в эмбриональных стволовых клетках (ESCs) мыши и в эмбриональных фибробластах (MEFs) мыши (Kagey et al., 2010). Редукция, обеспечиваемая short hairpin RNA (shRNA), компонентов или комплекса Mediator или комплекса cohesin дает сходные фенотипы: потерю состояния ESC, что подтверждается снижением экспрессии Oct4, и разрушение колоний ESC (Kagey et al., 2010; Apostolou et al., 2013; Phillips-Cremins et al., 2013). Прямое взаимодействие между Mediator и комплексом cohesin, вместе с специфичным для типов клеток совместным расположением Mediator-cohesin комплекса в разных геномных регионах, подтверждает, что Mediator-cohesin комплекс способствует специфичной для типа клетки активацией посредством образования петли ДНК с помощью энхансера-промотора.

Mediator mediates 'super enhancer' formation for cell identity

Как Mediator функционирует с главными регуляторами разных клональных программ? Недавняя работа группы Young подтвердила механистические взаимоотношения между основными регуляторами и комплексом Mediator (Whyte et al., 2013). Это исследование продемонстрировало, что комплекс Mediator может способствовать образованию супер энхансеров, которые являются кластерами энхансеров, оккупированных и Mediator и главным регулятором(ами). Такие супер энхансеры обычно устанавливаются с разными главными транскрипционными факторами и действуют, чтобы контролировать ключевые гены клеточных качественных особенностей, таких клеток как ESCs, pro-B cells, мышечные трубки, T helper клетки и макрофаги (Whyte et al., 2013). Соотв., пониженные уровни Mediator или главных транскрипционных факторов приводят преимущественно к снижению экспрессии клон-специфических генов. Эта роль комплекса Mediator в становлении супер энхансеров предоставляет новую механистическую информацию о том, как они могут функционировать в онтогенетической регуляции генов.

Mediator and epigenetic regulators

Клеточно-специфичные паттерны транскрипции могут быть изменены путем модулирования активности или экспрессии немногих основных регуляторов клеточных судеб. Однако эпигенетика также играет важную роль в спецификации типов клеток и сегодня ясно, что процессы дифференцировки сопровождаются существенными изменениями на уровне хроматина (Dambacher et al., 2013). Недавно начаты исследования взаимоотношений между комплексом Mediator и эпигенетическими регуляторами. Напр., специфичный для нейронов репрессор, REST, соединяется с субъединицами Mediator MED19 и MED26, которые затем рекрутируют G9a (также известен как Ehmt2), гистоновую H3K9 метилтрансферазу благодаря взаимодействию MED12-G9a (Fig. 1) (Ding et al., 2008). Этот комплекс может репрессировать нейрональные гены в не нейрональных клетках. Более того, мутации MED12 обнаружены у пациентов с Х-сцепленной умственной отсталостью, они ослабляют способность Mediator поставлять G9a и вызывают аномальную экспрессию нейрональных генов (Ding et al., 2008). В др. сообщении две киназные субъединицы комплекса Mediator, CDK8 и CDK19, взаимодействуют с гистоновой аргинин метилтрансферазой PRMT5 и WD-repeat protein 77 (WDR77; также известен как MEP50), соотв., необходимыми для дальнейшего рекрутирования ДНК метилтрансферазы DNMT3A и последующей репрессии генов, регулируемых C/EBPβ (Tsutsui et al., 2013). Т.о., индивидуальные компоненты Mediator, по-видимому, обладают склонностью к разным эпигенетическим событиям, таким как доставка специфических гистонов или модификаторов ДНК, которые, в свою очередь, влияют на специфические эпигенетические модификации.

Mediator and transcriptional elongation and termination

Перевод в паузу Pol II в проксимальной части промотора и высвобождение находящейся в паузе Pol II в продуктивную элонгацию считается важным механизмом контроля транскрипции (Adelman and Lis, 2012). Накапливаются доказательства, подтверждающие, что Mediator участвует в высвобождении находящейся в паузе Pol II и способствует продуктивной элонгации. Напр., недавно было показано, что Pol II элонгация коррелирует с зависимым от Mediator рекрутированием super elongation complexes (SECs), который содержит членов семейства eleven-nineteen lysine-rich in leukemia (ELL) и их партнёров по связыванию ELL-associated factors (EAFs), positive transcription elongation factor b (P-TEFb) и other белки (Takahashi et al., 2011). В данном исследовании наблюдали, что N-конец MED26 содержит сайт пристанище для SEC и др. комплексов, содержащих ELL/EAF, так же, как и генеральный фактор инициации транскрипции TFIID. MED26 может, следовательно, действовать как молекулярный переключатель, который сначала соединяется с TFIID в пре-иниационный комплекс и затем обменивается с SECs для Pol II элонгации (Takahashi et al., 2011).

Недавние исследования подтвердили, что модуль CDK8 участвует также в транскрипционной элонгации. Первоначально модуль CDK8 был описан как корепрессор транскрипции из-за фосфорилирования Pol II C-терминального домена и TFIIH с помощью CDK8 он мог блокировать сборку и функцию комплекса инициации транскрипции (Hengartner et al., 1998; Sun et al., 1998; Akoulitchev et al., 2000). Однако ранее было установлено, что CDK8 присутствует также на промоторе генов, активируемых сывороткой (Wang et al., 2005), подтверждая, что CDK8 обладает позитивной функцией во время транскрипции. Более того, группа Espinosa выявила роль CDK8 в транскрипционной элонгации (Donner et al., 2010). Истощение CDK8 не оказывало эффекта на рекрутирование Pol II на промоторы генов или на общее внутригенное расположение Pol II, а вместо этого вызывало нарушение доставки CDK7 и CDK9, необходимой для рекрутирования P-TEFb и BRD4 для Pol II элонгации. Недавно было продемонстрировано, что hypoxia-inducible factor 1A (HIF1A) рекрутирует CDK8-Mediator и SEC, содержащий SEC каркасный белок AFF4 и CDK9, чтобы облегчить вступление в паузу Pol II (Galbraith et al., 2013). Это исследование показало, что CDK8 необязательна для связывания с хроматином HIF1A, но важна для связывания SEC и для Pol II элонгации в ответ на гипоксию.

Субъединица MED23 Mediator также регулирует транскрипцию и как было показано ранее, контролирует MAPK-Elk1-активированный ген Egr1 после образования пре-иниационного комплекса, т.е. на ступени после рекрутирования (Wang et al., 2005). При стимуляции сывороткой, истощение MED23 нарушает взаимодействие Elk1-Mediator, предупреждая высвобождение предварительно связанной Pol II для элонгации (Wang et al., 2005). Недавно мы показали, что в условиях отсутствия стимуляции, экспрессия Egr1 сильно снижается в клетках, истощенных по MED23, тогда как расположение Pol II, GTFs, комплекса Mediator или активатора Elk1 на промоторе Egr1 остается неизменным (Wang et al., 2013). Однако, истощение MED23 приводит к достоверному снижению P-TEFb и элонгирующей Pol II (маркированной фосфорилированием по serine-2) на кодирующем регионе. Дальнейшие эксперименты подтвердили, что MED23 контролирует базовый уровень транскрипции с помощью рекрутирования фактора элонгации P-TEFb посредством прямого взаимодействия с его субъединицей CDK9 (Wang et al., 2013). Итак, эти находки демонстрируют, что Mediator регулирует транскрипционную элонгацию, возможно с помощью множественных субъединиц за счет множественных механизмов ген-специфическим способом.

Недавно выявлено взаимоотношение между Mediator и завершением транскрипции. MED18 оказался важным для терминации у дрожжей (Mukundan and Ansari, 2011). В отсутствие MED18, рекрутирование фактора терминации и Pol II на 3' конец генов было нарушено и фенотип нарушения считывания обнаружен in vitro. Следовательно, Mediator регулирует не только транскрипционную элонгацию, но и также терминацию.

Mediator and RNA processing

У высших видов альтернативный сплайсинг затрагивает большинство генов, кодирующих белки, и создает функциональное разнообразие генных продуктов, чобы удовлетворить нужды разных типов клеток. Сплайсинг пре-мРНК в основном связан с транскрипцией, он позволяет непосредственное распознавание возникающих сигналов для сплайсинга аппаратом сплайсинга. Однако несмотря на обширные исследования этот механизм связи до конца не понятен. Используя тандемную очистку сродства в комбинации с масс спектрометрией, мы недавно идентифицировали несколько факторов преобразования пре-мРНК, которые специфически соединяются с MED23 (Huang et al., 2012). Среди них heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L (HnRNP L), взаимодействие которого с MED23 было выявлено in vitro и in vivo. Функционально, MED23 и HnRNP L совместно регулируют существенный субнабор событий альтернативного сплайсинга и альтернативного расщепления и полиаденилирования (Huang et al., 2012). Эти находки демонстрируют важность функции Mediator в регуляции процессинга мРНК и выявляют общение между комплексом Mediator и аппаратом сплайсинга, предоставляя тем самым механистическую информацию о связи транскрипции и сплайсинга.

Interactions between Mediator and long intergenic noncoding RNAs

Недавние успехи выявили большое количество транскриптов, наз. длинными межгенными некодирующими РНК long intergenic noncoding RNAs (lincRNAs), не обладающие белок-кодирующим потенциалом, но играющие важные роли во множественных биологических процессах (Ørom et al., 2010; Ulitsky and Bartel, 2013). Недавнее исследование продемонстрировало, что особый класс lincRNAs, наз. ncRNA-activating (ncRNA-a), активирующий соседние гены посредством цис-обеспечиваемого механизма, взаимодействует с Mediator путем закрепления его на хроматине для активации генов (Lai et al., 2013). Более того, истощение субъединицы MED12 специфически и мощно снижает активацию транскрипции, индуцируемую ncRNA-a, а связанные с болезнью MED12 мутации уменьшают способность Mediator ассоциировать с ncRNA-a. Эти результаты демонстрируют, что комплекс Mediator способен обеспечивать транскрипционную активацию посредством некодирующих РНК.

Roles of the Mediator complex in development

Учитывая роль различных субъединиц Mediator в программах генной экспрессии, связанных с выбором клеточных судеб, участием Mediator во многих онтогенетических процессах, участие его в болезнях человека становится всё более очевидным. В частности, исследования нокаутных мышей, несущих мутации в отдельных субъединицах Mediator (Table 2), вместе с исследованиями на др. модельных организмах (Table 3), предоставили ключевую информацию об онтогенетических ролях различных субъединиц Mediator.

Table 2.
Phenotype or developmental processes affected in Mediator subunit-deficient mice or cells

Table 3.
Phenotype or developmental processes affected following Mediator subunit perturbation in animal models

Insights from Mediator subunit knockout mice

Технология генного нокаута (KO) является мощным методом оценки важности определенных генов во время развития. После открытия комплекса Mediator, были получены KO мыши для некоторых индивидуальных субъединиц Mediator (Table 2). Удивительно, все эти KO мыши оказались эмбриональными леталями рано или позно с различными дефектами, указывающими на общую потребность Mediator для многих аспектов эмбрионального развития.

Med1 нулевые мыши, напр., погибали на день эмбриогенеза (E) 11.5 из-за неспособности плаценты (Ito et al., 2000; Zhu et al., 2000). Эти мыши обнаруживали нарушения образования сердца, аномальное нейральное развитие, некроз печени и дефекты гематопоэза. Med1 гипоморфные мутанты с пониженными уровнями MED1 доживают до E13.5 и обнаруживают аномалии развития, сходные с теми, что наблюдаются у нулевых мышей на ранних стадиях (Landles et al., 2003). Это исследование продемонстрировало, что MED1 необходим для раннего внеэмбрионального развития плаценты, которое, по-видимому, и служит причиной эмбриональной летальности нулевых мышей на ст. E11.5. Эта эмбриональная летальность может быть частично устранена с помощью тетраплоидной агрегации и эмбрионы остаются живыми вплоть до ст. E13.5, но в конечном итоге погибают от сходных причин, как и Med1 гипоморфные мутанты, это указывает на то, что MED1 также необходим для более позднего развития многих органов.

Med12 гипоморфные мутанты, напротив, неспособны развиваться после ст. E10 и обнаруживают тяжелые дефекты закрытия нервной трубки, удлинения оси, сомитогенеза и образования сердца (Rocha et al., 2010). Эмбрионы, неспособные экспрессировать MED12, погибают на ст. E7.5 и неспособны устанавливать переднюю висцеральную энтодерму или активировать экспрессию brachyury и они не завершают гаструляцию (Rocha et al., 2010).

Med21 KO мыши, с др. стороны, погибали рано на стадии бластоциста (Tudor et al., 1999). Кроме того, мышиные ESCs имеющие делецию Med21 не выживают, это согласуется с потребностью в Srb7, который является дрожжевым гомологом MED21, для связывания Pol II и геномной экспрессии гена (Chao et al., 1996), подтверждая важную роль MED21 в общей структуре и функции Mediator. Следовательно, MED21 важен для жизнеспособности клеток и раннего эмбрионального развития.

Развитие Med23 нулевых эмбрионов задерживается и мутантные эмбрионы погибают между E9 и E10.5. Все три зародышевых слоя развиваются у этих мутантов и начинается ранний органогенез перед гибелью, это, скорее всего, результат недостаточности системного кровообращения (Balamotis et al., 2009). В противоположность Med21, нулевые Med23 ESCs прекрасно выживают и изменяется только экспрессия небольшого набора генов (Stevens et al., 2002; Wang et al., 2005). Генетическое устранение Med24 показывает, что он не важен для жизнеспособности клеток; однако, Med24 нулевые мыши погибают на ранних ст. развития, между E8.5 и E10.5, с тяжелой гипоплазией (Ito et al., 2002). В частности, частично блокирован гематопоэз желточного мешка, а кардиальная гипоплазия вызывает тяжелую сердечную недостаточность, сосуды развиваются плохо и развитие ЦНС аномально. Эти результаты указывают на то, что фенотипическая тяжесть Med24 нулевых эмбрионов, лишенных субмодуля, состоящего из MED24, MED23 и MED16 (Ito et al., 2002; Stevens et al., 2002), оказывается промежуточной между таковой у мутантов Med1 и Med21.

Мутация в мышином гене Med31 была идентифицирована при скрининге. Эти мыши редко обнаруживаются после E16.5, указывая на летальность в поздней беременности (Risley et al., 2010). Эти Med31 мутантные эмбрионы обнаруживают мало пролиферирующих клеток в зачатках передних конечностей и обнаруживают задержку хондрогенеза из-за отсутствия экспрессии Sox9 и Col2a1. Кроме того, клетки эмбриональных фибробластов, происходящие от мутантных эмбрионов обнаруживают тяжелые дефекты пролиферации.

Киназные субъединицы из Mediator также затрагиваются. Гетерозиготные мыши, обладающие инактивированным геном с trap инсерцией в локусе Cdk8 не обнаруживают фенотипических отклонений (Westerling et al., 2007), но при взаимном скрещивании эти мыши не были способны продуцировать гомозиготное Cdk8 нулевое потомство. Онтогенетический анализ продемонстрировал эмбриональную летальность гомозиготных мышей на ст. E2.5 - E3.0, перед имплантацией; Cdk8 нулевые эмбрионы имеют фрагментированные бластомеры и не проходят компакцию (Westerling et al., 2007), указывая на важную роль CDK8 для жизнеспособности клеток и раннего развития.

Итак, хотя все MED KO мыши являются эмбриональными леталями, они погибают на разных стадиях развития с отличающимися фенотипами, подтверждая важность и специфичность ролей для индивидуальных субъединиц Mediator во время развития.

Mediating adipocyte differentiation: MED1, MED14 and MED23

Исследования нокаутов генов, рассмотренные выше, подтверждают, что все субъединицы Mediator играют существенную роль во многих аспектах эмбрионального развития. Дифференцировка адипоцитов является хорошим примером онтогенетического пути, регулируемого Mediator. Три субъединицы комплекса Mediator, а именно MED1, MED14 и MED23, участвуют в регуляции дифференцировки преадипоцитов, действуя посредством разных механизмов и на разных стадиях. Анализ MEFs, происходящих от Med1 KO мышей показал, что MED1 важен для PPARγ-управляемого адипогенеза, но не для MyoD-управляемого миогенеза (Ge et al., 2002). MED1 может взаимодействовать с C-терминальным доменом AF2 многих ядерных рецепторов, включая PPARγ, благодаря своему LXXLL мотиву лиганд-зависимым способом (Zhu et al., 1997; Yuan et al., 1998). Неожиданно, экспрессия мутантной формы MED1, лишенной LXXLL мотива (и поэтому не связывающая PPARγ in vitro) у Med1 нулевых MEFs. достаточна для восстановления PPARγ-управляемым адипогенезом, подтверждая, что существует независимый от LXXLL мотива механизм рекрутирования PPARγ на адипогенные гены (Ge et al., 2008). Дальнейшие эксперименты показали, что MED14 может взаимодействовать с N-терминальным AF1 доменом в PPARγ независимо от своего лиганда, подтверждая, что MED14 действует как якорь для рекрутирования Mediator на PPARγ (Gr?ntved et al., 2010), это может также объяснить, почему LXXLL MED1 мутант может восстанавливать адипогенез.

Передача сигналов инсулина также играет критическую роль в обеспечении адипогенеза, но механизм, с помощью которого передача сигналов инсулина передается адипогенному транскрипционному каскаду, остается неизвестным. Исследования в нашей лаб. показали, что MED23 и её соединение с транскрипционным фактором Elk1 лишены связи с этой ранней стадией дифференцировки. Med23 KO или нокдаун Med23 в MEFs, в адипоцитах, происходящих из стволовых клеток, 3T3L1 клеток и 10T1/2 клеток, ингибирует вызываемый гормонами адипогенез (Wang et al., 2009; Yin et al., 2012). В отсутствие Elk1 или MED23, Krox20 (также известен как Egr2), быстро реагирующие ген, стимулируемый с помощью инсулина во время адипогенеза, становится неиндуцибельным, а избыточная экспрессия Krox20 в дефицитных по MED23 клетках может устранять дефекты адипогенеза. Эти наблюдения подтверждают, что MED23 играет роль на ранних ст. адипогенеза путем связывания передачи сигналов инсулина с адипогенным транскрипционным каскадом. Эти исследования также подтверждают мнение, что ключевые клональные регуляторы контролируют программы клон-специфических генов путем целенаправленного предоставления разных субъединиц Mediator и что разные субъединицы Mediator могут также играть разные роли на разных стадиях, чтобы обеспечивать собственно клональное развитие.

Mediating neuronal differentiation: MED12, MED13, MED19 and MED26

Многие болезни человека ассоциированы с дегенерацией нервов. Недавно несколько субъединиц комплекса Mediator оказались связаны с экспрессией нейрональных генов и болезнями. Специфичный для нейронов транскрипционный репрессор REST поставляет комплекс Mediator для супрессии нейрональных генов посредством взаимодействия с MED19 и MED26 (Fig. 1) (Ding et al., 2009). Эта супрессия осуществляется посредством рекрутирования гистоновой H3K9 метилтрансферазы G9a посредством REST-MED19/26-MED12-G9a комплекса на промоторы нейрональных генов. Более того, Med12 мутантные мыши обнаруживают тяжелые дефекты закрытия нервной трубки (Rocha et al., 2010). Med12 был также идентифицирован при крупномасштабном скрининге мутантов у рыбок данио, связанных с аномальным нейральным развитием (Wang et al., 2006). Др. скрининг на мутантов у рыбок данио, напоминающих фенотип двойных мутантов Sox9a/Sox9b (двух ключевых факторов развития нервного гребня), также идентифицировал Med12 (Rau et al., 2006). Исследования MED12 и MED13 (также известен как Kohtalo и Skuld) были также проведены на Drosophila (see Table 3), где они играют роль в развитии сетчатки, крыльев и кристаллических клеток.

Mediating smooth muscle differentiation: MED23 and MED28

Предыдущие исследования выявили функцию субъединицы MED28 в развитии гладких мышц (Fig. 1). Нокдаун MED28 в NIH3T3 и миобластных C2C12 клетках приводит к активации гладкомышечных генов, тогда как избыточная экспрессия MED28 репрессирует экспрессию этих генов (Beyer et al., 2007). Была постулирована функция репрессии, связанная с головным или CDK8 модулем, но детальный механизм, лежащий в основе этой регуляции, неясен. MED28 был ранее идентифицирован в качестве гена эндотелиальных клеток и был назван endothelial-derived gene EG-1 (Liu et al., 2002). Позднее он был идентифицирован как белок, взаимодействующий с цитоскелетным белком merlin, расположенным под плазматической мембраной, и взаимодействующий с актиновым цитоскелетом (Wiederhold et al., 2004). Эти наблюдения подтвердили, что MED28 может регулировать экспрессию генов гладких мышц посредством цитоплазматической мономерной изоформы, а не как компонент Mediator.

Др. субъединица, участвующая в дифференцировке гладких мышц это MED23. Наши предыдущие находки, что истощение MED23 предупреждает адипогенез (Wang et al., 2009) привели нас к исследованию эффектов истощения MED23 в клетках предшественниках на последующую клеточную судьбу. Результаты этого исследования продемонстрировали, что истощенные по MED23 мезенхимные стволовые клетки обнаруживают склонность к дифференцировке в клетки гладких мышц (Yin et al., 2012). Этого типа 'Yin-Yang' регуляция адипогенеза и дифференцировки гладких мышц с помощью MED23 была исследована на многих типах клеток, таких как MEFs, 10T1/2 клетки и адипоцитарные стволовые клетки (Fig. 1). Наше недавнее исследование продемонстрировало, что MED23 контролирует баланс между передачей сигналов Ras/ELK1 и RhoA/MAL, контролирующими адипогенез и экспрессию генов гладких мышц, соотв., т.е. противоположно направленных двух разных клонов клеток (Yin et al., 2012). Возможное взаимоотношение между MED23 и MED28 в дифференцировке гладких мышц предстоит исследовать.

Mediating chondrogenesis: MED12, MED25 and MED31

Sox9 является транскрипционным активатором специфичных для хряща генов внеклеточного матрикса (Lefebvre and de Crombrugghe, 1998). В качестве такового он играет важную роль в хондрогенезе. Было показано, что MED12 действует как кофактор Sox9 и играет важную роль в черепно-лицевом хондрогенезе и в формировании эндохондральной кости во время развития рыбок данио (Zhou et al., 2002). Недавно, MED25 был обнаружен как ещё одна прямая мишень Sox9, а морфолино вызываемый нокдаун Med25 у рыбок данио приводил к нарушениям нёба, сходными с таковыми, наблюдаемыми у мутантов sox9 (Nakamura et al., 2011). Med31 мутантные мыши обнаруживают формирование нормального паттерна зачатка конечности, но наблюдается задержка хондрогенеза, обусловленная отсутствием экспрессии Col2a1 и Sox9 (Risley et al., 2010). Итак, очевидно, что разные субъединицы Mediator способны функционировать или выше, или ниже ключевого транскрипционного фактора Sox9, чтобы регулировать хондрогенез.

Human diseases related to Mediator function

Многие мутации в субъединицах Mediator оказались ассоциированы с болезнями человека (Table 4). Напр., миссенс мутации R961W и N1007S в MED12, нарушающие взаимодействие между MED12 и транскрипционным репрессором REST, ответственны за синдром FG и синдром Lujan, два Х-сцепленные генетические нарушения, характеризующиеся умственной отсталостью (Ding et al., 2008). Др. мутация связана с нейрологическими нарушениями, это мутация R617Q в MED23, которая совместно сегрегирует с несиндромальной аутосомно рецессивной умственной отсталостью в семьях. Эта мутация специфически нарушает реакцию JUN и FOS непосредственно ранних генов на стимуляцию сывороткой в фибробластах из кожи пациентов (Hashimoto et al., 2011). Список др. исследований нейрологических болезней, связанных с мутациями в субъединицах Mediator представлены в Table 4.

Table 4.
Mutations in Mediator subunits and their related human diseases

Мутации Mediator оказались также ассоциированными с врожденными болезнями сердца. Напр., MED15 делетирована у пациентов с синдромом DiGeorge (Berti et al., 2001), который связан с различными сердечно-сосудистыми аномалиями. MED13L прервана у пациентов с хромосомными транслокациями, вызывающими transposition of the great arteries (TGA) и умственную отсталость, подтверждая, что MED13L участвует в раннем развитии сердца и головного мозга (Muncke et al., 2003).

Изменения в уровне экспрессии Mediator также часто описываются при раке. Напр., MED23 обнаруживают достоверную избыточную экспрессию в клеточных линиях из рака лёгких и в выборках рака лёгких в клинике гиперактивность RAS, тогда как более низкий уровень экспрессии MED23 предсказывает более высокую выживаемость у пациентов с RAS-активным раком лёгких (Yang et al., 2012), подтверждая, что MED23 субъединица может служить в качестве терапевтической мишени, а также в качестве диагностического маркера на RAS-активные раковые опухоли. Интересно, что MED15 экспрессируется на высоком уровне в клинических тканях рака груди, в корреляции с гиперактивной передачей сигналов transforming growth factor β (TGFβ), как показывает SMAD3 фосфорилирование (Zhao et al., 2013). Более того, нехватка MED15 снижает потенциал метастазирования очень агрессивных клеток рака груди за счет ослабления передачи сигналов TGFβ/Smad. Интересно, что гетерозиготная мутация в экзоне 2 гена MED12 описана в 50-70% случаев leiomyomas матки (M?kinen et al., 2011). В целом, разные компоненты Mediator, по-видимому, контролируют разные типы и стадии развития рака посредством разных сигнальных путей.

Conclusions

Mediator is an evolutionarily conserved protein complex with a large surface mediating diverse and dynamic protein-protein interactions. In addition to binding to an array of transcription factors, Mediator interacts with diverse co-factors and complexes as well as lincRNAs. Consequently, in addition to its classic role in establishing the pre-initiation complex, Mediator plays diverse roles at multiple stages of transcription, including elongation, termination, mRNA processing and epigenetic regulation. Mediator functions together with cohesin to establish the super enhancer loop for gene activation, which is important for cell identity. Therefore, Mediator can be considered as a master coordinator, orchestrating diverse developmental signaling and master regulators to specify distinct cell fates. It should be noted that the term 'master coordinator' is different to 'master regulator' in the sense that a master regulator is a driving force for cell lineage development, whereas a master coordinator just assists the master regulator in doing its job. In contrast to master regulators, the overexpression of a master coordinator (e.g. a Mediator subunit) cannot drive cell differentiation. Overall, as a master coordinator, Mediator coordinates transcription and cell lineage specification/development to ensure that the correct genes are expressed at the right time and place and with the necessary intensity and duration.

Our understanding of the molecular and developmental regulation of the Mediator complex has been greatly expanded in recent years. However, many questions remain. For example, what is the exact mechanism by which Mediator coordinates multiple transcription factors and co-factors? How is the dynamic composition and configuration of Mediator regulated in different conditions, cells and tissues? What are the relationships between Mediator and diverse chromosomal modifiers/remodelers? Among the many uncertainties, it is apparent that the identification of new capabilities of Mediator is inevitable.

Although KO mice for several Mediator subunits have been generated, their early or late embryonic lethality has prevented further investigation of the function of these subunits later in development. The detailed analysis of different subunits in development might thus require tissue-, cell type- or stage-specific KO mouse models. Furthermore, combining knock-in mouse models with known disease-related mutations might provide an in-depth understanding of how mutations within particular Mediator components are linked to various diseases.

The Mediator complex: a master coordinator of transcription and cell lineage development Jing-wen Yin and Gang Wang Development (Impact Factor: 6.27). 03/2014; 141(5):977-87. DOI: 10.1242/dev.098392

The Mediator complex: a master coordinator of transcription and cell lineage development
Jing-wen Yin and Gang Wang
Development (Impact Factor: 6.27). 03/2014; 141(5):977-87. DOI: 10.1242/dev.098392