PcGs: modulators of chromatin dynamics

У высших организмов ДНК собрана в нуклеосомы, которые являются октамерами, состоящими из двух копий гистоновых белков H2A, H2B, H3 и H4, тем самым образуется хроматин клетки. Конформация хроматина динамична и может быть или открытой (эухроматин) и разрешающей активную транскрипцию или компактной (гетерохроматин) и транскрипционно неактивной 1 and 2. N-терминальные регионы гистонов, обычно обозначаемые как гистоновые хвосты, являются гибкими структурами, которые выставляются из стержня нуклеосомы. Как гистоновые концы, так и ДНК являются предметами модификаций, которые регулируют структуру и динамику хроматина. Хотя ДНК в первую очередь метилируется, гистоновые хвосты подвергаются разнообразным дополнительным пост-трансляционным модификациям, включая ацетилирование, сумоилирование, фосфорилирование и убиквитинирование. Эти изменения в конформации хроматина и пост-трансляционные модификации играют критическую роль в клеточных процессах, включая транскрипцию, репликацию и репарацию, и рекомбинацию ДНК, которые к конечном итоге влияют на физиологию и развитие 1 and 3.

Среди многих факторов, участвующих с регуляции динамики хроматина, Polycomb Group Proteins (PcG) привлекли существенное внимание в последние годы. Описанные первоначально Edward Lewis как регуляторы паттернов генной экспрессии во время развития у Drosophila melanogaster, PcG комплексы оказались семейством репрессоров транскрипции, участвующих в развитии и биологии стволовых клеток 2 and 4. PcGs образуют два многобелковых комплекса, Polycomb repressive complex 1 (PRC1) и PRC2. Хотя PRC2 комплекс млекопитающих формируется тремя белками, SUZ12 (suppressor of zeste 12), EED (embryonic ectoderm development), и EZH2 (enhancer of zeste 2) [5], состав PRC1 комплекса намного сложнее (Figure 1). Растет количество сообщений, показывающих, что множественные PRC1 комплексы существуют 6-10, и это может указывать на различия в функции. Состав PRC1 комплексов диктуется присутствием или отсутствием CBX белков (канонических в противовес не каноническим), добавочных гомологов для компонентов PRC1 и возможно существованием отличающихся доменов, активностей, связывающей способности и/или регуляции (Figure 2). Итак, эти отличающиеся компоненты могут давать крупные и разнообразные количества PRC1 комплексов (180 permutations только для канонических PRC1). Однако, остается неизвестным, действительно ли все эти комплексы функциональны и влияет ли их отличающийся состав на их функциональность. Чтобы увеличить сложность понимания регуляции PcG, белки из комплекса PRC1, как было недавно установлено, участвуют в активации транскрипции, а также в выполнении PRC1-независимых ролей в эмбриональных стволовых клетках (ESC) и в соматических клетках, где функциональный PRC1 комплекс не нужен 11-13.

Figure 1. Components of canonical and non-canonical Polycomb repressive complex 1 (PRC1). There are two main categories of PRC1 complexes. (A) The classical or canonical PRC1 complex, where CBX proteins are the main component. (B) A simplified version of different non-canonical PRC1 complexes that have been described and contain RYBP/YAF2, KDM2B, or E2F6/L3MBTL proteins.

Figure 2. Bases for canonical PRC1 heterogeneity. There are several reasons why many canonical PRC1 complexes exist. (i) Target specificity: PRC1 complexes could be driven to different targets depending on the Cbx protein they contain. (ii) Target redundancy: canonical PRC1 could form multimeric protein complexes generating 3D structures in the genome, which could target several genes at the same time and be responsible for both gene activation and repression. (iii) Different binding affinities: it is known that PRC1 complexes have preferences for different methyl-lysine residues in H3 (blue circles) and different RNA binding affinities. In addition, PRC1 members interact with different affinities between them and several non-PcG partners have been found in some PRC1 complexes. (iv) Different domains/activity: Cbx proteins have different biochemical activities, for example Cbx4 is the only Cbx that is a SUMO E3-ligase (SIM; SUMO-interacting motif, represented as purple circles or boxes). All Cbxs have a chromodomain (light gray box) and a polycomb domain (dark gray box). Sequences correspond to the human protein.

Появляющаяся литература проливает свет на регуляцию PRC1; однако, наше понимание ограничено функциональным значением разнообразия PRC1, проявляющимися ролями PRC1 белков, которые оперируют независимо от PRC1 комплекса, и ролью PRC1 в активации транскрипции. Мы рассмотрим функции канонического и не канонического PRC1 комплекса в критических клеточных процессах, включая старение, самообновление ESC и развитие, и обсудим потенциальную роль PRC1 в прогрессировании рака.

PRC1 complexes: canonical and non-canonical mechanisms

PcG комплексы регулируют экспрессию генов путем замалчивания генов мишеней посредством модуляции структуры хроматина. Считалось, что иерархическая модель PRC2-зависимого убиквитинирования H2AK119 с помощью PRC1 является единственным механизмом, чтобы регулировать гены мишени с помощью PcG комплексов. Однако, недавние доказательства подтвердили, что не канонические PRC1 комплексы также могут играть критическую роль в регуляции репрессии генов.

The canonical PRC1 complex

Канонический PRC1 формируется с помощью 4-х разных ортологов, CBX (polycomb), PCGF (polycomb group factor), HPH (human polyhomeotic homolog) и E3-ligase protein (RING), который катализирует моноубиквитинирование гистона H2A по лизину 119 (H2AK119ub1) 2 and 5. Более того, имеются многочисленные ортологи, приводящие к разным комозициям комплексов PRC1 6, 10, 14 and 15, включая 5 CBX (CBX2, 4, 6, 7, 8), 6 PCGF (PCGF1, 2, 3, 4, 5, 6), 3-х HPH (HPH1, 2, 3) и двух RING белков (RING1, 2) (Figure 1A). Разнообразие PRC1 может возникать благодаря существованию разных доменов или сродства связывания CBX белков, как описывалось ранее 16-18. В самом деле, недавнее исследование, выполненное с помощью очистки тандемного сродства (tandem affinity) CBX белков, сопровождаемой масс-спектрометрией, показало, что CBX белки взаимодействуют с др. PRC1 компонентами с разным сродством. Кроме того, некоторые non-PcG посредники, такие как киназы, которые преимущественно соединяются с разными, CBX-PRC1 комплексами, были идентифицированы (Figure 2) [6]. Более того, CBX белки сами по себе могут располагаться в специфических субклеточных регионах [19], хотя их транскрипция может транскрипционно регулироваться с помощью разных механизмов (Box 1). Предполагается, что существующее разнообразие PRC1 необходимо, чтобы регулировать специфические наборы генов мишеней для достижения функционального разнообразия и становления клеточных характеристик, но необходимы подтверждения этой модели.

Box 1. Regulation of CBX protein expression and function CBX proteins are regulated at the epigenetic, transcriptional, and post-transcriptional levels (Figure I). In an autoregulatory feedback loop, CBX proteins are PcG targets in stem cells and somatic cells. For example, Cbx7 represses its homolog proteins in ESCs and HSCs and, in a negative feedback loop, Cbx2, Cbx4, and Cbx8 repress Cbx7 in differentiated cells 10, 14 and 15. Similarly, in human fibroblasts, CBX6, CBX7, CBX8, RING1/2, and H3K27me3 occupy the promoter regions of their homolog protein genes [12]. In addition, pluripotent factors such as Sox2, Nanog, and Oct4 have been found at the promoter of Cbx7 and are functional activators of Cbx7 in ESCs 10 and 72. MicroRNAs further modify CBX expression. miR-125 and miR-181 families target CBX7, inducing senescence in human fibroblasts and differentiation in ESCs [10]. Other miRs such as miR-26b, miR-210, and miR-424 are implicated in downregulating CBX7 in human mammary epithelial cells and inducing p16INK4a expression levels and senescence. Furthermore, in a regulatory feedback loop, CBX7 and other PcG proteins target these miRs [73]. In addition, several phosphorylation sites have been identified for CBX2 and CBX4, but their functional relevance remains to be determined [74]. However, a phosphorylated residue in mouse Cbx7 (Thr118) was recently identified that responds to MAPK signaling, thereby enhancing the assembly of PRC1 complex and its repression of the INK4a/ARF locus [75]. It will be interesting to determine how other PRC1 proteins are regulated.

Figure I. CBX proteins are regulated at different levels.

Комплекс PRC2, метилирующий H3K27, обычно участвует в замалчивании генов посредством канонического действия рекрутируемого PRC1 на гены мишени. Метка H3K27me3 затем распознается и соединяется с хромодоменом внутри CBX белка в PRC1, убквитинируя тем самым H2AK119 с помощью RING белков. Присутствие и PRC2, и PRC1 в хроматине приводит к компактизации и транскрипционному молчанию генов мишеней 2 and 5.

Хотя PcG белки традиционно описываются как эпигенетические репрессоры, появляются доказательства, подтверждающие более сложный сценарий, в котором PcG белки могут оказывать динамический эффект на экспрессию генов 12,13, 20-24. Иммунопреципитация хроматина, сопровождаемая глубоким секвенированием (ChIP-seq), показала, что разные члены PRC1 и H3K27me3 находят некоторые транскрипционно экспрессирующиеся гены [12]. Сходным образом, ChIP для CBX8 и RNA polymerase II (RNAPII) на HoxA9 локусе в MLL-AF9 трансформированных клетках показали транскрипционную активацию, тогда как истощение CBX8 вызывает репрессию HoxA9 [13]. Более того, CBX4 может действовать как репрессор и активатор в зависимости от внешних стимулов и его статуса метилирования. После стимуляции сывороткой неметилированный CBX4 соединяется с генами мишенями для E2F, как показывает анализ ChIP, и локализуется совместно с транскриптами, связанными с пролиферацией, на транскрипционно активных межхроматиновых гранулах, как показывает анализ иммунофлюоресценции in situ гибридизации (immuno-FISH) [22]. Однако присутствие PRC1 на промоторе активных генов может вовсе не означать, что PcG белки являются активаторами, поскольку PRC1 комплексы могут занимать только один аллель, оставляя возможность транскрипции с др. аллеля, или они могут супрессировать белки репрессоры транскрипции. Не смотря на это, многие линии доказательств подтверждают, что PcG могут в самом деле действовать как активаторы транскрипции. Истощение членов PRC1, в данном случае нокдаун Ring1B короткой шпилечной (sh)RNA, увеличивает количества как подавляемых, так и активируемых генов [23]. Кроме того, ChIP-seq для PRC1 белков показало, что регуляция активных промоторов в неактивных лимфоцитах зависит от связывания Ring1B и активного RNAPII, подтверждая, что Ring1B нуждается в RNAPII, чтобы активировать эти гены [20]. Эта потребность д. подтвердить существование бивалентных генов, как это было обнаружено для ESCs, это облегчает незамедлительную реакцию на внешние стимулы [25]. Более того, PRC1 комплексы участвуют в 3D организации хроматина путем образования хроматиновых петель и предоставления возможности индивидуальным генам оказываться далеко от мишеней для PcG и это может объяснить их двойную роль в транскрипции генов. Кроме того, PRC1 репрессия элементов, замалчивающих транскрипцию, д. приводить к активации генов. Недавнее исследование, осуществленное в отношении ДНК топологии в ходе времени с помощью immuno-FISH анализа Meis2 промотора, энхансера и сайта связывания Ring1B, в присутствии или отсутствии Ring1B, показало, что активация Meis2 посредством взаимодействия его промоторного региона со специфическим энхансером в цис-положении зависит от Ring1B и тканевого контекста [21].

Non-canonical PRC1 complexes

Недавно неканонические PRC1 комплексы, как было установлено, репрессируют транскрипцию независимо от Cbx белков, H3K27me3 и PRC2 в ESC и соматических клетках 7-9. Было идентифицировано несколько групп неканонических PRC1 комплексов, лишенных CBX белков (Figure 1B). В самом деле, в RYBP-PRC1 комплексе, CBX и RYBP белки взаимоисключающие, когда соединяются PRC1, и оба комплекса присутствуют во многих типах клеток. ChIP-seq анализ Cbx7 и Rybp белков показал наличие разных генов мишеней и разных уровней репрессии, как видно по анализу gene ontology (GO) analysis and и уровней экспрессии мРНК 7-9. Кроме того, CBX-PRC1 и RYBP-PRC1 представляют разные активности сжатости хроматина in vitro> при этом RYBP-PRC1 комплексы обнаруживают избирательность мишеней и отличающиеся механизмы рекрутирования в зависимости от PCGF белка, который они содержат [9]. Rybp-PRC1 обеспечивает H2A убиквитинирование независимо от H3K27me3 и существенно для его глобального поддержания в ESC, поскольку истощение Rybp с помощью shRNA снижает H2AK119ub¹ 7-9 независимо от Eed в генах мишенях для PcG [8]. Не смотря на функциональное и физиологическое значение этот комплекс остается неизвестным.

Др. неканонический PRC1 комплекс недавно описан как Kdm2B-PRC1 комплекс. Kdm2B (также известен как Fbxl10) обладает активностью гистоновой деметилазы для H3K36me3 и взаимодействует с PRC1, чтобы рекрутировать комплекс на неметилированные CpG островки. Взаимодействие Kdm2B с PRC1 необходимо для собственно убиквитинирования H2A и молчания генов. В ESCs мыши комплекс Kdm2B-PRC1 прежде всего функционирует, чтобы способствовать самообновлению путем воздействия на ранние клон-специфические гены. Интересно, что многие немотивированные CpG островки, которые оккупируются Kdm2b, обнаруживаются на промоторах активно транскрибируемых генов, указывая что эти комплексы могут действовать как активаторы транскрипции в зависимости от хроматинового окружения и их эффективности по рекуртированию и поддержанию PRC1 в этих местах 26-29. Хотя мало известно относительно рекрутирования неканонического PRC1 на хроматин с помощью транскрипционных факторов, неканонический E2F6-PRC1 комплекс, как полагают, рекрутируется на хроматин посредством соединения с транскрипционными факторами, участвующими в пролиферации клеток, таких как E2F6, Max или Mga. Одним из важных компонентов этого комплекса является L3mbtl2 белок, который регулирует пролиферацию стволовых клеток и важен для развития, поскольку нокаут (KO) у мышей приводит к эмбриональной гибели [30]. Геномное исследование показало корреляцию между E2F6 и L3mbtl2 генами мишенями, подтвердив, что они являются частью одного и того же комплекса [31]. Более того, L3mbtl2 преимущественно соединяется с генами мишенями, не связываемыми каноническими PRC1, подтверждая, что Cbx-PRC1 и E2F6-PRC1 комплексы в основном обладают предпочтительной избирательностью мишеней [30].

Biological functions for canonical and non-canonical PRC1

Большинство появившихся данных по PRC1 комплексу сконцентрировано на составе PRC1 и механизмах рекрутирования на гены мишени. Однако функциональное значение такого разнообразия всё ещё спорно.

Figure 3. Canonical and non-canonical PRC1 regulation. Simplified version of the repression mechanisms of canonical and non-canonical PRC1 in different biological contexts. For canonical PRC1 (cPRC1), the CBX subunit is in orange; for non-canonical PRC1 (ncPRC1) the KDM2 protein is in purple. Red circles represent H3K27me3, which are exclusively recognized by CBX in cPRC1, and burgundy circles represent H2AK119ub1 catalyzed by both cPRC1 and ncPRC1. (A) Cellular senescence. In proliferating cells, canonical and non-canonical PRC1 occupy the INK4b/ARF/INK4a locus, allowing chromatin compaction through H2AK119ub1 and, therefore, repressing p15INK4b, ARF, and p16INK4a expression. During senescence, both PRC1 complexes are displaced from the locus, allowing an open chromatin structure and expression of these proteins, which induces cell cycle arrest and senescence. (B) Cancer. Potential mechanism for PcG regulation in cancer cells. Normal proliferating cells express low levels of tumor-suppressor genes, as depicted by an open chromatin structure, absence of hypermethylation, low H3K27me3 and H2AK119ub1, and few PRC1 complexes that bind to the locus. During cancer development, tumor-suppressor gene promoters become hypermethylated (CpG islands) with increased PRC1 recruitment and silencing of their expression.(C) Cell fate determination. During stem cell self-renewal, lineage determination genes are highly repressed by cPRC1 and ncPRC1. When ESCs are subject to differentiation, cPRC1 composition changes its Cbx protein (shown by the change in filling pattern) leading to differential targeting of lineage-specific genes. Kdm2b proteins have been reported to bind to unmethylated CpG islands (depicted as blue boxes) to promote self-renewal in ESCs.

PRC1 in cellular senescence: the INK4a/ARF locus

Клеточное старение - это состояние, при котором клетка достигает предела пролиферации. С момента первого наблюдения Moorhead and Hayflick в начале 1960s, получено множество информации об активации старения и маркерах, её идентифицирующих [32]. Активация локуса INK4b/ARF/INK4a, кодирующего p15INK4b, ARF и p16INK4a белки соотв., является общеизвестным маркером старения и имеются достоверные доказательства, подтверждающие роль PRC1 в регуляции старения посредством этого локуса (Figure 3A). В само деле, избыточная экспрессия некоторых канонических PRC1 белков, включая CBX белки, вызывает репрессию локуса и обходит старение 33 and 34 путем рекрутирования PRC1 комплексов на хроматин посредством меток хроматина. Эта репрессия зависит от связывающего сродства компонентов PRC1 с гистоновыми метками, поскольку мутации или в Pc box (т.e., CBX7) или в регионах хромодоменов CBX белков (т.e., CBX4, CBX7, CBX8) приводят к преждевременному старению и активации p16INK4a 11, 33-36. Кроме того, re-ChIP анализ выявил связывание некоторых канонических PRC1 комплексов с регионом INK4a, подтверждая, что множественные ассоциации разных PRC1 комплексов могут сосуществовать одновременно в данном локусе. Истощение CBX7 или BMI-1 на этом локусе нарушает CBX8 или Mel18 и vice versa, указывая на взаимную зависимость между разными комплексами для индукции молчания генов [37]. В самом деле истощение канонических PRC1 белков вызывает дерепрессию и активацию INK4b/ARF/INK4a (Figure 3A), и запуск клеточного старения для широкого диапазона человеческих и мышиных первичных клеток 32-37. Эта находка не согласуется с данными по мышиными эмбриональным фибробластам (MEFs), происходящими от Cbx7^-/- мышей, которые избегают старения за счет подавления p16INK4a [38], и эти различия могут быть объяснены изменчивостью культуральных условий для MEF (плотности клеток, концентрации кислорода) и методов приготовления MEF.

Kdm2a/b белки также регулируют старение за счет репрессии INK4b/ARF/INK4a, поскольку эктопическая экспрессия Kdm2a/b иммортализует MEFs, приводя к деметилированию H3K36me3 и избеганию старения 39-41. Напротив, истощение Kdm2a и Kdm2b вызывает дерепрессию и активацию p15^INK4b, вызывая клеточное старение 39-41. Однако, сопровождается ли эта регуляция Kdm2 белков образованием части неканонического PRC1 комплекса, недостаточно изучено.

Помимо регуляции старения путем рекрутирования PRC1 на хроматин посредством хроматиновых меток, PRC1 может также регулировать старение путем рекрутирования на хроматин благодаря его взаимодействия с РНК. Внутри канонического PRC1, CBX белки соединяются с РНК 16 and 36, и среди них CBX7 соединяется с антисмысловой long non-coding RNA (lncRNA) ANRIL, которая рекрутирует PRC1 на локус INK4a/ARF, чтобы репрессировать его транскрипцию и тем самым регулировать старение и пролиферацию клеток рака простаты [36]. CBX4 также соединяется с не кодирующими РНК (ncRNA), такими как TUG1 и MALAT1/NEAT2, позволяя CBX4 сумоилировать регулятор роста E2F1 и способствуя пролиферации клеток [22]. Не удивительно, что РНК-связывающие белки были также найдены в очищенных CBX комплексах. Напр., РНК геликаза MOV10 найдена в CBX7 комплексах фибробластов человека. MOV10 ассоциирует с хроматином и др. членами PRC1 и участвует в молчании p16. На механистическом ровне взаимодействие CBX7-MOV10 не зависит от связывания РНК, поскольку воздействие RNase не влияет на комплекс [42]. Нет данных, показывающих, соединяются ли также неканонические PRC1 с РНК, но было бы интересно, если бы это свойство относилось бы только к CBX белкам, принимая во внимание, что канонические PRC1 обладают отличным механизмом рекрутирования генов мишеней. Однако, Rybp рекрутируется на неактивную X (Xi) вовремя инактивации X хромосомы [8], возможно за счет соединения с Xist ncRNA, которая (as discussed later) является основной lncRNA, участвующей в молчании Х хромосомы, подтверждая тем самым, что компоненты неканонических PRC1 также могут рекрутироваться на хроматин посредством РНК.

Недавно был подтвержден дополнительный механизм для рекрутирования канонических PRC1 на локус INK4a/ARF и регуляции старения, который оперирует путем своего взаимодействия с разными транскрипционными факторами [43]. В самом деле, транскрипционный фактор Twist регулирует BMI1, чтобы репрессировать экспрессию INK4a и E-cadherin, чтобы способствовать Twist-индуцируемому эпителиально-мезенхимному переходу [44]. Кроме того, белок цинковые пальчики Zfp277 рекрутирует BMI1 на локус INK4a/ARF, регулируя тем самым старение и способствуя пролиферации. Курьёзно, но оксидативный стресс снижает экспрессию Zfp277 и вызывает диссоциацию PRC1 от локуса INK4a/ARF и индукцию старения [45]. Многие др. транскрипционные факторы также могут участвовать в рекрутировании PRC1 локус INK4a/ARF в зависимости от тканевой специфичности [43]. Однако, большинство поисков базируется на рекрутировании PRC2 на INK4a/ARF, при этом транскрипционные факторы, участвующие в формировании онтогенетического паттерна, такие как HLX1 и HOXA9, могут способствовать тканеспецифичному молчанию p16 [46].

PRC1 regulation in cancer

Многие исследования недавно выявили разные роли для PRC1 комплексов в прогрессировании рака, в зависимости или от их состава или нарушения регуляции, и подтвердили, что они могут действовать как опухолевые супрессоры и онкогены за счет разных механизмов, включая PcG-независимые механизмы (т.e., CBX8 [13]), различия в генах мишенях (т.e., CBX7 34, 47 and 48), или изменения в опухолевом микроокружении (stroma). Эта 'двойственность личности' была найдена как для канонического, так и неканонического PRC1.

PRC1 может способствовать прогрессированию рака путем репрессии опухолевых супрессоров (Figure 3B). Многие исследования установили, что белки канонических PRC1 способствуют туморогенезу путем репрессии INK4a/ARF и, следовательно, ингибирования старения 35, 44, 48-50. В самом деле CBX7 вместе с lncRNA ANRIL экспрессируются на высоком уровне в опухолях простаты и это коррелирует с прогрессированием рака и репрессией INK4a/ARF [36]. Эта находка контрастирует с др. сообщениями, где уровни CBX7 были достоверно снижены при раке и это коррелировало с плохим прогнозом независимо от репрессии INK4a/ARF 47 and 51. В самом деле, Cbx7^-/- мыши обнаруживают высокие частоты карцином легких и печени [38]. Хотя PRC1 участвует в качестве репрессора супрессоров опухолей, скорее всего, существуют дополнительные механизмы, зависящие от факторов, обеспечивающих предпочтительное связывание мишеней, напр., INK4a/ARF или E-cadherin генов 36 and 47, или от нарушения путей, активирующих старение, таких как p16INK4a/Rb [51] или p53 [52]. Фактически, Ring1a/b белки, как было установлено, регулируют пролиферацию и трансформацию независимо от INK4a/ARF в опухолевых клетках путем регуляции репликации ДНК [52].

Более того, канонические PRC1 комплексы могут действовать или как опухолевый супрессор или онкоген в разных клеточных контекстах. В недавнем исследовании способность разных компонентов канонических PRC1 индуцировать лейкемию in vivo сравнивалась в экспериментах по трансплантации. Было установлено, что гематопоэтические и клетки предшественники обнаруживают избыточную экспрессию Cbx7 при индуцированной лейкемии, в отличие от его эквивалентов Cbx белков [14]. Однако потенциальный вклад Cbx в возникновение лейкемии может зависеть от многих факторов, таких как опухоль-инициирующие клетки или тип гематологической опухоли. Напр., MLL-индуцируемый генез лейкемии зависит от функциональности CBX8, но не от его ортологов, хотя недавние исследования genome-wide association study (GWAS) идентифицировали только CBX7 в качестве локуса повышенного риска для развития множественных миелом [53]. Кроме того, Cbx8 ^-/- мыши не обнаруживают онкогенных свойств и не обнаруживают дефектов гематопоэза, подтверждая, что он может быть потенциальной терапевтической мишенью при возникновении лейкемии 13 and 54. CBX8 соединяется с белками слияния MLL независимо от др. членов канонических PRC1, подтверждая существование независимых от PRC1 механизмов, которые согласно др. сообщению обнаруживают BMI1-независимый MLL-AF9-индуцированный генез лимфом [55]. Кроме того, CBX4-PRC1 оказался сцепленным с гепатоцеллюлярной карциномой in vitro и in vivo в противовес др. Cbx белкам, и способствует опухолевому ангиогенезу за счет усиления транскрипционной активности hypoxia-induced factor 1 (HIF-1α) за счет активности своей E3-лигазы и независимо от функциональности хромодомена, подтверждая PRC1-независимые механизмы 11 and 56.

Сходным образом, KDM2 белки участвуют в прогрессировании раковых опухолей, в основном способствуя туморогенезу; однако их изоформы играют самостоятельные роли в разных клеточных контекстах. Напр., избыточная экспрессия Kdm2b способствует и поддерживает развитие лейкемии у мышей с помощью трансформации гематопоэтических клеток предшественников. Kdm2b репрессирует p15INK4b посредством своей H3K36me3 деметилазной активности, усиливая тем самым клеточную пролиферацию и трансформацию [57]. В карциномах мочевого пузыря также, как и в происходящих из него клеточных линиях, Kdm2b репрессирует miR-101, приводя к усилению активности своих генов мишеней, включая EZH2, который способствует миграции, ангиогенезу и пролиферации [58]. Напротив, KDM2A обнаруживает повышенную активность в non-small cell lung cancer (NSCLC) и в клеточных линиях и способствует пролиферации посредством деметилирования локусов, кодирующих histone deacetylase 3 (HDAC3) и DUSP3 фосфатазу, которые являются мишенями ERK1/2 митогеном активируемой протеин киназы. Кроме того, нокдаун Kdm2a устраняет пролиферацию и инвазию NSCLC в мышиные ксенотрансплантанты 59 and 60.

Канонический PRC1 комплекс и KDM2A/B белки играют ключевые роли в поддержании клеточного гомеостаза, поскольку нарушение регуляции их членов вызывает несбалансированную пролиферацию, которая зависит от клеточного окружения, и может индуцировать опухоль супрессирующую или онкогенную активность. Однако, как они осуществляют эту про-и антионкогенную активность и зависят ли KDM2 белки от функциональности PRC1 комплекса, неизвестно.

PRC1 in cell fate determination

Динамические изменения состава канонических PRC1, как было установлено, обнаруживаются в ESCs и гематопоэтических стволовых клетках (HSC), где Cbx белки управляют балансом между самообновлением и дифференцировкой. Прежде всего Cbx, участвующий в самообновлении ESCs и HSCs, это Cbx7, который замещается с помощью своих партнеров Cbx2, Cbx4 и Cbx8 во время детерминации клонов. В самом деле, уровни Cbx7 снижены как в ESCs, так и в HSCs во время дифференцировки, этому сопутствует увеличение n Cbx2, Cbx4 и Cbx8 10, 14 and 15. Хотя избыточная экспрессия Cbx7 усиливает плюрипотентность, его эффект на самообновление, когда он истощен действует противоположным образом, некоторые сообщения подтверждают, что истощение Cbx7 дерепрессирует гены мишени и мешает самообновлению [10], тогда как др. не выявили различий в плюрипотентности [15]. Не смотря на это, было установлено, что разные канонические PRC1 комплексы обнаруживают избирательность мишеней, при этом Cbx7 репрессирует гены дифференцировки, чтобы поддерживать плюрипотентность, а Cbx2, Cbx4 и Cbx8 репрессируют гены плюрипотентности, чтобы поспособствовать дифференцировке и детерминации клонов (Figure 3C). В самом деле, канонические PRC1 комплексы были описаны, как обладающие предпочтительными физиологическими функциями, в зависимости от их Cbx белка. Напр., Cbx4 является главным Cbx, участвующим в поддержании эпидермальных стволовых клеток (epSC) в недифференцированном состоянии и в состоянии медленных делений, в противовес др. Cbx белкам [11], и является важным для поддержания состояния покоя эпителия тимуса [61]. Более того, Cbx2 является главным Cbx белком, участвующим в развитии гонад 62 and 63. Однако выбор мишеней, по-видимому, не единственный ответ относительно разнообразия PRC1, поскольку ChIP-seq профили для Cbx2 и Cbx4 обнаруживают высокое сходство в эмбриоидных телах, где оба Cbx белка присутствуют в больших количествах на общих генах мишенях [15]. Итак, эти данные показывают, что канонические PRC1 обладают как отличающимися, так и общими ролями, при которых имеет место некоторая компенсация гомологами (т.e., KO мыши по Cbx белкам жизнеспособны, указывая, что др. Cbx белки могут компенсировать дефицит и способствовать жизнеспосбности) помимо функциональной специализации.

Недавно идентифицирована роль неканонических Kdm2b-PRC1 комплексов в биологии стволовых клеток. Геномные исследования наблюдали, что истощение Kdm2b вызывает сопутствующее снижение Ring1B и H2AK119ub¹ в специфических геномных регионах, но не снижение рекрутирования PRC2 26-29. Kdm2b экспрессируется на высоком уровне в ESCs, и подавляется после дифференцировки. В самом деле, Kdm2b усиливает репрограммирование, что удивительно, не посредством нормальной деметилазной активности, посредством его неметилированного мотива распознавания CpG (ZF-CxxC) [64]. Истощение Kdm2b индуцирует дифференцировку ESC благодаря дерепрессии клон-специфичных генов, при незначительном эффекте на факторы плюрипотентности. Истощение др. неканонических членов PRC1 также затрагивает дифференцировку, поскольку нокдаун Rybp и L3mtbl2 в ESCs мешает формированию эмбриоидных тел, возможно благодаря вмешательству в в клеточную пролиферацию и в H2AK119ub¹ 7-9 and 30.

PcG белки в основном участвуют в молчании генов, включая инактивацию Х хромосомы (Xi). Xi это транскрипционное молчание только одной из двух Х хромосом у самок, чтобы устранить экспрессию удвоенных генов во время раннего развития 65 and 66. Cbx2, Cbx6, Cbx7 и Cbx8 располагаются на Xi во время дифференцировки, а избыточная экспрессия Cbx7 вызывает увеличение lncRNA Xist, главного эффектора Xi 10 and 67. Единственный неканонический PRC1, участвующий в молчании Xist-RNA, это Rybp-PRC1, но его роль вовремя Xi или рекрутирования, остается неизвестной [8].

PRC1 in development

PcG белки выполняют важные роли в развитии мыши, поскольку KO мыши, нокаутные по компонентам PRC2, являются эмбриональными леталями на ст. гаструляции 5 and 68, и это д. объясниться с помощью отсутствия перекрывающих ортологов PRC2. Напротив, большинство канонических PRC1 белков, за исключением Ring1b [69], не важны для эмбрионального развития, но всё же дефицитные мыши обнаруживают дефекты развития (Table 1). Среди Cbx белков, Cbx2-/- мыши обнаруживают наиболее тяжелый фенотип, при котором мыши самцы обладают гонадами самок, а самки мыши имеют небольшие или не имеют яичники [62]. Сходным образом, пациентки женщины, гетерозиготные по двум мутациям в гене CBX2 обнаруживают присутствие мужского кариотипа [70]. Более того, неканонический PRC1, по-видимому, важен для развития, поскольку Rybp^-/- и L3mbtl2^-/- мыши нежизнеспособны благодаря дефектам в гаструляции и раннем эмбриогенезе 30 and 71.

Table 1. Knockout mice for canonical and non-canonical proteins Canonical PRC1 (Cbx proteins) (см. оригинал статьи

Concluding remarks and future directions

Over recent years data have emerged proposing different functional specialization for PRC1 composition, categorizing PRC1 into canonical and non-canonical, where the canonical PRC1 has both specific and common targets. However, the functional relevance for the existence of PRC1 diversity is not well understood. The fact that Cbx KO mice vary in phenotype, from embryonic lethality to minor developmental defects, could indicate functional compensation by redundant orthologs to promote survival in addition to functional specialization for specific roles such as gonadal development. In addition, redundancy could be dictated by higher-order structures, such as polycomb bodies, as suggested by the presence of several canonical PRC1 complexes simultaneously at the same targets. However, this could also reflect heterogeneity due to cells being in different phases of the cell cycle. Nevertheless, it would be interesting to determine what effect these multimeric PRC1 complexes have on PRC1 function and if these higher-order structures exist in other cell types such as cancer cells.

A new emerging field for PRC1 regulation is the role of PRC1 as an activator of gene expression, but how this property is exerted remains unknown. It could be that PcGs are present at bivalent genes, as in ESCs, and are subject to environmental signals dictating their activity as repressors or activators, as found for CBX4 upon serum stimulation. In addition, a fine balance between PcG repressors and Trithorax group (TrxG) activators might play a dynamic role in gene regulation by promoting either transcriptional activation or repression. Furthermore, the existence of 3D structures might bring enhancers and repressors together to the same PcG complexes, allowing dual activation and repression depending on the target genes.

Further emerging functions for canonical and non-canonical PRC1 protein regulation include novel roles in regulating gene expression independently of PRC1 complexes, which could be exerted by individual proteins because of aberrant expression levels that occur in particular environments, such as cancer or senescence, or due to these proteins forming complexes different from PRC1.

Current research on polycomb regulation is mainly performed in vitro, which could lead to inadequate information. In particular, many studies have analyzed the effect of overexpression or activity of individual PRC1 components on gene repression, but with little evidence regarding whether these effects are determined as part of a canonical or non-canonical PRC1 complex. Further genetic and biochemical studies to determine how PRC1 functions differ or complement one another would be of interest, in particular if performed at a single cell level or in different tissues.

Although much has been learned regarding the diversity of PRC1 complexes, future studies should focus on why there are so many PRC1 complexes and, most importantly, how this diversity affects their function and the mechanisms by which they confer gene activation (Box 2). The global picture for chromatin dynamics is still far from complete as additional roles and proteins forming part of these complexes emerge.

PRC1 complex diversity: where is it taking us? Jes?s Gil, Ana O'Loghlen Trends in Cell Biol. Volume 24, Issue 11, November 2014, Pages 632-641

PRC1 complex diversity: where is it taking us?
Jes?s Gil, Ana O'Loghlen
Trends in Cell Biol. Volume 24, Issue 11, November 2014, Pages 632-641