Ген Nodal кодирует члена семейства TGFβ передачи сигналов посредством Smad2/3-зависимого Activin/Nodal пути. Nodal является ключевым фактором во время раннего развития, необходимым для спецификации качественных особенностей клеток в эмбриональном и во внеэмбриональном клонах [1],[2]. Возобновление его экспрессии у взрослых ассоциирует с прогрессированием опухолей, а его сигнальный путь важен для поддержания эмбриональных стволовых клеток (ESCs) человека [3]-[5].

У мышей экспрессия Nodal начинается во внутренней клеточной массе (ICM) у E3.5 бластоцистов [6],[7]. На ст. E4.0, непосредственно перед имплантацией, Nodal обнаруживается в двух тканях, происходящих из ICM: эпибласте, дающим все клоны плода, и первичной энтодерме (PrE), внеэмбриональном слое [6]. Экспрессия Nodal продолжает обнаруживаться и в их постимплантационных производных вплоть до стадии гаструляции, но обнаруживает разную динамику, предзнаменуя становление передне-задней оси и образование первичной полоски [1]. Возобновление экспрессии в узелке на ст. E7.5 и в левой латеральной пластинке мезодермы на ст. E8.0 вносит вклад в установление лево-правосторонней асимметрии [1].

Экспрессия Nodal начинается со ст. E3.5, но самые ранние молекулярные дефекты, характерные для Nodal^-/- эмбрионов обнаруживаются после имплантации. Эпибласт Nodal^-/- эмбрионов дифференцируется преждевременно, а их висцеральная энтодерма, происходящая из PrE, не регионализуется соотв. образом [8]-[10]. Линии плюрипотентных клеток оказываются пригодными моделями in vitro для изучения роли Nodal и передачи сигналов Activin/Nodal во время развития эпибласта. ESCs происходят из формирующегося преимплантационного эпибласта [11]. Они экспрессируют Nodal и обнаруживают активную передачу сигналов Activin/Nodal, но это не существенно для их поддержания [3],[12]. Напротив, стволовые клетки эпибласта (EpiSCs) происходят из постимплантационного эпибласта, а их способность к самообновлению зависит в значительной степени от передачи сигналов Activin/Nodal [13],[14]. Подвергнутые воздействию Activin и FGF, ESCs могут быть превращены в EpiSCs, процесс дифференцировки зависит от передачи сигналов Activin/Nodal и описывается как переход от базового состояния плюрипотентности к состоянию плюрипотентности после первоначальной обработки (primed) [11],[15]. Этот протокол сегодня обычно используется для воспроизведения событий, связанных с созреванием преимплантационного эпибласта в постимплантационный эпибласт.

Некоторые исследования показали, что в ESCs экспрессия Nodal зависит от факторов плюрипотентности или самой передачи сигналов Activin/Nodal [16]-[19]. Известны 4 цис-регуляторных элемента в Nodal. Ни один из них не контролируется факторами плюрипотентности и только один, ASE, зависит от передачи сигналов Activin/Nodal и, как известно, активен пред имплантацией [6],[20],[21]. ASE содержит два функциональных связывающих мотива FoxH1-Smad2,3 и действует как ауторегуляторный элемент, позволяющий Nodal амплифицировать свою собственную экспрессию, особенно в постимплантационном эпибласте [20],[21]. Делеция ASE приводит к фенотипу менее тяжелому, чем у Nodal^-/- эмбрионов и характеризующемуся поздними дефектами формирования паттерна [20], показывая, что ASE не обязателен для инициации экспрессии Nodal. Наш предыдущий анализ профилей экспрессии флуоресцентного репортерного трансгена для ASE показал, что хотя они могли воспроизводить некоторые аспекты экспрессии Nodal на ст. преимплантации, но они не могли объяснить выбор времени начала его активности в ICM и его присутствие в возникающих клетках преимплантационного эпибласта [6]. Это строго указывает на то, что эти специфические аспекты экспрессии Nodal зависят от цис-регуляторных последовательностей, иных, чем ASE.

Мы попытались открыть, как инициируется экспрессия Nodal . Мы идентифицировали новый энхансер для Nodal, который мы назвали HBE, и который соответствует ожидаемому профилю. HBE активируется прежде др. энхансеров Nodal в ICM и в преимплантационном эпибласте и он является господствующим энхансером Nodal в ESCs. Более того, HBE является горячей точкой для связывания факторов плюрипотентности и опосредует воздействие передачи сигналов Oct4, Klf4 и Activin/Nodal экспрессию Nodal. Делеция HBE с помощью гомологичной рекомбинации устраняет экспрессию мутантного аллеля в ESCs и у ранних эмбрионов. Поразительно, он также ослабляет его экспрессию, когда ESCs переходят к дифференцировке, указывая на раннюю потребность в HBE для запуска активации, по крайней мере, ещё одного энхансера, ASE, который управляет экспрессией Nodal в более дифференцированных типах клеток. Мы также установили, что делеция HBE в ESCs приближает этот регион к ASE, накапливающем репрессивную гистоновую метку H3K27me3, демонстрируя, что это осуществляется посредством его участия в рекрутировании модификаторов хроматина, с помощью которых HBE контролирует ASE. Наши находки показывают, как энхансеры регулируются с помощью молекулярного аппарата плюрипотентности, контролируя экспрессию генов и управляя развитием.

Discussion

HBE Is an MTL at the Nodal Locus

Геномные ChIP исследования показали, что в ESCs, факторы плюрипотентности совместно оккупируют геном в специфических локусах, связывающих мультитранскрипционные факторы (MTL), благодаря чему они контролируют плюрипотентное состояние клеток [22],[24]-[26],[44]. Эти исследования привели к мнению, что основные транскрипционные факторы плюрипотентности gene regulatory network (GRN), Oct4, Nanog и Sox2, образуют взаимосвязанную ауторегуляторную петлю, которая позитивно регулирует их собственные промоторы, активируя экспрессию генов, необходимых для поддержания состояния плюрипотентности и для внесения вклада в репрессию генов, способствующих дифференцировке [45]-[47]. Мы идентифицировали HBE в качестве MTL в локусе Nodal. Наши результаты подтвердили, что этот регион является мишенью для молекулярного аппарата (machinery) плюрипотентности и для пути передачи сигналов Activin/Nodal, как предсказывают ChIP исследования [22],[24]-[26],[42].

HBE Enhancer Activity Depends on Pluripotency Factors and Activin/Nodal Signaling

Мы установили, что HBE обладает активностью энхансера в ESCs, как и в случае для всех Oct4/Sox2/Nanog тщательно протестированных MTLs [22],[47]. HBE является фактически единственным активным энхансером Nodal в ESCs. Более того, он активируется рано во время эмбрионального развития мыши. Трансгенные эмбрионы, экспрессирующие YFP под контролем HBE, усиливают активность флюоресцентного маркера в ICM бластоциста на ст. E3.5. Его экспрессия затем ограничивается эмбриональным эпибластом и поддерживается в его эмбриональных и внеэмбриональных производных вплоть до начала органогенеза на ст. E8.5, когда точковая экспрессия Oct4 и плюрипотентность теряются [48].

Мы показали, что энхансерная активность HBE зависит от членов семейств Oct4 и Klf. Фактически Oct4 является главным фактором плюрипотентности, наиболее важным для этой активности. Это согласуется с исследованиями, подтверждающими, что в отличие от др. важных факторов плюрипотентности, Oct4 является сильным активатором транскрипции [49]. Он, по-видимому, функционирует как фактор первооткрыватель для энхансеров, открывающий хроматин и позволяющий др. факторам, таким как pSmad3, получить доступ к своим сайтам связывания [42]. Главный сайт связывания для Oct4 в HBE является единственным из всех предполагаемых сайтов связывания факторов плюрипотентности среди плацентарных млекопитающих, это подтверждает, что HBE возникает вокруг этой специфической последовательности.

Мы также установили, что активность энхансера HBE зависит от передачи сигналов Activin/Nodal и ранее показали, что передача сигналов Activin/Nodal активируется в Nodal^-/- бластоцистах [6]. У др. животных моделей имеются соотв. доказательства для др. члена семейства TGFβ, действующих выше ранней экспрессии Nodal [50]-[54]. Gdf1 и Gdf3, два возможные TGFβ-родственные кандидата у мыши, по-видимому, неспособны активировать путь Smad2/3 при физиологических концентрациях [55]-[57]. Это было подтверждено, когда мы показали, что Gdf3 не может замещать Nodal in vivo [6]. Наилучшим кандидатом на роль лиганда для ранней активации пути Smad2/3 и HBE являются т.о., Activins, которые присутствуют в ICM а также в эпителии яйцеводов и матки перед имплантацией [58]. Поскольку Nodal также был обнаружен, экспрессирующимся в эндометрии у E3.5 беременных самок, нельзя исключить возможность, что Nodal материнского происхождения может быть вовлечен в индукцию экспрессии Nodal у эмбрионов [59].

Nodal Expression Undergoes a Regulatory Shift During Epiblast Maturation

Находка, что начало экспрессии Nodal зависит от GRN плюрипотентности, совпадает с растущими доказательствами, что в контексте эмбриона т. наз. факторы плюрипотентности фактически активно участвуют в осуществлении развития. Nanog, описанный как защитник плюрипотентности в ESCs [37], необходим в предшественниках эпибласта, чтобы способствовать с помощью клеточно неавтономного механизма дифференцировке соседних PrE предшественников [60]. Недавно было также показано, что Oct4 способствует развитию PrE с помощью как клеточно автономного и неавтономного механизмов и в общем способствует развитию эмбриона посредством контроля его множественных метаболических путей [61]. Недавняя работа показала, что передача сигналов Activin/Nodal может быть необходимой в первую очередь в PrE на ст. приблизительно E4.0, чтобы специфицировать субнабор экспрессирующих Lefty1 PrE клеток, производные которых позднее дают дистальную висцеральную энтодерму (DVE), группу клеток, играющих критическую роль во время становления AP полярности [2],[7]. Следовательно, вполне возможно, что HBE-зависимая экспрессия Nodalв бластоцисте вносит вклад в эту инициальную регионализацию. Во время перехода от преимплантационного к постимплантационному эпибласту Nodal подвергается регуляторному сдвигу с HBE-управляемой фазы к ASE-управляемой фазе, это коррелирует с увеличением уровней его экспрессии и усилением активности нижестоящих мишеней, способствующих дифференцировке, также наблюдаемым в EpiSCs [6],[13],[14]. У ESCs, большинство генов, участвующих в клональной спецификации, находятся в устойчивом состоянии, которое характеризуется транскрипционным молчанием, но готовым к активации с помощью онтогенетических сигналов. Это состояние определяется присутствием как активных, так и репрессивных гистоновых меток на промоторах этих генов. Репрессивные метки, вносимые с помощью модификаторов хроматина, рекрутируются локально с помощью Oct4, Sox2 и Nanog [47]. Smad2/3 комплексы, активируемые с помощью пути Activin/Nodal, могут удалять эти репрессивные метки и индуцировать экспрессию нижестоящих мишеней, таких как Gsc и Mixl1. Хотя Nodal экспрессируется в ESCs, Gsc и Mixl1 остаются устойчивыми в этих клетках. Это может быть частично объяснено относительно низким уровнем экспрессии Nodal в ESCs и ко-экспрессией генов, ограничивающих его сигнальную активность, таких как Smad7, Lefty1 и Lefty2. Эти данные подтверждают, что компоненты сигнального пути Activin/Nodal в бластоцистах чётко регулируются, чтобы гарантировать соотв. эмбриональное и внеэмбриональное развитие. Первоначально, активация Nodal с помощью HBE вызывает низкие уровни сигнала, который специфицирует определенные внеэмбриональные предшественники, возможно DVE, тогда как минимизация воздействия и реакция возникающего эпибласта предупреждает его преждевременную дифференцировку. Во время последующих ст. развития вступает в действие ауторегуляторный ASE. Этот сдвиг от HBE-управляемой фазы к ASE-управляемой фазе приводит к амплификации сигнала Nodal, это запускает дифференцировку эпибласта.

Мы установили, что HBE необходим в дифференцирующихся ESCs для активации ASE. Когда HBE делетирован в EpiSCs, то ASE, доминирующий энхансер Nodal в этого типа клетках, оказывается активным. Однако, если делеция HBE происходит в ESCs, до их дифференцировки в EpiSCs, то ASE не управляет экспрессией этого гена. Наши результаты подтвердили, что будучи связанными с HBE, главные факторы плюрипотентности вызывают локальные преобразования хроматина, которые в свою очередь влияют на способность ASE взаимодействовать с соседним промотором и тем самым на уровни экспрессии Nodal. Изменения в комбинации факторов, связанных с HBE, таких, которые участвуют в созревании эпибласта или в переходе от ESC к EpiSC, могут модифицировать эффект HBE на ASE.

Nanog and Oct4 Are Possible Players in the HBE to ASE Transition

Хотя Nodal экспрессируется в ESCs, ауторегуляторный энхансер ASE не активен в этих клетках. Предполагается, что Nanog действует на локус Nodal, чтобы предупреждать активацию ASE. Ранее мы установили, что экспрессия ASE-YFP репортерного трансгена обнаруживается только в клетках эпибласта с низкой или при отсутствии активности Nanog [6]. Это согласуется с результатами подхода с luciferase в ESCs и EpiSCs, которые коррелируют с более высоким уровнем транскрипционной активности ASE и с более низким уровнем Nanog. Истощение Nanog в ESCs приводит к увеличению экспрессии Nodal [19], теперь мы установили, что истощение Nanog или элиминация сайта, связывающего Nanog, не оказывает эффекта на транскрипционную активность HBE. Поскольку Nanog соединяется только с HBE в локусе Nodal в ESCs, он может действовать из этой позиции, чтобы предотвращать активацию ASE. Это д. удерживать экспрессию Nodal, и тем самым передачу сигналов Activin/Nodal, низкой столь долго, пока присутствует Nanog . Снижение его активности во время превращения ESCs в EpiSCs передачу сигналов с помощью разблокированного ASE д. позволить увеличению передачи сигналов Activin/Nodal.

Зависимость активности ASE от HBE может также использовать Oct4, но с ролью, противоположной, что предположена для Nanog. HBE-связанный Oct4 д. способствовать активации ASE. Механизм, описанный для активации сбалансированных генов с помощью сопровождения Trim33-Smad2/3 и Smad4-Smad2/3 комплексов [62], предполагает сходный сценарий для HBE-зависимой активации ASE. Комплекс Oct4-Smad3, связанный с HBE д. инициировать модификации хроматина, которые затем будут спососбствовать взаимодействию ASE с соседним промотором, приводя к транскрипционной активации Nodal с помощью ауторегуляторного элемента и к амплификации сигнала Nodal. Полученные результаты в агрегационных химерах подтвердили, что ASE может быть энхансером не только Nodal, чья активация контролируется с помощью HBE. Отсутствие экспрессии аллеля Nodal^ΔHBE-YFP в проксимальных и задних клетках эпибласта на ст. E6.5, где экспрессия Nodal, как было установлено, не зависит от ASE, но где экспрессируются трансгенные PEE репортеры [6],[20],[63], подтверждает сходное влияние на PEE.

Значение Oct4 в таком механизме разблокирования согласуется с недавним исследованием, показавшим, что способность ESCs дифференцироваться критически зависит от уровня Oct4 , если он не слишком низкий [64]. Такой механизм касается регуляции генов, способствующих дифференцировке иных, чем Nodal. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы протестировать эту гипотезу и достичь лучшего понимания, как связанные с HBE факторы вносят вклад в регуляцию экспрессии Nodal.

В заключение, наши результаты дополняют картину регуляции Nodal на ранних стадиях. Они показывают, что HBE выполняет двойную роль, действуя как энхансер, так и модулятор активности др. регуляторных элементов. Наш анализ этой регуляции и способа действия углубляет наше понимание отличающихся ролей, предполагаемых главных факторов плюрипотентности и сложного способа, с которым молекулярный аппарат плюрипотентности контролирует экспрессию генов (Figure 8). Скорее всего, что сходные механизмы участвуют в регуляции генов, иных чем Nodal. Наши результаты согласуются с мнением, что необходимость контроля передачи сигналов Activin/Nodal является одним из ведущих влияний на эволюцию GRN плюрипотентности.

Figure 8. Model for regulatory shift from HBE to ASE during epiblast maturation. (A) In the late preimplantation epiblast and in ES cells, pluripotency factors (mainly Oct4) and Nodal/Activin signaling activate HBE, which up-regulates Nodal. However, Nanog bound on HBE represses ASE so that expression levels of Nodal remain low. (B) In the postimplantation epiblast and in EpiSCs, changes in the combination of HBE-bound factors allow ASE to take over from HBE as the predominant enhancer drivingNodal expression, and the positive regulatory loop between Nodal and ASE is established, leading to higher expression levels.