Cardiolipins (CL's) представляют собой CL's асс фосфолипидов, которые играют разнообразные и важные роли в митохондриях.^1-3 Учитывая, что митохондрии играют важнейшую роль в эмбриогенезе и органогенезе, можно ожидать, что CL's , которые являются так называемыми "фирменными" фосфолипидами митохондрий, также будут играть важную роль в этих процессах развития.

В настоящее время мы очень мало знаем о роли митохондриальных фосфолипидов в процессах развития, поэтому CL может служить наглядной моделью. Здесь мы рассмотрим биологию CL's и доказательства роли CL's в процессе развития организма, включая эмбриогенез и созревание клеток. Затем мы обсудим роль CL в эмбриогенезе в более широком контексте роли митохондрий в развитии, чтобы сделать дополнительные выводы. Мы сосредоточимся на развитии после гаструляции, которое включает клеточную дифференциацию и органогенез. В дополнение к исследованиям в клеточных модельных системах мы установим, что CL играет определенную роль в развитии позвоночных, а затем изложим доказательства возможных механизмов, лежащих в основе этого процесса.

То, что можно назвать "биологией липидов развития", является малоизученной областью исследований, учитывая важность липидов в многочисленных клеточных процессах и функциях. Являясь основным компонентом клеточных мембран и играя важную роль в хранении энергии, клеточной сигнализации и транспорте, липиды также играют фундаментальную роль в развитии, включая пре-имплантационное развитие эмбриона млекопитающих и судьбу клеток. Мы знаем, что липидные метаболиты влияют на клеточные события, включая дифференцировку, пролиферацию, миграцию и органогенез.^4-7 Наследственные нарушения липидного обмена в настоящее время включают почти 150 менделевских заболеваний, из которых более 80 связаны со сложным биосинтезом и ремоделированием липидов⁷; многие из них можно считать нарушениями развития с плейотропным влиянием на многочисленные системы органов у новорожденных, например, синдром Barth (см. ниже) и синдром MEGDEL.

Фосфолипиды - это "сложные липиды", состоящие из двух хвостов жирных кислот и фосфатсодержащей головной группы, соединенных молекулой глицерина.⁷ Они имеют решающее значение не только для структуры и функции мембран, но и для взаимодействия белков, в том числе в митохондриях,⁸ клеточной сигнализации, аутофагии, делении клеток и окислительном фосфорилировании (OXPHOS).⁷ Нарушение биосинтеза фосфолипидов может привести к тяжелым последствиям для развития.⁹

CL's представляет собой димерный фосфолипид, дифосфатидилглицерин (1,3-бис[sn-3?-фосфатидил]-sn-глицерин) (рис. 1).^{2, 3, 10} Среди разнообразных и важных ролей в функционировании и морфологии митохондрий, CL's особенно важны для митохондриальной OXPHOS через сборку комплексов олигомеров высокого порядка дыхательной цепи.^11-15. Менее известна, но не менее важна роль CL в стабилизации латеральной организации богатых белками мембран и в динамике митохондрий.^{16, 17} Биосинтез CL начинается из фосфатидной кислоты, а зарождающийся CL образуется из phosphatidylglycerol (PG) с помощью кардиолипинсинтазы (CRLS1) на стороне внутренней митохондриальной мембраны, обращенной к матриксу. Затем зарождающийся CL подвергается пост-синтетическому обмену ацильных групп, также известному как ремоделирование (рис. 2). Катализируемый трансацилазой tafazzin, CL ремоделируется посредством обмена ацильными группами между фосфолипидами и монолизокардиолипином до становления своей зрелой формы, находящейся во внутренней мембране митохондрий.³⁰ Другие ацилтрансферазы - MLCLAT1 и ALCAT1 - также могут участвовать в ремоделировании CL.^{23, 27} Чаще всего ремоделированный (зрелый) кардиолипин содержит большее количество ненасыщенных ацильных цепей, но заметным исключением является вне-митохондриальный кардиолипин, тетраPAльмитоил кардиолипин.³¹ Следует отметить, что tafazzin не обладает обычной ферментной специфичностью; вместо этого тафаззин полагается на окружающую мембрану биофизическую среду (например, кривизну мембраны и плотность мембранных белков), чтобы ремоделировать зарождающийся CL во множество различных возможных "зрелых" видов CL.³⁰ Поэтому важно подчеркнуть, что CL не является одной молекулой: ремоделирование его ацильных цепей приводит к огромному разнообразию комбинаций ацильных цепей и, следовательно, к множеству возможных видов CL (рис. 1). Отдельные виды CL вместе образуют жидкость с характерными физическими свойствами, различия которых могут быть необходимы в различных клеточных средах.^{32, 33} Специфические профили видов CL зависят от ткани и вида, и, как мы покажем, даже от стадии развития.

FIGURE 1 Cardiolipin structure, an overview. (A) The schematic shows the key features of cardiolipin: A glycerol backbone and two phosphatidyl moieties that together form the dimeric phosphatidylglycerol head group; and 4 acyl chains (designated R1-R4). (B) Each of the four acyl chains may vary by length, degrees of saturation, and positions of double bonds, resulting in an enormous possible diversity of acyl chain combinations. (C) The most abundant form of cardiolipin in the mammalian heart is tetralinoleoyl cardiolipin (CL), in which the four acyl chains are linoleic acid. (D) Tetralinoleoyl CL has a unique conical shape that is critical to its biophysical properties within the lipid membrane.

FIGURE 2 Cardiolipin biosynthetic and remodeling pathways.

Cardiolipin synthesis: Фосфатидная кислота (PA) является центральным предшественником для биосинтеза глицеролипидов и глицерофосфолипидов. PA транспортируется Prelid1-Triap1 от мембран эндоплазматического ретикулума (ER) к inner mitochondrial membrane (IMM), где последовательные реакции приводят к биосинтезу кардиолипина (CL). Первая реакция катализируется ТАММ41, в результате которой PA превращается в цитидиндифосфат-диацилглицерол (CDPDG). Затем фермент PGS1 переносит фосфатидиловую группу с CDPDG на глицерол-3-фосфат с образованием фосфатидилглицерофосфата (PGP). Третья реакция катализируетс ферментом PTPMT1, который удаляет терминальную фосфатную группу из PGP с образованием фосфатидилглицерола (PG). Четвертая и последняя реакция биосинтеза CL катализируется кардиолипин-синтазой (CRLS1), которая фактически использует два фосфолипидных субстрата, PG и CDPDG, для образования так называемого "зарождающегося" CL (CL_n).

Cardiolipin remodeling: После синтеза зарождающийся CL подвергается процессу, известному как ремоделирование, приобретая новый набор жирных кислот (ацильных цепей). Зарождающийся CL сначала деацилируется до монолизокардиолипина (MLCL); у дрожжей фермент был идентифицирован как CLD1, хотя у млекопитающих кальций-независимая фосфолипаза A2 (iPLA2), отвечающая за этот шаг, окончательно не идентифицирована.^{18, 19} Тафаззин является наиболее известным и хорошо изученным ферментом ремоделирования, трансацилазой, которая переносит ацильную цепь на MLCL с донорского липида, образуя "зрелый" CL (CL^m); наиболее преобладающим видом зрелого CL в сердце млекопитающих является тетралинолеоил кардиолипин (TLCL). По последним данным, тафаззин локализован на внутренней стороне (matrix ) митохондриальной мембраны,²⁰ хотя предыдущие эксперименты указывали на локализацию в межмембранном пространстве (IMS), обращенном к створкам IMM.^{21, 22} Двумя дополнительными предполагаемыми matrix ферментами ремоделирования являются ALCAT1 и MLCLAT1, обе ацил-КоА-зависимые ацилтрансферазы лизокардиолипина. ALCAT1 была локализована в ER, а именно в пространстве митохондриально-ассоциированной мембраны (МАМ) - контактном участке между ER и митохондрией, где происходит обмен липидами. ALCAT1 катализирует ацилирование лизокардиолипина обратно в CL in vitro,²³ но также были вовлечены в производство "аномального" CL (CL_abnormal) при дефиците TLCL in vivo (обзор см. в Zhang and Shi24); кроме того, основная роль этого фермента - ремоделирование фосфоинозитола, а не CL in vivo.^{25, 26}. Таким образом, физиологическая роль ALCAT1 в ремоделировании CL in vivo остается неясной. MLCLAT1 был впервые идентифицирована для участия в ацилировании MLCL в CL,²⁷ и оказалась идентичной α-субъединице трифункционального белка (αTFP, также известного как HADHA) без первого N-концевого 191 остатка²⁸; MLCLAT1 может быть сплайс-вариантом трифункционального белка, который сам играет ключевую роль в бета-окислении жирных кислот.^{28, 29} Последние данные свидетельствуют о том, что HADHA не ремоделирует MLCL в сколько-нибудь значительной степени.²⁹ Таким образом, остаются вопросы о точной роли MLCLAT1 в ремоделировании CL. Представленный путь относится к млекопитающим, но он также хорошо изучен у дрожжей, у которых наблюдаются небольшие различия, а также немного другие обозначения. Для целей данного обзора показаны ферменты млекопитающих. Обозначения к рис.: αTFP, α -субъединица митохондриального трехфункционального белка; ALCAT1, ацил-КоА: лизокардиолипиновая ацилтрансфераза 1; CDPDG, CDP-диацилглицерол; CL_abnormal, "аномальный" кардиолипин; CL_m, зрелый (ремоделированный) кардиолипин; CL_n, зарождающийся (не ремоделированный) кардиолипин; CLD1/iPLA2, кардиолипин-специфическая деацилаза/кальций-независимая фосфолипаза A2; CRLS1, кардиолипин-синтаза; ER, эндоплазматический ретикулум; IMM, внутренняя митохондриальная мембрана; IMS, межмембранное пространство; MAM, митохондриально-ассоциированная мембрана (эндоплазматического ретикулума); MLCL, монолизокардиолипин; MLCLAT1, монолизокардиолипин ацилтрансфераза 1; OMM, наружная митохондриальная мембрана; PA, фосфатидная кислота; PG, фосфатидилглицерин; PLA2, фосфолиPAза A2; PGP, фосфатидилглицерофосфат; PTPMT1, протеин-тирозин-фосфатаза митохондриальная 1; TAMM41, гомолог сборки и поддержания митохондриального транслокатора TAM41 (фосфатидатцитидилилтрансфераза, митохондриальная); TLCL, тетралинолеоил кардиолипин. (Создано с помощью BioRender.com).

Биохимические профили фосфолипидов, включая виды и профили CL, изменяются в ходе нормального развития. В этом обзоре мы рассматриваем не только "развитие" метазоа (например, органогенез), но и текущее созревание, например, происходящее в ранний постнатальный период у млекопитающих. Как недавно рассмотрели Alvarez-Dominguez and Melton³⁴ , то, как специализированные клетки "созревают", важно для клеточной биологии и биологии развития, и это следует рассматривать как динамический континуум адаптивных фенотипических изменений, которые включают форму, генную схему, взаимосвязь и функцию, ритмы и пролиферацию. Изменения в этой траектории развития и созревания потенциально могут привести к аномалиям развития. Хотя профили CL продолжают созревать даже во время раннего постнатального развития³⁵.

В исследовании нормального развития миокарда у эмбрионов цыплят было отмечено зависимое от стадии увеличение уровня CL, а также плазмалогенов phosphatidylethanolamine (PE) и phosphatidylcholine (PC); однако CL присутствовал в мембранах желточного мешка лишь в незначительных количествах, что свидетельствует о тканеспецифичности его распределения³⁶. Помимо собственно эмбриона, желточный мешок у позвоночных животных играет важную роль в кроветворении, развитии половых клеток и обеспечении питанием.³⁷ Meng et al. изучали липидомику желточного мешка цыплят во время эмбриогенеза и определили ряд изменений как в количестве, так и в составе CL.³⁷ Однако неясно, могли ли изменения в количестве CL быть просто связаны с изменениями в количестве митохондрий. Более того, "желточный мешок" в этом исследовании включал в себя мембрану желточного мешка, а также содержимое желточного мешка, поэтому трудно сделать какие-либо выводы о CL в самом эмбрионе. Тем не менее, оба исследования свидетельствуют о временной и тканевой специфичности изменений CL во время развития позвоночных.

Chen et al. недавно опубликовали количественные липидометрические данные о профилях CL в сердце мыши на разных стадиях, во время эмбрионального развития и взрослого состояния.³⁸ Они обнаружили, что CL в эмбриональном сердце имеет более разнообразный состав ацильных цепей, в то время как преобладающей формой CL во взрослом сердце является тетралинолеоил CL. CL, монолизокардиолипин (MLCL) и дилизокардиолипин (DLCL) демонстрировали незначительные изменения между эмбриональными днями (E)11.5 и E15.5, но кардинальные изменения по сравнению с 2- и 10-месячными постнатальными взрослыми мышами. Исследователи предположили, что пути, участвующие в биосинтезе и метаболизме CL, могут иметь различные функции между эмбриональными и взрослыми сердцами.³⁸ Однако мы считаем более вероятным, что функция путей остается той же, а именно синтез и деградация CL, но требуются различные составы CL из-за функциональных различий между эмбриональными митохондриями и митохондриями взрослых.

Cheng et al. изучили потенциальную роль временных изменений содержания CL и/или его молекулярного состава в процессе развития мозга млекопитающих.³⁹ В перинатальный период у млекопитающих происходит активное ремоделирование нейронов в коре головного мозга путем апоптоза. Исследователи впервые использовали метод дробной липидомики для анализа липидных экстрактов из коры мыши, а также из мозга человека, кролика и крысы; они выявили весьма разнообразный профиль молекулярных видов клу всех исследованных млекопитающих. Было установлено, что общий уровень CL в коре головного мозга мыши значительно увеличивается во время внутриутробного развития, транзиторно снижается при рождении, а затем увеличивается в постнатальный период. Чтобы определить механизмы, лежащие в основе диверсификации профиля CL, а также временных вариаций содержания CL, исследователи также проанализировали уровни экспрессии мРНК, кодирующих CRLS1, фосфолипазы A2 и тафаззин. Они обнаружили, что все эти ферменты, критически важные для биосинтеза и ремоделирования CL, обильно экспрессируются в эмбриональном периоде, а изменения в уровнях экспрессии их мРНК параллельны возрастным изменениям в составе CL. Наконец, они продемонстрировали, что профиль CL остается высоко диверсифицированным на протяжении всей взрослой жизни, но отличается от того, который присутствовал во время эмбрионального развития. Их результаты позволяют предположить, что изменения в профиле CL в перинатальном периоде временно коррелируют с изменениями в ремоделировании нейронов и апоптозе, которые происходят сразу после рождения³⁹.

В другом исследовании Keilhoff et al. изучали роль CL в дифференцировке нейронов с помощью модельной клеточной линии NSC-34.⁴⁰ клетки NSC-34 получают путем слияния клеток нейробластомы и первичных двигательных нейронов спинного мозга. Исследователи продемонстрировали корреляцию между содержанием различных видов CL и статусом дифференцировки клеток NSC-34. Фактически, манипуляции с составом CL путем добавления жирных кислот стимулировали дифференцировку клеток NSC-34, что позволяет предположить связь между CL и нормальной дифференцировкой клеток нейронов.⁴⁰ Однако следует отметить, что добавление жирных кислот изменяет жирнокислотный состав всех липидов, а не только CL, и, следовательно, имеет множество других эффектов, которые необходимо исследовать для выявления специфической роли CL. Тем не менее, мы увидим, что потенциальная роль CL в клеточной дифференциации будет постоянной темой.

Наши знания о траекториях развития CL's и, в частности, о роли tafazzin в биологии развития,⁴¹ далеко не полны, но есть четкие доказательства динамических изменений в экспрессии генов ферментов биосинтеза кардиолипина на протяжении развития и в различных тканях (рис. 3). Остается открытым вопрос о том, зависят ли изменения количества CL's от массы митохондрий или являются полностью независимыми. Тем не менее, ограниченные имеющиеся данные указывают на то, что CL изменяется в ходе развития, как по количеству, так и по составу ацильных цепей и разнообразию видов (Рисунок 4). Профили CL также тканеспецифичны. В моделях позвоночных и млекопитающих пренатальные профили CL резко отличаются от зрелого, взрослого организма. Эти траектории развития убедительно свидетельствуют о важной и, возможно, меняющейся роли CL на протяжении всего развития.



FIGURE 3 Gene expression profiles across developmental stages for human cardiolipin synthase and tafazzin. (https://apps.kaessmannlab.org/evodevoapp/, accessed February 24, 2022). Panel (A) shows data for cardiolipin synthase (CRLS1). Panel (B) shows data for tafazzin (TAZ, now known as TAFAZZIN). The human developmental stages include 4?weeks postconception through adulthood. Panels (A) and (B) illustrate key features of these two key enzymes in the cardiolipin biosynthetic pathway: Gene expression profiles that are both stage- and tissue-dependent. (C) The developmental changes in CRLS1 expression in the human heart are enlarged in panel (C), to illustrate more clearly the time scale during prenatal development and postnatal maturation. Major developmental milestones are shown: Cardiogenesis, prenatal growth, newborn, infant-juvenile, and adult.



FIGURE 4 Cardiolipin species change during different developmental stages. (A) Cardiolipin (CL) and monolysocardiolipin (MLCL) in mouse embryonic stem cells (SC) and differentiated cardiomyocytes (CM). Lipid extracts of control (wildtype) cells were analyzed by mass spectrometry: Mass spectra of CL and MLCL are shown. The specific CL peaks at different m/z demonstrate differences in CL species between undifferentiated (SC) and differentiated (CM) cells, not simply a shift in MLCL: CL ratios. (Adapted from Acehan et al.,42 with permission.) (B) Mass spectra from wild-type mouse hearts: Adult (top) and E14.5 embryo (bottom: x-axes, or m/z axes, are aligned). The cardiolipin profiles (shifts in m/z [top numbers] and peak heights [bottom numbers]) indicate different cardiolipin species at different developmental stages. (Unpublished data, Phoon, and Schlame labs.) These data illustrate the power of mass spectrometry to determine developmental lipidomics.

Нарушения на любом из этапов сложного пути биосинтеза могут привести к аномалиям CL. Поскольку биосинтетический путь CL консервативен у разных видов, для изучения последствий дефицита CL и лучшего понимания роли CL в различных функциях использовались различные модельные организмы. Основные ключи к пониманию критической важности CL в нормальном эмбриогенезе и его роли в клеточной дифференциации дают клеточные и животные модели с дефицитом CL, которые приводят к летальности на различных стадиях (нокауты TAMM41, PGS1, PTPMT1, CRLS1 и TAFAZZIN). В следующих подразделах более подробно рассматриваются нарушения в биосинтетическом пути CL и влияние, которое оказывает возникающий дефицит CL на нормальное развитие.

Расположенный на внутренней мембране митохондрий, TAMM41 кодирует белок с активностью цитидиндифосфат-диацилглицерол синтазы, что является важным ранним этапом биосинтеза PG и CL⁴³. TAMM41, по-видимому, необходим для дифференцировки сердечного клапана путем регулирования PINK1-PARK2-зависимого пути митофагии; кроме того, генетический анализ показал ассоциацию гетерозиготных вариантов TAMM41 с потерей полноразмерных транскриптов при врожденном пороке сердца, известном как дефект атриовентрикулярной перегородки⁴⁴. Совсем недавно Thompson et al. сообщили о трех неродственных индивидуумах, несущих биаллельные варианты TAMM41, с клиническими признаками митохондриальной болезни, включая вялость при рождении, гипотонию, задержку развития, миопатию и птоз.⁴⁵ Образцы скелетных мышц двух из этих индивидуумов показали серьезную потерю субъединиц комплексов I-IV, снижение полностью собранных комплексов OXPHOS I-V и снижение уровня белка TAMM41. Уровень CL также был значительно снижен в скелетных мышцах этих людей. Интересно, что в отличие от семей с патогенными вариантами TAFAZZIN (синдром Барта) или вариантами CRLS1 (см. ниже), у людей с дефицитом TAMM41 не было обнаружено признаков кардиомиопатии. Исследователи отметили необходимость дальнейших исследований для выяснения того, почему скелетные мышцы серьезно поражаются, а сердечная мышца - нет, несмотря на то, что обе мышцы являются поперечно-полосатыми⁴⁵.

Мы предупреждаем, что TAMM41 находится на несколько ферментативных шагов выше конечных этапов биосинтеза кл, поэтому почти наверняка помимо дефицита кардиолипина имеются метаболические нарушения. Более того, существует альтернативный путь, способствующий синтезу CL's, по которому CDPDG также может транспортироваться из мембран ER в митохондрии (см. обзор 46); мы предполагаем, что этот альтернативный путь зависит от стадии или ткани и может обходить TAMM41, что может объяснить различное воздействие на скелетные и сердечные мышцы.

PGS1 - это фосфатидилглицеролфосфат синтаза, катализирующая первый этап биосинтетического пути CL путем преобразования CDP-DG в фосфатидилглицеролфосфат (PGP).^{32, 47} Хотя нет опубликованных данных о роли PGS1 в развитии позвоночных, было показано, что потеря PGS1 негативно влияет на эмбриональное развитие в Arabidopsis. Однако мы признаем, что PG является одним из основных липидов в растениях, а не просто промежуточным продуктом на пути CL: Биосинтез PG необходим для развития эмбрионов и нормальных мембранных структур хлоропластов и митохондрий⁴⁸. В развитии млекопитающих информация из онлайновых баз данных, таких как Evo-Devo Mammalian Organs (https://apps.kaessmannlab.org/evodevoapp/) и International Mouse Phenotyping Consortium (https://www.mousephenotype.org/data/genes/MGI:1921701), предполагает важную роль PGS1 в нормальном эмбриогенезе, поскольку экспрессия PGS1 изменяется тканеспецифическим образом (данные не показаны), а потеря PGS1 приводит к полной предродовой летальности (т.е. нет гомозиготных PGS1-/- детенышей). Однако эмбриональная жизнеспособность еще не была проверена.

PTPMT1 - это белковая тирозинфосфатаза, локализованная в митохондриях, которая дефосфорилирует глицерофосфолипид PGP и поэтому необходима для функционирования митохондрий, регулируя биосинтез CL.^{49, 50} Zhang et al. определили, что все гомозиготы Ptpmt1 погибли до периода беременности в E8.5.⁵⁰ Для дальнейшего изучения физиологических функций Ptpmt1 во время развития, эти исследователи сгенерировали обработанные Cre нокаутные мышиные эмбриональные фибробласты (MEFs). Было обнаружено, что скорость пролиферации нокаутных MEFs снижена на 25% по сравнению с контрольными клетками, а колонии в целом становились меньше и меньше. У нокаутных MEFs также наблюдалось заметное снижение содержания CL, изменения в содержании и составе ацильных цепей CL, а также искажение и дефицит митохондриальных крист. Эти результаты подчеркивают роль гена Ptpmt1 во время эмбрионального развития и позволяют предположить, что PTPMT1 может быть необходим для увеличения удовлетворения потребности в митохондриях, которая возникает во время органогенеза у пост-имплантационных эмбрионов.⁵⁰

Чтобы обойти раннюю эмбриональную летальность и исследовать специфическую роль в развитии сердца, Chen et al. изучили кардиоспецифическую делецию PTPMT1 у мышей, используя драйвер cTnT-Cre, который конститутивно экспрессирует ДНК-рекомбиназу Cre в кардиомиоцитах, начиная с E7. 5.³⁸ Хотя летальности до начала органогенеза удалось избежать, эмбрионы мышей погибли между E16.5 и E18.5, при этом морфологические изменения сердца начались примерно на ст. E12.5 после снижения пролиферации сердечных клеток в компактной зоне миокарда в E11.5. Дыхание и экспрессия белков дыхательного комплекса были нарушены в E11.5 и E12.5.³⁸ Аналогично, Zheng et al. исследовали последствия специфической для нейронных клеток делеции PTPMT1 у мышей, используя драйвер Nestin-Cre, который конститутивно экспрессирует ДНК-рекомбиназу Cre в нейронных клетках-предшественниках, начиная с E10.5.51 У этих мышей развитие мозжечка было заблокировано, развитие головного мозга было нарушено, и все мыши погибли к P12. Дополнительные эксперименты по временному нокауту с использованием модели, индуцируемой тамоксифеном, подтвердили, что роль PTPMT1 в развитии мозжечка специфична для стадии развития и что дефектное развитие глии Бергмана ответственно за блок развития мозжечка у мышей с нокаутом PTPMT1 (PTPMT1^fl/fl/Nestin-Cre⁺). Потеря PTPMT1 снижает аэробный метаболизм митохондрий, ограничивая утилизацию пирувата, что влияет только на нейрональные клетки-предшественники или стволовые клетки (но не на про-родительские или зрелые клетки), приводя к остановке клеточного цикла через активацию AMPK-p19/p21 пути.⁵¹ Однако сам CL не изучался.

Помимо позвоночных животных, PTPMT1 также играет важную роль в раннем развитии шелкопряда.⁵² Шелкопряды с нокаутом PTPMT1 демонстрируют эмбриональную летальность, остановку развития и летальность третьего возраста. У некоторых нокаутных шелкопрядов отсутствует общая активность фермента PTPMT1, а у других - сигналы митохондриальной транслокации. PTPMT1 также участвует в биосинтезе или секреции ювенильного гормона, гормона насекомых, важного для развития, размножения и полифенизма⁵².

PTPMT1 может также играть определенную роль во время дифференцировки Т-клеток. Предыдущие исследования показали, что изменения в форме митохондрий, морфологии крист и функции влияют на активацию, дифференцировку и развитие Т-клеток CD8+ (см. обзор 53). Используя Т-клетки, дефицитные по PTPMT1, Corrado et al.⁵⁴ обнаружили, что de novo PTPMT1-зависимый синтез CL необходим для увеличения метаболической способности митохондрий и обеспечения устойчивости к активацией-индуцированной гибели клеток во время дифференцировки Т-клеток памяти. Важно отметить, что ранее было показано, что индукция индуцированной активацией клеточной гибели или аутофагии поддерживает развитие Т-клеток памяти, это позволяет предположить, что синтез CL поддерживает развитие Т-клеток памяти.⁵⁴ Хотя эти исследования не изучают непосредственно роль CL во время развития, они предполагают, что CL играет важную роль в клеточной дифференцировке.

Мы отмечаем, что PTPMT1 все еще находится на один ферментативный шаг впереди конечного этапа синтеза CL. И как белковая тирозинфосфатаза, PTPMT1 может дефосфорилировать другие митохондриальные сигнальные молекулы.⁵⁵ Поэтому неизвестно, способствуют ли аномальному развитию и ранней летальности дополнительные метаболические вредные последствия удаления PTPMT1, а не только дефицит CL.

Кардиолипин синтаза (CRLS1) катализирует четвертую и последнюю реакцию биосинтеза CL's, используя два фосфолипидных субстрата, PG и CDP-DG, для образования CL's.⁵⁶ Kasahara et al. обнаружили, что делеция гена CRLS1 у мышей приводит к ранней эмбриональной летальности, особенно на пери-имплантационной стадии.⁵⁷ Исследователи предположили, что делеция CRLS1 нарушает деление клеток. Чтобы обойти проблемы, связанные с делением клеток и пролиферацией нейронов во время развития, они создали мышей с условным нокаутом CRLS1 (cKO), специфичным для пост-митотического состояния и специфичным для нейронов, и обнаружили, что нарушение гена CRLS1 снижает уровень CL и вызывает аномалии во внутренних мембранных структурах выживших нейронов гиппокампа, снижение сборки дыхательного суперкомплекса в гиппокампе и коре головного мозга, а также изменение динамики митохондриального кальция⁵⁷.

Совсем недавно было показано, что делеционные варианты CRLS1 вызывают аутосомно-рецессивное митохондриальное заболевание, которое проявляется в виде тяжелой детской энцефалопатии с мультисистемным поражением.⁵⁸ Биаллельные варианты CRLS1 были описаны у 4 пациентов с тяжелыми аномалиями развития. У трех пациентов наблюдалась схожая младенческая картина: прогрессирующая энцефалопатия, макулопатия "бычьего глаза", слуховая нейропатия, диабет insipidus, вегетативная нестабильность, пороки сердца и ранняя смерть. У четвертого пациента наблюдалась хроническая энцефалопатия с регрессом нейроразвития, врожденный нистагм со снижением зрения, нейросенсорная тугоухость, неуспеваемость и приобретенная микроцефалия. Варианты CRLS1 привели к нарушению биосинтеза CL, изменению профиля ацильных цепей CL, аномальной морфологии крист, снижению стимулированного комплексом IV дыхания, компенсаторному повышению уровня белков OXPHOS и числа копий мтДНК, а также согласованным реакциям эндоплазматического ретикулума и митохондриального стресса.⁵⁸ Это первый случай, когда аномалии развития человека были связаны с CRLS1.

Являясь трансацилазой фосфолипидов-лизофосфолипидов, tafazzin играет важную роль в ремоделировании CL's, катализируя удаление и повторное присоединение жирных кислот.^{59, 60} Потеря функции тафаззина приводит к уменьшению количества CL's и увеличению количества MLCL, потере ремоделирования CL's и аномальному составу ацильных цепей.^{61, 62} Синдром Barth - редкое Х-сцепленное митохондриальное заболевание, которое возникает в результате мутации тафаззина и приводит к дефициту CL's.^{61, 63-67} У пациентов с синдромом Барта чаще всего наблюдается кардиомиопатия, миопатия скелета, задержка роста в раннем возрасте (с последующим наверстыванием роста) и нейтропения^{68, 69}; ранние клинические проявления, включая менее известные нейробиологические проявления⁷⁰ , указывают на аномальную траекторию развития. В одном из исследований Wang et al. создали iPSC-производные кардиомиоциты, несущие мутации тафаззина, от пациентов с синдромом Барта и определили метаболические, структурные и функциональные аномалии. Такие аномалии включали дефекты саркомерогенеза, которые можно было уменьшить с помощью разрушителей реактивных форм кислорода (ROS); таким образом, роль кардиолипина в посредничестве ROS была связана с созреванием ткани.⁷¹ Мы отмечаем, что любое исследование с использованием кардиомиоцитов, полученных из iPSC, по сути, изучает "фетальный" фенотип и поэтому, вероятно, касается некоторых аспектов развития кардиомиоцитов.

В морфантной модели рыбок данио Khuchua et al. обнаружили, что блокирование трансляции мРНК или экспрессии тафаззина у рыбок данио приводит к серьезным аномалиям развития, при этом наиболее пострадавшими структурами являются сердце и хвост.⁷² У tafazzin морфантных эмбрионов развивались выраженные отеки с большими перикардиальными выпотами, дисморфные и медленно бьющиеся сердца, укороченные изогнутые хвосты и отсутствие кровообращения. Важно отметить, что исследователи также продемонстрировали, что тафаззин повсеместно экспрессируется на ранних стадиях развития (10-30 часов после оплодотворения), это позволяет предположить, что он необходим для нормального развития множества тканей и органов рыбок данио, а не только скелетных и сердечных мышц.⁷² Phoon et al. использовали индуцибельную модель мыши с нокдауном тафаззина с помощью короткой шпилечной РНК, вырубая тафаззин на разных стадиях.⁷³ В этой модели несколько линий доказательств указывали на важную роль тафаззина и функции CL в развитии. Во-первых, значительная эмбриональная летальность указывает на решающую роль тафаззина в процессе развития. Во-вторых, нокдаун тафаззина мог рекапитулировать некомпактную кардиомиопатию только при раннем нокдауне тафаззина, что указывает на важный промежуток в развитии для функционирования тафаззина (на что также обратили внимание Chin and Conway⁴¹). Более того, аномалии в структуре кардиомиоцитов и ультраструктуре митохондрий в эмбриональном сердце, приводящие к нарушению развития миокарда, указывают на нарушение нормального развития сердечной мышцы и формирования саркомеров.⁶² Однако стоит отметить возможное сбивающее влияние доксициклина в модели мыши с tafazzin-KD в данном исследовании.⁷⁴

Последствия удаления тафаззина - с последующим дефицитом CL - также влияют на клеточную дифференциацию. Чтобы сравнить последствия удаления тафаззина в недифференцированных и дифференцированных клетках, Acehan et al. создали эмбриональные стволовые клетки мыши с дефицитом тафаззина, которые затем дифференцировали в кардиомиоциты. Они обнаружили значительные изменения ультраструктуры митохондрий в специфических дифференцированных тканях, но не в эмбриональных стволовых клетках. Эти данные позволяют предположить, что нормальная концентрация и состав CL необходимы только в определенных типах митохондрий. Более конкретно, митохондрии с высокой плотностью крист, такие как в скелетной и сердечной мышечной ткани, наиболее восприимчивы к делеции тафаззина.⁴² Фактически, было показано, что миогенная дифференцировка сопровождается значительными изменениями в митохондриальном метаболизме, производстве энергии митохондриями и опосредованной митохондриями активацией апоптотических путей.⁷⁵ Учитывая эту важную роль митохондрий в миогенной дифференцировке, Lou et al. создали клеточную линию миоцитов C2C12, содержащую тафаззин-KO, чтобы определить влияние дефектного ремоделирования CL на миогенную детерминацию.⁷⁶ C2C12 - это клеточная линия миобластов с высокой метаболической потребностью, как и клетки скелетных мышц. Поразительно, что клетки миобластов, содержащие тафаззин-КО, показали нарушение фенотипической дифференцировки в миотрубки, а также дефекты метаболического перехода от гликолиза к митохондриальному окислительному метаболизму. Более того, в отличие от клеток WT, клетки tafazzin-KO демонстрировали повышенную зависимость от гликолиза и сниженную потребность в митохондриальном окислительном метаболизме после перехода на среду для дифференцировки миоцитов. Эти данные показывают, что потеря CL приводит к дефектной дифференцировке скелетных миоцитов.⁷⁶ Наконец, Seneviratne et al.⁷⁷ оценили влияние нокдауна тафаззина на стволовые клетки и предшественники острого миелоидного лейкоза (AML) и их дифференцировку. Их исследование показало, что нокдаун тафаззина уменьшает распространение AML путем снижения стволовости AML как in vivo, так и in vitro. Интересно, однако, что снижение стволовости лейкозных клеток было связано с увеличением уровня фосфатидилсерина и активацией сигнализации toll-like рецепторов, в отличие от ожидаемого нарушения структуры митохондрий и ухудшения OXPHOS при нокдауне тафаззина. Кроме того, нокдаун тафаззина увеличивал дифференцировку клеток AML, демонстрируя, что тафаззин-опосредованное производство фосфолипидов регулирует как стволовость, так и дифференцировку AML⁷⁷.

Вместе взятые, опубликованные данные убедительно подтверждают мысль о том, что tafazzin играет важную роль в развитии и дифференциации тканей.

Дополнительные ацилтрансферазы, участвующие в ремоделировании CL, могут также играть роль в процессах развития. Ацил-КоА:лизокардиолипин ацилтрансфераза (ALCAT1) (также известная как лизокардиолипин ацилтрансфераза или lycat) кодирует ацил-КоА:лизокардиолипин ацилтрансферазу 1, которая обладает ацил-КоА:монолизокардиолипин ацилтрансферазной и ацил-КоА:дилизокардиолипин ацилтрансферазной активностью²³. Было показано, что ген lycat у рыбок данио играет необходимую роль в формировании эндотелиальной и гемопоэтической линий, а мышиный ортолог этого гена играет решающую роль в ранней спецификации гемопоэтических и эндотелиальных клеток. Избыточная экспрессия гена lycat увеличивает экспрессию генов как кроветворных, так и эндотелиальных клеток и увеличивает образование обоих типов клеток. Более того, siRNA-опосредованный нокдаун гена lycat снижал экспрессию генов кроветворения и эндотелия во время дифференцировки эмбриональных клеток в эмбриоидные тела, это позволяет предположить, что ген lycat важен для развития эндотелия и кроветворения в эмбриональных стволовых клетках мыши.⁷⁸ Связь с кардиолипином, однако, не была ясна в данном исследовании.

Мутации в альфа-субъединице митохондриального трехфункционального белка (TFPα/HADHA) в iPSC-выведенных кардиомиоцитах человека приводят к дефициту тетралинолеоилкардиолипина, сходному с биохимическим фенотипом синдрома Барта²⁹; TFPα/HADHA, по сути, является MLCLAT1.^{28, 29, 79, 80} Однако нам не известно ни одного заболевания человека, обусловленного мутациями именно в MLCLAT1, которые не затрагивали бы также митохондриальный трифункциональный белок.

Наконец, в канадской популяции Dariusleut Hutterite был описан аутосомно-рецессивный синдром, похожий на синдром Barth, характеризующийся дилатационной кардиомиопатией с атаксией (DCMA), который в настоящее время приписывается гомозиготным вариантам DNAJC19.⁸¹ Хотя DNAJC19 не является ацилтрансферазой или непосредственно участвует в синтезе кардиолипина, он является митохондриальным ко-шапероном, образующим комплекс с prohibitins (PHB) для регулирования ремоделирования CL.⁸². Этот синдром поражает младенцев и детей младшего возраста с ранним началом кардиомиопатии, мозжечковой атаксией и задержкой развития. Исследователи наблюдали нарушение роста клеток и дефектный морфогенез крист при потере комплексов PHB/DNAJC19, что влияет на ацилирование CL и приводит к накоплению видов CL с измененными ацильными цепями.⁸² Однако точная функция DNAJC19 не вполне понятна. Недавно Rohani et al. изучили мононуклеарные клетки периферической крови двух пациентов с DCMA и контрольной группы, количественно определив несколько видов CL в iPSCs и iPSC-произведенных кардиомиоцитах (iPSC-CMs) с помощью масс-спектрометрии.⁸³ Было замечено несколько небольших, но статистически значимых различий между недифференцированными контрольными и iPSCs пациентов. Меньшее количество видов CL было обнаружено в iPSCs по сравнению с iPSC-CMs, и, что важно, зрелая форма CL(18:2)4 не присутствовала в значительных количествах (менее 1%) в недифференцированных iPSCs. Таким образом, в iPSC-CMs наблюдалось большее разнообразие CL. В iPSCs преобладали CL(18:2)(18:1)3, составлявшие около 40% от общего количества CL. В дифференцированных iPSC-CMs не было обнаружено последовательных и значительных различий между пациентами с DCMA и контрольным штаммом. Доля "зрелых" (тетралинолеоильных) CL составляла от 6,5% до 14,4% от общего количества - меньше, чем можно было бы ожидать в зрелой сердечной ткани. iPSC-CMs пациентов демонстрировали сильно фрагментированные и аномальной формы митохондрий, связанные с несбалансированным соотношением изоформ митохондриального белка OPA1, важного регулятора слияния митохондрий. Эти аномалии были обратимы при инкубации с SS-31, который, как предполагается, взаимодействует с CL и стабилизирует его.⁸³

Как обобщили Chin and Conway⁴¹, беспозвоночные, по-видимому, гораздо менее восприимчивы к потере CL. У дрозофилы инактивация CRLS1⁸⁴ или тафаззина⁸⁵ не привела к каким-либо последствиям для развития, включая эмбриональную летальность. У C. elegans инактивация CRLS1 с помощью двух различных делеционных аллелей CRLS1 привела только к аномальной морфологии митохондрий (включая нарушенные кристы) и функции, а также к снижению пролиферации половых клеток.⁸⁶ Таким образом, похоже, что CL становится все более важным по мере перехода организмов к более высокому порядку.

Известные роли CL в нормальном функционировании митохондрий согласуются с тем, что мы знаем об общей важности нормального функционирования митохондрий в развитии организма. В этом разделе мы попытаемся связать известные функции CL с предполагаемыми ролями в путях и процессах развития, даже если (пока) нет прямых данных, связывающих конкретную функцию CL с конкретным процессом развития.

Развитие, органогенез и созревание требуют тесной пространственной и временной координации множества различных процессов. Такие процессы включают регуляцию экспрессии, трансляции и пост-трансляционных модификаций генов; определение клеточной судьбы и дифференцировку из стволовых клеток; многоуровневый контроль прогрессии клеточных линий; внутриклеточные и межклеточные сигнальные события; клеточную пролиферацию; запрограммированную гибель клеток (апоптоз); миграцию клеток; регуляцию формы и полярности клеток; объединение клеток и их сборку в ткани; клеточные и тканевые реакции на сигналы окружающей среды, включая паракринные и экзокринные сигналы, и внешние физические силы; и, наконец, формирование формы.^87-95. Теперь мы знаем, что нормальная функция митохондрий необходима для многих, если не всех, этих процессов.

Телеологически митохондрии хорошо приспособлены для того, чтобы играть важную роль в клеточной дифференциации и развитии организма. Будучи чрезвычайно "пластичными" органеллами⁹⁶ , их форма и функция зависят от конкретной ткани и даже могут варьировать внутри клеток. Во время развития эмбриона млекопитающих происходят изменения как в структуре^{97, 98} , так и в функции митохондрий.^99-103 Подсказки о потенциально критической роли митохондрий во время пренатального развития и эмбриогенеза также дают многочисленные исследования их критической роли в клеточной дифференцировке и судьбе стволовых клеток (см. обзор 104). Митохондрии - это не просто генераторы энергии, а активные метаболические сигнальные органеллы, и механизмы, посредством которых митохондрии контролируют судьбу стволовых клеток, включают ROS, кальциевую сигнализацию, метаболиты цикла трикарбоновых кислот, соотношение NAD+/NADH, метаболизм пирувата и динамику митохондрий (т.е. деление и слияние). Другими словами, митохондриальная метаболическая сигнализация может контролировать транскрипционные сети независимо от производства энергии.^104-106 Таким образом, митохондрии выступают в качестве важных "центров" в координации клеточной дифференциации.¹⁰⁷ Читатель может ознакомиться с отдельными обзорами по кардиогенезу,¹⁰⁸ гемопоэзу^{104, 109} и клеточно-опосредованному иммунитету,¹¹⁰ миогенезу,^111-113 остеогенезу, адипогенезу,^114-116 и различным другим мезенхимным тканям,^{114, 117} стволовым клеткам кишечника,^{118, 119} стволовым клеткам половых клеток,¹²⁰ и нейрогенезу взрослых,¹²¹ в качестве общих примеров.

Во время развития позвоночных для роста, деления и дифференцировки клеток требуется большое количество энергии. Метаболизм охватывает все биохимические реакции, участвующие в путях преобразования энергии в организме, включая гликолиз, OXPHOS, цикл Кребса и окисление жирных кислот. Быстро меняющиеся анаболические и катаболические потребности в развивающемся эмбрионе отражаются в эволюционирующем метаболическом профиле, при этом энергетический метаболизм эмбриона подстраивается под состояние дифференциации, пролиферации и специфические энергетические потребности клетки, включая изменения в доступности кислорода. Таким образом, метаболические пути пространственно-временно регулируются и специфичны для каждой линии.^{122, 123} В целом, переход от гликолиза к OXPHOS и окислению жирных кислот сигнализирует о терминальной дифференцировке и завершении пролиферативной фазы.^{34, 124-126} Эта специфическая для линии метаболическая перестройка была связана с клеточной дифференцировкой и судьбой клеток во многих тканях.^{111, 114, 127} Вот лишь два примера: функционирование митохондрий необходимо для созревания сомитов и эмбрионального развития рыбок данио,¹²⁸ в то время как для активации комплекса I и формирования суперкомплексов дыхательной цепи при увеличении OXPHOS требуются резкие изменения в митохондриях.¹²⁹

CL наиболее тесно связан с его ролью в биоэнергетике и, в частности, в OXPHOS. На самом фундаментальном уровне CL необходим внутренней мембране митохондрий для достижения надлежащей плотности и функционирования белков, включая мембранную стыковку митохондриальных рибосом и синтез белка,^{130, 131} "вытеснение" белков во внутренней мембране митохондрий,¹³² и стабилизацию белков для надлежащей деятельности, включая сборку суперкомплексов дыхательной цепи.^{11-15, 133} Дефицит CL приводит к нарушению стабильности суперкомплексов и к общему снижению производства энергии в ходе аэробного метаболизма.^{3, 133-135}.

В нормальных физиологических условиях ROS являются естественными побочными продуктами аэробного метаболизма (OXPHOS) в митохондриях и играют многочисленные роли в поддержании клеточного гомеостаза путем модуляции клеточной смерти, выживания клеток и клеточной сигнализации.^{3, 136, 137} Передача сигналов Redox имеет фундаментальное значение для процессов развития, включая пролиферацию, дифференциацию, апоптоз и лево-правостороннюю асимметрию.^{138, 139} Во время органогенеза самообновление стволовых клеток и принятие ими решений о судьбе регулируются уровнем ROS.¹⁰⁷ Во многих взрослых стволовых клетках, включая сперматогониальные, базальные клетки дыхательных путей, кроветворные, кератиноциты, мезенхимные, скелетные мышцы и нейральные стволовые клетки, низкий уровень митохондриальной ROS необходим для самообновления и покоя, а умеренное физиологическое увеличение ROS необходимо для нормальной пролиферации и дифференцировки стволовых клеток (см. обзоры^{104, 106, 114, 127}). В позднем органогенезе и особенно в кардиогенезе было показано, что кардиомиоциты на разных эмбриональных стадиях демонстрируют различные уровни ROS, что еще больше указывает на регуляторную роль ROS на этапах развития.⁷⁵ Было показано, что дифференцировка кардиомиоцитов подавляется и усиливается при обработке оксидантами и антиоксидантами, соответственно, что позволяет предположить, что окислительно-восстановительные сигнальные пути регулируют дифференцировку в этих клетках.⁷⁵ Производство ROS пространственно и временно регулируется клеткой, и действительно, было показано, что уровни ROS различаются на определенных этапах эмбрионального развития, начиная с оплодотворения и включая такие события, как дробление эмбриона и клеточный цикл.^{140, 141} Возможные активные роли, посредством которых ROS регулирует эти процессы развития, включают регуляцию фосфорилирования белков, регуляцию активности транскрипционных факторов и транскрипционную активацию специфических генов, вовлеченных в окислительный стресс.^{138, 139, 142} Дисфункция митохондрий может привести к избытку ROS и окислительному стрессу, что, в свою очередь, может привести к последствиям для развития. Нарушение уровня ROS может повлиять на дифференцировку стволовых клеток; пониженный уровень ROS может привести к нежелательному повышенному покою и дефектам дифференцировки, а аберрантно высокая продукция митохондриальной ROS может вызвать истощение стволовых клеток.^{104, 139}

Данные нескольких модельных систем с дефицитом CL показали, что снижение CL приводит к повышению митохондриальных ROS,^{71, 135, 143-146}, хотя другие исследования ставят под сомнение эту связь в моделях синдрома Барта.^{147, 148} Аномально повышенные митохондриальные ROS вызывают нарушение баланса между ROS и антиоксидантными ферментами, что приводит к митохондриальным ультраструктурным изменениям в мтДНК, белках и липидах, и в конечном итоге к митохондриальной дисфункции (см. обзоры^{3, 149}). ROS могут быть взаимосвязаны с другими митохондриальными процессами, включая динамику митохондрий и ретроградную сигнализацию (см. в другом месте). Khacho et al. обнаружили, что динамика митохондрий может диктовать судьбу нейрональных стволовых клеток, вызывая физиологический ROS-опосредованный процесс, который запускает транскрипционную программу, подавляющую самообновление и способствующую дифференцировке через NRF2 (ядерный фактор эритроидного 2-родственного фактора 2), опосредованной ретроградной сигнализацией.¹⁵⁰ Учитывая потенциальную роль CL в регуляции уровня ROS, можно предположить, что CL также может участвовать в этом ретроградном пути.

Апоптоз - это организованный и контролируемый процесс гибели клеток, который происходит в организмах для контроля роста и обеспечения нормального развития.^{39, 151, 152} Во время развития апоптоз необходим для уравновешивания пролиферации клеток и регулирования роста тканей. Центральная роль митохондрий в апоптозе клеток также способствует увеличению размера, формы и роста эмбриона, а также удалению аномальных клеток из быстро развивающегося организма¹⁵³ и ремоделированию тканей.^{152, 154}

В общем в митохондриально-опосредованном пути апоптоза стрессовые условия приводят к транслокации нормального CL на внешнюю митохондриальную мембрану. После транслокации CL рекрутирует внутренние апоптотические факторы, которые способствуют поницаемости внешней митохондриальной мембраны. Экстернализованный CL взаимодействует с цитохромом с, митохондриальным белком, образуя комплекс цитохром с/CL с пероксидазной активностью, который может нацеливаться на CL окислять его; ряд видов оксигенированного CL подвергается гидролизу под действием фосфолипазы А2 с образованием нескольких оксигенированных жирных кислот, включая хорошо известные липидные медиаторы, участвующие в апоптозе и других биологических функциях¹⁵⁵. Снижение сродства цитохрома c к окисленному CL приводит к его высвобождению из митохондрий в цитозоль, инициируя путь апоптотического каскада (см. обзоры^{3, 156-158}). Используя метод дробной липидомики, Cheng et al. обнаружили, что изменения содержания CL в мозге в перинатальном периоде временно коррелировали с количеством апоптоза, который происходил в этот период развития.³⁹ Изменения в составе CL, особенно усиление перекисного окисления CL и снижение уровня CL, могут привести к ускорению и дерегулированию уровня апоптоза.^{149, 159-163}.

Динамика митохондрий играет важную роль во время эмбрионального развития. Динамика митохондрий относится к скоординированным циклам событий слияния/деления, которые способствуют динамической природе митохондрий, включая движение митохондрий по цитоскелету и регуляцию морфологии и распределения митохондрий.^{164, 165} Деление - это процесс, при котором митохондрии делятся, образуя две отдельные митохондриальные органеллы, а слияние - это физическое смешение содержимого между двумя изначально разными митохондриями.¹⁶⁶ Важность слияния митохондрий во время эмбриогенеза была продемонстрирована на мышиных эмбриональных фибробластах (MEFs), лишенных Mfn (митофузина)1 или Mfn2, двух основных белков, необходимых для слияния митохондрий.¹⁶⁷ Мыши с нокаутом Mfn1- и Mfn2- демонстрируют различные типы фрагментированных митохондрий и умирают внутриутробно в середине беременности, а мыши с двойным нокаутом Mfn1/Mfn2 умирают на более ранних стадиях развития. Интересно, что MEFs от мышей с двойным нокаутом могут выживать в культуре, несмотря на отсутствие слияния митохондрий, что позволяет предположить, что слияние митохондрий не является необходимым для выживания клеток, а требуется для эмбрионального развития и выживания клеток на более поздних стадиях.^{167, 168} В нейрональных стволовых и клетках предшественниках судьба клеток также предопределяется динамикой слияния-деления митохондрий.^{150, 169}. Нарушение генов, способствующих слиянию митохондрий, таких как Opa1 (атрофия зрительного нерва 1), приводит к увеличению дифференцировки нейронов, тогда как нарушение генов, способствующих делению митохондрий, таких как Drp1 (белок 1, связанный с динамином), приводит к снижению нейрогенеза.¹⁷⁰ Наконец, динамика митохондрий также была вовлечена в регуляцию апоптоза, при этом ингибирование белков, способствующих делению митохондрий, может уменьшить апоптоз, а ингибирование белков, способствующих слиянию митохондрий, может увеличить апоптоз, и оба эти фактора потенциально могут нарушить нормальное развитие¹⁷¹.

CL имеет решающее значение в событиях слияния/деления митохондрий через взаимодействие с белками-посредниками слияния и деления, включая Opa1 и Drp1.^172-174 Дефицит CL приводит к снижению уровня Opa1 и Drp1, что приводит к дефектам морфологии митохондрий.^{166, 175} Более того, изменения в составе CL, в основном в длине и уровне насыщения ацильных цепей CL, нарушают баланс между событиями деления/слияния.^{158, 176, 177} CL, по-видимому, имеет решающее значение в модуляции многочисленных функций Opa1 в личинке шелкопряда, таким образом регулируя слияние митохондрий, морфологию и контроль качества во время развития.¹⁷⁶ Хотя специфическое ремоделирование CL тафаззином оказалось необязательным в этой же модели шелкопряда,¹⁷⁸ другая группа продемонстрировала, что дефицит тафаззина в условной (специфической для сердца) модели мыши с нокаутом тафаззина привел к резкому снижению Mfn1 и Mfn2, в то время как длинная изоформа Opa1 была незначительно снижена; белок деления митохондрий Drp1 и его статус фосфорилирования не изменились.¹³³ Однако в этом исследовании не проводилось прямого изучения динамики митохондрий для подтверждения клеточного фенотипа.¹³³

Развитие, конечно, направляется транскрипцией, и ретроградная сигнализация является одним из способов регуляции транскрипции. При ретроградной передаче сигналов экспрессия ядерных генов может модулироваться в ответ на функциональные изменения в нижележащих компонентах пути, например, изменения в органеллах. Все митохондриальные белки, за исключением 13 белков, кодируются ядерными генами (nDNA, антероградная сигнализация), но поскольку митохондрии также содержат свой собственный геном (мтДНК), два генома (nDNA и mtDNA) должны координироваться антероградной и ретроградной сигнализацией для создания нормального митохондриального протеома.^179-183. Молекулы и процессы, которые были связаны с ретроградной сигнализацией во время развития, включают ROS (см. выше), HIF и митохондриальный ответ на развернутый белок.

В низкокислородной, или гипоксической, среде измененная экспрессия генов инициируется димерным транскрипционным фактором, индуцируемым гипоксией (HIF).^{122, 184} При низком уровне кислорода активируется HIF1α и повышает транскрипцию группы генов, которые либо способствуют гликолитическому метаболизму для снижения потребления кислорода, либо действуют в направлении расширения или изменения окружающей сосудистой сети, включая изменение состава и организации дыхательной цепи.¹⁸⁵. Хотя ни одно исследование не позволило непосредственно выяснить роль, которую CL играет в этом HIF ретроградном пути, было показано, что дефицит CL в клетках tafazzin-КО нарушает транскрипцию HIF1α и, следовательно, приводит к значительному снижению белка HIF1α, наряду со снижением экспрессии специфических для гипоксии изоформ субъединиц комплекса IV дыхательной цепи.¹⁸⁶ Таким образом, дефицит CL связан с аномальным каскадом клеточных событий, включающих снижение HIF1α с возможными нарушениями в ретроградной сигнализации.

Как плацентарные позвоночные, млекопитающие развиваются в относительно гипоксической среде. Хотя транскрипционная система HIF чаще всего обсуждается в контексте патологической гипоксии, HIF также играет важную регуляторную роль в нормальной гипоксической среде нормального развития млекопитающих.^186-188 Активность HIF необходима для общего нормального развития плаценты и развития конкретных тканей органов, включая легкие,¹⁸⁹ кости и хрящи.^{122, 190} Активность HIF также необходима для нормального морфогенеза сердца. Потеря HIF1α или HIF1β приводит к остановке морфогенеза на различных стадиях, начиная со стадии сердечного полумесяца и заканчивая формированием камер (обзор Dunwoodie¹²²).

Когда белки не могут правильно сворачиваться и созревать в митохондриях, возникающий стресс в органелле приводит к активации ядерной транскрипционной программы, называемой mitochondrial unfolded protein response (mtUPR), целью которой является увеличение транскрипции митохондриальных шаперонов и протеаз для противодействия митохондриальной дисфункции¹⁹¹. mtUPR играет важную регуляторную роль в пролиферации стволовых клеток, клеточной дифференциации, старении,¹⁹² развитии ооцитов и эмбрионов, функции и динамике митохондрий ооцитов.¹⁹³ На ранней стадии mtUPR происходит быстрое ремоделирование CL, что приводит к изменению липидного микроокружения, которое помогает стабилизировать механизмы импорта белков при индукции mtUPR.¹⁹¹

Нормальный железо-серный (Fe-S) механизм также необходим для нормальной жизнеспособности и развития эмбриона млекопитающих.¹⁹⁴ Fe-S кластеры являются важными белковыми кофакторами, которые можно найти в ядре, цитозоле и митохондриях. В митохондриях Fe-S кластеры участвуют в цикле лимонной кислоты, цепи переноса электронов, окислении жирных кислот, а также в биосинтезе липоатов и биотина.¹⁹⁵ В настоящее время известно, что содержание и запасы железа, включая содержание железа в головном мозге (которое включает содержание митохондриального железа, хранящегося в основном в Fe-S кластерах), изменяются в процессе развития.¹⁹⁶ Исследования других белков, участвующих в Fe-S кластерах, таких как NARFL,¹⁹¹ также продемонстрировали их критическую роль в эмбриональном развитии.

Учитывая роль Fe-S кластеров в функционировании цепи электронного транспорта и митохондриальной OXPHOS,¹⁹⁸ неудивительно, что они также опосредуют производство митохондриальных ROS и могут лежать в основе патогенеза заболеваний. Действительно, в клетках TAZKO (моделирующих синдром Барта) и дрожжевых клетках, лишенных CL, исследователи продемонстрировали снижение каталитической активности ферментов, требующих Fe-S кофакторы, а также общий дефект Fe-S биогенеза и гомеостаза железа, а также последующую повышенную чувствительность к окислительному стрессу¹⁹⁹. Более того, эти клетки TAZKO и дрожжевые клетки, лишенные CL, демонстрируют пониженный уровень frataxin, важного белка пути биогенеза Fe-S, и было показано, что существует прямое взаимодействие между CL и фратаксином, это позволяет предположить, что отсутствие этого взаимодействия в митохондриях с дефицитом CL может объяснить дефекты биогенеза железа и гомеостаза железа¹⁹⁹.

Кальций (Ca²⁺) и сигнальные пути кальция важны для многих аспектов эмбрионального развития,^200-205 включая развитие нервной системы, сердечной системы, иммунной системы, а также развитие почек и мышц.^{200, 201} Митохондрии вовлечены во внутриклеточный и внутриорганеллярный гомеостаз Ca²⁺ и подвержены его влиянию. Двумя важными механизмами, с помощью которых митохондрии регулируют уровень Ca²⁺ и/или используют Ca²⁺ для клеточных процессов, являются митохондриальный Ca²⁺ uniporter (MCU) и митохондриальная переходная пора проницаемости (mPTP), канал неспецифической проводимости.

В митохондриях основная роль Ca²⁺ заключается в стимуляции OXPHOS. MCU помогает поддерживать общий гомеостаз Ca²⁺, в частности, посредством поглощения Ca²⁺ через митохондриальную мембрану.^206-212 Недавние исследования указывают на важность специфических липидов для функционирования и формирования MCU. В одном из исследований было показано особое требование CL для стабильности и активности MCU, где потеря CL вызвала быстрый оборот гомологов MCU и нарушила транспорт Ca²⁺.²¹³ Более того, мутации тафаззина, и, следовательно, дефицит CL, были связаны с аномальным обращением Ca²⁺ и, следовательно, снижением сократимости кардиомиоцитов.²¹⁴ Когда концентрация ^Ca2+ увеличивается внутриклеточно, mPTP открывается и обеспечивает свободное прохождение мелких метаболитов и ионов в митохондрии.²¹⁵ Открытие mPTP также часто сопровождается усиленным производством ROS.^{216, 217} Было показано, что перекисное окисление CL, которое происходит в присутствии высокого уровня ROS, вместе с Ca²⁺ участвует в открытии mPTP.^{156, 218} Считается, что CL может сначала связываться с аденин-нуклеотидным транслокатором (ANT), белком, который облегчает обмен ADP и ATP через митохондриальную мембрану, это затем позволяет Ca²⁺ связываться и активировать открытие mPTP.²¹⁵. Хотя длительное открытие mPTP связано с заболеваниями, переходное открытие mPTP было связано с развитием сердца и мозга, особенно на уровне дифференцировки клеток. В кардиомиоцитах закрытие mPTP приводит к созреванию структуры и функции митохондрий, снижению ROS, повышению мембранного потенциала и, в конечном счете, ускорению дифференцировки клеток.^{75, 219} При развитии нейронов дифференцировка клеток также опосредуется открытием mPTP.^{219, 220}

Хотя многие из этих доказательств остаются косвенными, мы обобщили имеющиеся данные о развивающейся и важной роли CL во время развития организма, включая органогенез и созревание тканей (рис. 5). Кроме того, известно, что нормальное функционирование митохондрий способствует нормальным процессам развития. Как ключевой митохондриальный фосфолипид, CL должен играть еще более детальную роль, начиная с раннего предимплантационного эмбриогенеза через клеточную дифференциацию, органогенез и созревание тканей.



FIGURE 5 Specific functions of cardiolipin are linked to developmental processes. Cardiolipin's roles during development include maintenance of cell stemness and roles in cell fate and commitment (differentiation) and patterning and morphogenesis of tissues and organs. While many of these roles have not been demonstrated mechanistically, the importance of mitochondria in development via their involvement in bioenergetics, the generation and movement of reactive oxygen species, apoptosis, fission/fusion events, retrograde signaling, iron-sulfur clusters, and calcium signaling all strongly implicate direct mechanistic roles for cardiolipin. (Created with BioRender.com.)

Итак вопросы, требующие ответа:

(1) Как изменяется CL на протяжении развития и созревания организма? Приводят ли изменения в развитии митохондрий (ультраструктуры) к изменениям в CL, или же CL изменяется в первую очередь, способствуя тем самым созреванию митохондрий? Данные указывают на требование биофизической среды для специфичности тафаззина.^{30, 221} Таким образом, если биофизическая среда определяет специфичность тафаззина, то эволюция морфологии митохондриальной мембраны во время пренатального развития (особенно раннего) будет частично определять, что делает тафаззин и каковы особенности ремоделирования CL. Роль дополнительных ферментов ремоделирования, таких как ALCAT1 и MLCLAT1, также требует уточнения, в том числе во время развития.

(2) Почему митохондрии нуждаются в CL на каждой стадии развития? Как изменения в CL влияют на функционирование липидного бислоя, и как они, в свою очередь, способствуют развитию и созреванию различных тканей? Сборка комплексов OXPHOS вызывает ремоделирование CL, что, в свою очередь, приводит к стабилизации CL. Данные нашей лаборатории свидетельствуют о том, что скопление белков в системе OXPHOS вызывает напряжение упаковки липидного бислоя, которое снимается ремоделированием CL с образованием плотно упакованных липидно-белковых комплексов.²²² Поскольку кристы довольно слабо развиты в раннем эмбрионе, требование снятия напряжения скопления белков может быть неочевидным; мы пока не знаем траекторию развития плотности белков в митохондриальных мембранах.

(3) Как относительно гипоксическая среда плода млекопитающих влияет на CL и функцию митохондрий? Развитие млекопитающих происходит в низкокислородной среде матки. На органогенез влияют факторы транскрипции HIF, которые являются сенсорами гипоксии,^{223, 22}4 и мы знаем, что биология митохондрий, CL и HIF-1 связаны между собой.¹⁸⁶ Поэтому изменение уровня кислорода в развивающемся организме млекопитающих (как это происходит, например, при некоторых формах врожденных пороков сердца или плацентарной недостаточности) может влиять на транскрипционную регуляцию через CL, или, наоборот, аномальный CL может влиять на HIF-1α¹⁷⁸ и, следовательно, на органогенез.

(4) В каких органах CL имеет решающее значение для развития, как и почему? Существуют ли немитохондриальные роли CL в процессе развития? Хотя CL традиционно считается "фирменным" фосфолипидом митохондрий, недавняя работа нашей лаборатории выявила новую, вне-митохондриальную роль CL, в частности TPCL, как критически важную для нормального сперматогенеза и формирования акросомы.^{31, 225} Таким образом, могут существовать роли CL, не связанные с функцией митохондрий, но связанные с клеточной дифференциацией и, возможно, другими процессами развития.

Наконец, CL, по-видимому, имеет большее значение в организмах высшего порядка, чем в простых эукариотах. Возрастающая сложность систем может потребовать "тонкой настройки" CL в течение жизни и в различных тканях. Исследования биологии кардиолипина в модельных системах должны учитывать это предостережение. Три митохондриальных заболевания человека, в патогенезе которых в основном участвует CL, поражают маленьких детей и, следовательно, демонстрируют аномалии развития: синдром Барта и недавно описанные биаллельные варианты в TAMM41 и CRLS1. Таким образом, более глубокое понимание биологии CL во время органогенеза и созревания тканей у сложных метазоев, вероятно, приведет к определению терапевтических мишеней и подходов при таких заболеваниях, связанных с дефицитом CL.