Посещений:
КОФИЛИНЫ В РАЗВИТИИ



Механизмы регуляции

Roles of cofilin in development and its mechanisms of regulation
• Kazumasa Ohashi
Development, Growth & Differentiation Volume 57, Issue 4 May 2015 Pages 275–290

Reorganization of the actin cytoskeleton is essential for cellular processes during animal development. Cofilin and actin depolymerizing factor (ADF) are potent actin-binding proteins that sever and depolymerize actin filaments, acting to generate the dynamics of the actin cytoskeleton. The activity of cofilin is spatially and temporally regulated by a variety of intracellular molecular mechanisms. Cofilin is regulated by cofilin binding molecules, is phosphorylated at Ser-3 (inactivation) by LIM-kinases (LIMKs) and testicular protein kinases (TESKs), and is dephosphorylated (reactivation) by slingshot protein phosphatases (SSHs). Although studies of the molecular mechanisms of cofilin-induced reorganization of the actin cytoskeleton have been ongoing for decades, the multicellular functions of cofilin and its regulation in development are just becoming apparent. This review describes the molecular mechanisms of generating actin dynamics by cofilin and the intracellular signaling pathways for regulating cofilin activity. Furthermore, recent findings of the roles of cofilin in the development of several tissues and organs, especially neural tissues and cells, in model animals are described. Recent developmental studies have indicated that cofilin and its regulatory mechanisms are involved in cellular proliferation and migration, the establishment of cellular polarity, and the dynamic regulation of organ morphology.


Рисунки к статье

Организация клеточных популяций в тканях животных важна для морфогенеза органов во время развития. Клетки распознают свое трехмерное расположение по отношению к целому организму и регулируют клеточную форму, подвижность, миграцию, поляризацию, рост, дифференцировку, генную экспрессию и гибель клеток в соответствии со внешнесредовыми сигналами. эти сигналы включают различные растворимые факторы и молекулы, которые контролируют межклеточную и клетка-субстрат адгезию. Ремодулирование актинового цитоскелета важно для этих клеточных реакций и морфологических изменений и д. регулироваться в пространстве и во времени с помощью ряда сложных сигнальных путей (Etienne-Manneville & Hall 2002). Актиновый цитоскелет состоит из пучков и комбинаций актиновых филамент. Их реорганизация происходит путем сборки и разборки актиновых филамент, привлекая на помощь многочисленные актин-связывающие белки (Moon & Drubin 1995; Pantaloni et al. 2001; Etienne-Manneville & Hall 2002). Молекулярные механизмы и сигнальные пути, необходимые для ремоделирования актиновго цитоскелета, были изучены (Ayscough 1998; Etienne-Manneville & Hall 2002; Ono 2007). Одним из основных прорывов стала идентификация Rho семейства малых GTPases в качестве ключевых молекул (Jaffe & Hall 2005). В результате ряд нижестоящих эффекторных молекул Rho семейства был идентифицирован и стала понятнее роль этих молекул (Bustelo et al. 2007). Роль регуляторов актинового цитоскелета и их сигнальных путей во время развития тканей и органов изучалась активно в последнее время. Семейство белков cofilin/actin-depolymerizing factor (ADF) (после этого обозначаемое как cofilin) оказалось законсервированным от дрожжей до человека. Cofilin, один из важных белков, регулирующих актин, соединяется как с мономерными, глобулярными (G)-актинами, так и с филаментозными (F)-актинами и разбирает F-actin, что приводит к деполимеризации F-актина (Moon & Drubin 1995; Bamburg et al. 1999; Andrianantoandro & Pollard 2006; Bernstein & Bamburg 2010). Поскольку cofilin обладает высоким сродством к ADP-связанным актиновым филаментам, чем к ATP-связанным филаментам, то "старые" актиновые филаменты избирательно разбираются (Pollard & Borisy 2003). Эти активности важны для генерации динамики актинового цитоскелета в клетках. Было установлено, что активность cofilin регулируется в пространстве и времени с помощью фосфорилирования, связывания липидов и связывания белков, стоящими ниже различных сигнальных путей (Ono 2007). LIM-киназы и Slingshot фосфатазы фосфорилируют и дефосфорилируют cofilin, соотв. (Mizuno 2013). Уровень фосфорилирования cofilin в клетках изменяется динамически во время различных клеточных реакций и изменения в уровне фосфорилирования являются критическими для регуляции динамики актинового цитоскелета (Kiuchi et al. 2011). Изучение роли cofilin and its и его фосфорилирования в развитии и морфогенезе тканей и органов началось в последней декаде (Mizuno 2013).

Structure and regulation of cofilin


Cofilin был очищен и идентифицирован как белок в 20-kDa, который вызывает деполимеризацию актиновых филамент в экстрактах из головного мозга птиц или свиней (Bamburg et al. 1980; Nishida et al. 1984). Семейство cofilin состоит из не мышечного типа cofilin-1 (известен также как n-cofilin), мышечного типа cofilin-2 (известен также как m-cofilin) и actin depolymerizing factor (ADF, известен также как destrin) у млекопитающих (Ono 2007; Poukkula et al. 2011). По крайней мере, один cofilin белок существует во всех клетках эукариот (Ono 2007). Cofilins являются глобулярными белками с сердцевиной, состоящей из 4-х или 5 β-листков, окруженных 4 или 5 спиралями (Hatanaka et al. 1996; Ono 2007). Аминокислотные последовательности Cofilin и структура очень консервативны от человека до дрожжей (Ono 2007). Домен ADF-homology (ADF-H), содержащий последовательности, гомологичные cofilin, законсервирован в 5 семействах родственных актину белков, включая twinfilin, coactosin actin-binding protein 1 (ABP1), drebrin и glia maturation factor-like protein (GMF). Хотя эти белки содержат активности, связывающие actin или actin-related protein 2/3 (Arp2/3) комплексы, они не обладают актин деполимеризующей и разлагающей активностью за исключением дрожжевого twinfilin (Poukkula et al. 2011). Функция ADF-H домена разнообразится во время эволюции.
Cofilin преимущественно соединяется с ADP-связанным F-актином и дестабилизирует или разъединяет актиновые филаменты, приводя к деполимеризации коротких актиновых филамент (Fig. 1) (Pollard & Borisy 2003). Одной из ролей активности кофилина по разделке актина является продукция свободных актиновых мономеров для полимеризации (Pollard & Borisy 2003; Kiuchi et al. 2007, 2011). Cofilin способствует как разборке актиновых филамент, путем разделения, так и полимеризации актина, добавляя актиновые мономеры, приводя к усилению динамики актинового цитоскелета. Была предложена альтернативная модель, согласно которой активность по разборке у cofilin генерирует короткие филаменты и новые колючие концы для сборки актина (Fig. 1) (Ghosh et al. 2004; DesMarais et al. 2005; Oser & Condeelis 2009). Более того, было предположено, что высокая концентрация cofilin способствует nucleation актина, приводя к сборке актина (Andrianantoandro & Pollard 2006). Когда клеточная морфология изменяется, то cofilin способствует генерации актиновых мономеров, ядер, и новых колючих концов для сборки актиновых структур, таких как ламеллиподии, филоподии и стрессовые волокна, а также способствует обороту этих структур. Напротив, инактивация cofilin в ответ на внеклеточные сигналы замедляет оборот актина и вклад в сборку актиновых структур (Ohashi et al. 2011, 2014). Активность Cofilin регулируется с помощью нескольких молекулярных механизмов (Fig. 2). Cofilin инактивируется с помощью фосфорилирования N-терминального Serine-3 (Ser-3) остатка (Moriyama et al. 1996), и путем связывания phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) (Yonezawa et al. 1990; van Rheenen et al. 2007) и cortactin (Oser et al. 2009). Сходным образом, cofilin активируется с помощью actin-interacting protein-1 (Aip1) и cyclase-associated protein-1 (CAP1) (Fig. 2) (Moriyama & Yahara 2002; Ono 2003).

Figure 1. Model of the actin assembly and disassembly by cofilin.

Figure 2. The regulatory molecules of cofilin activity.

Уровень фосфорилирования cofilin регулируется с помощью ряда внеклеточных сигналов. Cofilin фосфорилируется по Ser-3 с помощью нескольких киназ. Главными киназами cofilin у млекопитающих являются белки семейства LIM-киназ, которые состоят из LIM domain containing protein kinase 1 (LIMK1), LIMK2, Testicular protein Kinase 1 (TESK1) и TESK2 (Arber et al. 1998; Yang et al. 1998; Sumi et al. 1999; Toshima et al. 2001a,b). Nck-interacting kinase (NIK)-related kinase (NRK) также фосфорилирует cofilin (Nakano et al. 2003) (Fig. 2). С другой стороны, cofilin дефосфорилируется с помощью членов семейства Slingshot (SSH) протеин фосфатаз, куда входят SSH1, SSH2 и SSH3 у млекопитающих (Niwa et al. 2002; Ohta et al. 2003; Mizuno 2013). Сообщалось, что haloacid dehalogenase, chronophin (CIN) и генеральные протеин фосфатазы, protein phosphatase1 (PP1) and protein phosphatase 2A (PP2A), также дефосфорилируют cofilin (Ambach et al. 2000; Gohla et al. 2005; Oleinik et al. 2010) (Fig. 2). Однако, несовсем понятно, как регуляция статуса фосфорилирования cofilin's с помощью NRK, CIN, PP1 и PP2 влияет на нормальные клеточные процессы.
Хотя cofilin обнаруживается у всех эукариот от дрожжей до человека, включая растения, ортологи генов LIMK и SSH не обнаруживаются у дрожжей, Caenorhabditis elegans (C. elegans), Dictyostelium, или у растений (Mizuno 2013). Регуляция фосфорилирования cofilin может быть использована в качестве механизма реорганизации актинового цитоскелета во время сложных многоклеточных процессов у некоторых высших животных.

Signal transduction-mediated phospho-regulation of cofilin


В ряде исследований были изучены функции LIMKs и SSHs, и соотв. их сигнальные пути во время реакции на внеклеточные сигналы. LIMK1 была открыта при клонировании c-Sea рецепторных тирозин киназ в библиотеке кДНК человека (Mizuno et al. 1994). Др. члены, LIMK2 (Nunoue et al. 1995; Okano et al. 1995), TESK1, и TESK2 (Toshima et al. 1995, 2001b) были клонированы с помощью low-stringency ДНК гибридизации. используя LIMK1 кДНК в качестве зогнда. LIMK белки содержат в тандеме, N-терминальные LIM домены, которые содержат мотивы Zn-пальчики, внутренний PDZ-подобный домен и C-терминальный протеин киназный домен (Fig. 3). (Okano et al. 1995). TESK белки родственны с LIMKs и содержат высоко гомологичный киназный домен LIMKs на N-конце и уникальный C-терминальный богатый пролином домен (Fig. 3) (Toshima et al. 2001b). LIMKs и TESKs фосфорилируют cofilin по Ser-3 и инактивируют его активность по связыванию актина. LIMK1 активируется и вносит вклад в формирование ламеллиподий или стрессовых волокон, подавляя передачу сигналов Rho. LIMKs фосфорилируются по консервативным остаткам треонина (Thr-508 в LIMK1 человека или Thr-505 в LIMK2 человека) в активационной петле киназного домена и активируются с помощью Rho-associated kinase (ROCK) (Maekawa et al. 1999; Ohashi et al. 2000; Sumi et al. 2001a), p21-activated kinase-1, -2, -4 (PAK1, PAK2 и PAK4) и myotonic dystrophy kinase-related Cdc42-binding kinase-α (MRCKα) (Edwards et al. 1999; Dan et al. 2001; Sumi et al. 2001b; Ahmed et al. 2008), которые являются нижестоящими эффекторами RhoA, Rac1 и Cdc42, соотв. (Fig. 4). LIMK1 активирует также нижестоящую передачу сигналов Ca2+. LIMK1 фосфорилируется по тому же самому Thr-508 остатку с помощью Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (CaMK) II и IV (Fig. 4) (Takemura et al. 2009; Saito et al. 2013). Идентифицирован и др. сайт фосфорилирования для активации LIMK1. LIMK1 фосфорилируется по Ser-323 остатку с помощью p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)-activated protein kinase-2 (MAPKAPK-2/MK2) стоящей ниже p38-MAP киназы в ответ на действие vascular endothelial growth factor (VEGF) в клетках сосудистого эндотелия (Fig. 4) (Kobayashi et al. 2006). BMP сигналы также регулируют активность LIMK1. Стимуляция Bone morphogenic protein (BMP)-4 и -7 активирует LIMK1 (Foletta et al. 2003; Lee-Hoeflich et al. 2004). Однако, две группы описывают противоположные механизмы. Одна группа сообщает, что связывание LIMK1 с цитоплазматическим C-терминальным доменом BMP receptor II (BMPRII) ингибирует LIMK1 и что LIMK1 активируется, когда освобождается от BMPRII благодаря связыванию BMP4 с BMPRII (Foletta et al. 2003). Вторая группа сообщает, что LIMK1 соединяется с цитоплазматическим доменом BMPRII и активирует нижестоящий Cdc42, если BMP7 активирует Cdc42 посредством BMP receptor I (Lee-Hoeflich et al. 2004) (Fig. 4). В обеих моделях, LIMK1 активируется с помощью стимуляции BMP. Напротив, LIMK1 инактивируется с помощью нескольких механизмов (Fig. 4). LIMK1 дефосфорилируется и инактивируется с помощью Slingshot-1 фосфатазы (Soosairajah et al. 2005). LIMKs инактивируются также путем связывания белка полярности Par-3 (Chen & Macara 2006), Nischarin (Ding et al. 2008), β-arrestin (Zoudilova et al. 2007), белка супрессии опухолей, LATS1 (Yang et al. 2004). Деградация LIMK1 с помощью ubiquitin-системы вызывается с помощью RING finger E3 ubiquitin ligase, Rnf6 (Tursun et al. 2005). Трансляция LIMK1 белка супрессируется после транскрипции с помощью микроРНК, miR-134 (Schratt et al. 2006) (Fig. 4).

Figure 3. Structures of human LIM-kinases (LIMKs), testicular protein kinases (TESKs), and slingshot protein phosphatases (SSHs).

Figure 4. The regulatory mechanisms of LIM-kinases (LIMKs), testicular protein kinases (TESKs), and slingshot protein phosphatases (SSHs).

TESK1 активируется с помощью интегрином обеспечиваемой клеточной адгезии с внеклеточным матриксом (Fig. 4) (Toshima et al. 2001a). Хотя TESKs преимущественно экспрессируются в семенниках, функции и регуляторные механизмы TESKs у млекопитающих неизвестны. Ортолог у Drosophila TESK, Center divider (Cdi), был проанализирован в отношении его роли в развитии.
Чтобы с точностью регулировать реорганизацию актинового цитоскелета, дефосфорилированте cofilin регулируется в пространстве и времени с помощью различных сигнальных механизмов. Slingshot фосфатаза кофилина первоначально была идентифицирована с помощью генетических исследований мутантов Drosophila с аномальной морфологией щетинок, волосков на крыльях и глаз (Niwa et al. 2002). Slingshot была названа за характерное раздвоение щетинок и волосков. Др. члены семейства, SSH2 и SSH3, были выделены у млекопитающих (Niwa et al. 2002). Белки SSH содержат законсервированный N-терминальный домен, домен протеин фосфатазы, который удаленно родственен MAPK phosphatases (MKPs). SSH1 и SSH2, но не SSH3, имеют длинный C-терминальный домен, содержащий регион, богатый Ser (Niwa et al. 2002; Mizuno 2013) (Fig. 3). Поскольку фенотипические отклонения у животных с мутациями в белках, связанных с актином, часто включают аномалии щетинок, slingshot идентифицирована в качестве фосфатазы кофилина. Три белка SSH млекопитающих дефосфорилируют cofilin по Ser-3 (Ohta et al. 2003). Среди SSHs млекопитающих механизмы активации и функционирования SSH1 охарактеризованы лучше всего (Mizuno 2013). SSH1 располагается на структурах, богатых F-actin, таких как стрессовые волокна, ламеллиподии и сети кортикального актина в культивируемых клетках. SSH1 обладает активностью связывания F-актина, а способность SSH1 дефосфорилировать cofilin строго активируется с помощью связывания F-actin (Nagata-Ohashi et al. 2004; Kurita et al. 2008). SSH1 активируется с помощью стимуляции хемоаттрактанта, SDF-1, посредством передачи сигналов Rac-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) в Jurkat T клетках (Nishita et al. 2005). Повышение Ca2+ проницаемости в клетках с использованием calcium ionophore активирует calcineurin, который индуцирует активацию SSH1 и дефосфорилирование cofilin (Wang et al. 2005) (Fig. 4). SSH1 также негативно регулируется с помощью фосфорилирования и путем связывания 14-3-3 белков (Fig. 4). Белок 14-3-3 соединяется с фосфорилированными Ser-937 и Ser-978 остатками в C-терминальном, богатом серином регионе SSH1 человека и ингибирует связывание SSH1 с актиновыми филаментами. Диссоциация 14-3-3 белка от SSH1 облегчает образование neuregulin-индуцированных ламеллиподий (Nagata-Ohashi et al. 2004). Protein kinase D (PKD) активируется с помощью hydrogen peroxide (H2O2) и фосфорилирует SSH1 по Ser-937 и Ser-978 стоящего ниже RhoA, вызывая полимеризацию актина (Eiseler et al. 2009; Peterburs et al. 2009). PKD фосфорилирует также законсервированный Ser-402 SSH1 внутри фосфатазного домена, инактивируя тем самым SSH1 (Barisic et al. 2011). Кроме того, PKD фосфорилирует и активирует PAK4, активируя тем самым LIMK1 (Spratley et al. 2011). Эти результаты показывают, что PKD является негативным регулятором SSH1 и повышает уровень фосфорилированного cofilin. Glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) фосфорилирует N-терминальный регион SSH2 и подавляет активность SSH2 (Tang et al. 2011). Когда neutrophil стимулируется с помощью хемоаттрактантов, GSK3β фосфорилируется и инактивируется с помощью PLCβ-PKC и PI3Kβ-Akt сигнальных путей, приводя к активации SSH2 (Tang et al. 2011) (Fig. 4). Эти находки подтверждают, что активность и локализация LIMKs/TESKs и SSHs скоординировано регулируют различные нижестоящие пути.

Expression patterns of cofilin, LIMKs, TESKs, and SSHs in rodent


Cofilin-1 и ADF экспрессируются почти во всех тканях и клетках. Соотношение количества cofilin-1 и ADF разное в каждом типе клеток и в каждый период развития (Vartiainen et al. 2002; Gurniak et al. 2005). Различия в соотношении коррелируют с разными фенотипами у дефицитных по cofilin и дефицитных по ADF мышей. Мышечного типа cofilin-2 специфически экспрессируется в скелетных и кардиальных мышцах (Ono et al. 1994). мРНК limk1 преимущественно экспрессируется в нервных тканях и limk1 и limk2 мРНК широко экспрессируются в различных развивающихся и взрослых тканях (Bernard et al. 1994; Okano et al. 1995; Proschel et al. 1995; Mori et al. 1997). мРНК tesk1 и tesk2 преимущественно экспрессируются в семенниках и обнаруживаются на более низких уровнях в др. тканях (Toshima et al. 1995, 2001b). мРНК ssh1, ssh2 и ssh3 широко экспрессируются в разных тканях в виде самостоятельных отличающихся паттернов (Ohta et al. 2003; Kousaka et al. 2008).

Roles of cofilin and its regulators in development


Изучение роли cofilin и его регуляторов в ремоделировании актинового цитоскелета во время развития модельных животных ведется активно в последнюю декаду. Получены мыши с нокаутными мутациями в cofilin-1 (Gurniak et al. 2005; Bellenchi et al. 2007; Garg et al. 2010), cofilin-2 (Agrawal et al. 2012), adf (Bellenchi et al. 2007; Kuure et al. 2010; Flynn et al. 2012), cap1-related cap2 (Peche et al. 2013), limk1 (Meng et al. 2002), limk2(Takahashi et al. 2002; Rice et al. 2012) и slingshot-3 (Kousaka et al. 2008). cofilin-1; adf (Bellenchi et al. 2007; Kuure et al. 2010; Flynn et al. 2012) и limk1; limk2 (Meng et al. 2004) двойные нокаутные мыши также были получены. Хотя были получены и ssh3 нокаутные мыши, эти животные не имели четких фенотипических отклонений и выглядели нормальными (Kousaka et al. 2008). Нокаутные мыши ssh1,ssh2, tesk1 и tesk2 не были описаны. Хотя семейство генов cofilin экспрессируется на высоком уровне и повсеместно во всех тканях, экспрессия limk1 наиболее высокая в развивающейся и взрослой нервной системе. Более того, гемизиготная делеция limk1у людей ассоциирует с дефектами пространственного распознавания у пациентов с синдромом William's (Frangiskakis et al. 1996).
Таблица 1 суммирует онтогенетические процессы с участием cofilin и его регуляторов у модельных животных .

Table 1. Summary of the functions of cofilin and its regulators in development



The functions of cofilin, LIMKs and SSHs in the development of neural tissues and cells


Нейриты, включая аксоны и дендриты, увеличиваются и развиваются в нервную ткань во время развития. Нейриты осуществляют это с помощью ростового конуса, кончика нейрита, который обладает динамичной структурой, богатой актином. Ростовой конус сходен в ведущим краем мигрирующей клетки, содержащей ламеллиподии, филоподии и контрактильные актомиозиновые волокна (Luo 2000). Пространственно-временная регуляция активности cofilin участвует в удлинении, ретракции и в поворотах нейритов (Fass et al. 2004). Др. важная функция нейритов заключается в формировании нервных связей посредством специализированных межклеточных соединений, наз. синапсами (Harris 1999). Дендритные шипы, которые грибоподобны, это богатые актином выпячивания постсинаптической мембраны, которые созревают и развиваются в ответ на нервные стимулы - вызывают реорганизацию актинового цитоскелета (Bosch & Hayashi 2012). Регуляция активности cofilin также участвует в образовании и функционировании шипов. Cofilin-1, не мышечного типа cofilin, и ADF экспрессируются по всему головному мозгу, но уровень ADF ниже уровня cofilin (Gurniak et al. 2005). Нокаутные по cofilin-1 являются эмбриональными леталями на ст. E9. Основные дефектами у cofilin-1 нокаутных мышей включают неспособность клеток нервного гребня мигрировать и неспособность нервной трубки закрываться, приводящие к отсутствию развития тканей. происходящих из нервного гребня (Gurniak et al. 2005). Т.е. активность cofilin важна для жизнеспособности клеток, то дефицитные по cofilin, эмбрионы д. частично восстанавливаться за счет перекрывающей функции ADF. Чтобы исследовать нервные функции cofilin-1 и ADF, генерировали специфичных для головного мозга кондиционных нокаутов по cofilin-1 и adf у мышей, используя nestin-Cre вызываемые делеции гена (Bellenchi et al. 2007). Делеция cofilin-1на ст. E10.5 в головном мозге вызывала подавление радиальной миграции нервных клеток в кору и супрессию удлинения нейритов кортикальными нейронами, приводя к отсутствию промежуточных кортикальных слоёв в головном мозге (Bellenchi et al. 2007). Хотя эффект от нокдауна adf в головном мозге не вызывал видимых дефектов, двойные cofilin/adf нокаутные мыши имели сходные и более тяжелые дефекты, чем нокаутные по cofilin-1 мыши (Bellenchi et al. 2007). Это указывает на то, что ADF может частично вносить вклад в развитие головного мозга.
Имеется несколько исследований роли cofilin в образовании дендритных шипов и в электрофизиологической функции шипов. Когда формируются шипы и развиваются в ответ на glutamate посредством NMDA рецепторов, то cofilin накапливается в шипах с помощью механизма, который зависит от β-arrestin 2 (Pontrello et al. 2012). Кондиционный нокаут cofilin-1 у мышей с использованием делеций гена, обусловленных CaMKII-Cre, нарушает как long-term potentiation (LTP), так и long-term depression (LTD), и увеличивает стабильность AMPA рецепторов в дендритах (Rust et al. 2010). Несмотря на тяжелые дефекты головного мозга у cofilin-1 нокаутных мышей, нокаут limk1 вызывает дефекты головного мозга средней тяжести. Нокаут limk1 нейронов гиппокампа ведет к образованию тонких шипов, а LTP, но не LTD, усиливается (Meng et al. 2002). Хотя нокаутные по limk2 мыши не обнаруживают отличительных дефектов головного мозга, limk1/limk2 двойные нокаутные мыши имеют сходные, но более тяжелые дефекты, чем limk1 нокаутные мыши (Meng et al. 2004). Эти результаты подтверждают, что собственно синаптическая пластичность нуждается не только в активности cofilin, но и в его регуляции с помощью фосфорилирования.
Описаны функции сигнальных путей, участвующих в phospho-regulation кофилина во время нейрального развития. Нокаут moma-gap, который является Cdc42 специфическим GTPase-activating protein (GAP), приводит к истощению коры и нарушению ветвления дендритов нейронов коры (Rosario et al. 2012). Cdc42 гипер активирован, а уровень фосфорилирования cofilin увеличен в moma-gap нокаутных кортикальных нейронах. Экспрессия не способных к фосфорилированию мутантного S3A-cofilin, в котором serine-3 замещен на alanine, восстанавливает ветвление дендритов в moma-gap нокаутных кортикальных нейронах (Rosario et al. 2012). Двойные pak1/pak3 нокаутные мыши имеют нормальный головной мозг у новорожденных животных, но ветвление дендритов нарушено во время постнатального развития мутантного головного мозга, это приводит к уменьшению размера головного мозга (Huang et al. 2011). Нокаут pak1 и pak3 снижает фосфорилирование cofilin и подавление дефосфорилирования cofilin устраняет аномальную морфологию шипов дендритов в мутантных нейронах гиппокампа (Huang et al. 2011). Вытягивание комиссуральных спинальных аксонов супрессируется, с помощью BMPs по срединной линии вентральной пластинки нервной трубки (Augsburger et al. 1999). Эта обусловленная BMP отталкивающая реакция комиссуральных аксонов подавляется экспрессией мутантного BMPRII, в котором сайт связывания LIMK1 делетирован в цитоплазматическом регионе или с помощью экспрессии постоянно активной формы S3A-cofilin (Phan et al. 2010). Поскольку BMP сигналы активируют LIMK1, то реакция отталкивания необходима для активации LIMK1 и инактивации cofilin (Yamauchi et al. 2013).
Функции cofilin и его phospho-регуляция проанализированы в деталях с использованием изолированных клеток нейронов. Избыточная экспрессия LIMK1 или нокдаун SSH1 в нейронах ганглиев дорсальных корешков (DRG) кур супрессируют вытягиваете ростовых конусов аксонов (Endo et al. 2003, 2007). Напротив, нокдаун или подавление LIMK1, с использованием коротких шпилечных РНК или синтетического S3-пептида, содержащего16 N-терминальных остатков cofilin плюс способствующую пенетрации последовательность пептидов, в нейронах DRG кур также супрессирует вытягивание ростовых конусов аксонов (Endo et al. 2003). Первый результат указывает на то, что инактивация cofilin вызывает избыточную полимеризацию актина и потерю динамики актинового цитоскелета, приводя к подавлению подвижности ростового конуса. Последний результат указывает на то, что супрессия фосфорилирования cofilin делает невозможной достаточную полимеризацию актина для образования ламеллиподий и филоподий и не позволяет актомиозиновым структурам в ростовых конусах генерировать контрактильные силы. Собственно регуляция активности LIMK1 и SSH1 необходима для нормального удлинения ростовых конусов, тогда как реакция отталкивания нейритов нуждается в активности LIMK1, но не SSH1. Semaphorin-индуцированный коллапс ростовых конусов супрессируется с помощью подавления активности LIMK1 с использованием S3-пептида (Aizawa et al. 2001). Доминантно-негативный мутант LIMK1, но не фосфатаза-инактивированный мутант SSH1 , супрессирует Nogo-66-индуцированный коллапс ростового конуса аксонов в DRG нейронах кур (Hsieh et al. 2006). Привлекающие и отталкивающие реакции ростовых конусов на сигналы наведения переключаются при изменении внутриклеточных условий, таких как внутриклеточные концентрации циклического GMP (Song et al. 1998). Ростовые конусы Xenopus спинальных нейронов привлекаются градиентом BMP7 во время 4-8 ч культуры, но после 20 ч, ростовые конусы начинают отталкиваться с помощью градиента BMP7 (Wen et al. 2007). Ингибирование активности LIMK1 или избыточная экспрессия доминантно-негативного LIMK1 супрессируют привлекаемые повороты нейронов, культивируемые между 4 и 8 ч, а избыточная экспрессия доминантно-негативного SSH1 предупреждает переключение с аттрактивных поворотов к репульсивным поворотам культивируемых нейронов на ст. 20 ч. Переключение в реакции поворотов нуждается в transient receptor potential (TRP) channel-Ca2+-calcineurin-SSH1 пути (Wen et al. 2007). Эти данные подтверждают, что баланс активности LIMK1 и SSH1 предопределяет направление поворотов ростовых конусов и что пространственно-временная регуляция LIMK1 и SSH1 необходима для формирования правильной сети нейронов. [Correction added on 26 May 2015, after first online publication: 'NGO-66' and 'calcinurin' have been corrected to 'Nogo-66' and 'calcineurin' in the above paragraph.]
Развивающиеся нервные клетки выпускают нейриты и обнаруживают рост дендритов или аксонов в ответ на нейротрофные факторы. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) вызывает увеличение количества первичных дендритов в кортикальных нейронах (McAllister et al. 1997). Истощение LIMK1 супрессирует это BDNF-зависимое увеличение посредством phospholipase Cγ (PLCγ)-Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IIβ (CaMKIIβ) пути (Saito et al. 2013). BMP индуцирует также увеличение количества первичных дендритов в кортикальных нейронах (Lee-Hoeflich et al. 2004). Это необходимо для связывания LIMK1 с BMPRII и для активации LIMK1 нижестоящего гена Cdc42, который активируется с помощью BMPRI после стимуляции с помощью BMP, как было описано выше. Эти результаты указывают на то, что дефосфорилирование cofilin облегчает удлинение и ветвление нейритов и дестабилизирует шипы путем увеличения динамики актинового цитоскелета, тогда как, напротив, фосфорилирование cofilin вызывает ретракцию и стабилизацию нейритов и шипов путем снижения динамики актинового цитоскелета. Пространственно-временная регуляция обоих сигналов необходима для нормального развития нервной ткани и формирования соотв. нервных цепочек (circuits).

The functions of cofilin, LIMKs and SSHs in the development of other tissues


Описана роль cofilin и его phospho-регуляторов в развитии разных органов и дифференцировке клеток. Шванновские клетки располагаются на аксонах и наращивают свой ведущий край, в результате увеличенная мембрана повтороно оборачивается вокруг аксона, образуя миелиновую оболочку (Fernandez-Valle et al. 1997). Нокдаун cofilin в Шванновских клетках делает их неспособными миелинизировать аксоны совместно культивируемых сенсорных нейронов и подавляет киназную активность LIMKs, супрессируя расположение Шванновских клеток на аксонах (Sparrow et al. 2012). Эти наблюдения подтверждают, что активность LIMKs необходима для фосфорилирования cofilin, что стабилизирует актиновый цитоскелет и облегчает расположение Шванновских клеток на аксонах. Эти наблюдения подтверждают также, что активация cofilin с помощью SSHs необходима для генерации динамики актинового цитоскелета, которая заставляет мембрану Шванновских клеток удлиняться и оборачиваться вокруг аксона.
Мышцы состоят из специализированных структур из актина и миозина II. Важность cofilin-2 в развитии скелетных мышц показана на людях с врожденной миопатией. Точковые мутации в cofilin-2 в семьях с пациентами с врожденной миопатией уменьшают количество cofilin-2 белка в мышцах и предупреждают, развитиe скелетных мышц (Agrawal et al. 2007). Чтобы исследовать роль cofilin-2 а развитии мышц были получены мыши с кондиционным нокаутом специфичного для мышц cofilin-2 (Agrawal et al. 2012). У нокаутных по cofilin-2 мышей, тело и мышцы одинаковы с диким типом при рождении, но эти мыши погибают на 8 день после рождения. У эмбрионов cofilin-1 экспрессируется в мышцах и может компенсировать делецию cofilin-2. Нокаутные по cofilin-2 мышцы обнаруживают баллонирующую дегенерацию миофибрилл, разрушение саркомеров и скопления актина, сходные с таковыми у пациентов с мышечной миопатией (Agrawal et al. 2012). Исследование мутантных C. elegans также показывает, что белок uncoordinated (UNC)-60B, ортолог мышце-специфичного cofilin, необходим для формирования миофибрилл в мышцах стенки тела (Ono et al. 1999). CAP1 родственный CAP2 также участвуют в развитии мышц. Нокаутные по cap2 мыши обнаруживают кардиальные дефекты, характеризующиеся дилятационной кардиомиопатией (Peche et al. 2013). Потеря CAS-1, который является у C. elegans ортологом CAP, вызывает дефект в сборке миофибрилл мышц стенки тела (Nomura et al. 2012).
Выявлена и роль cofilin-1 и ADF в развитии почек. Удлиненные и разветвлённые- эпителиальные канальцы, включая Вольфовы протоки и зачатки мочеточников, образуются в почке и почечные эпителиальные клетки формируют специализированные образования для обеспечения функции (Dressler 2006). И cofilin-1 и ADF экспрессируются в почках. Нокаут adf вызывает удвоение мочеточников у некоторых мутантных мышей (Kuure et al. 2010). Хотя ткане-специфичный нокаут cofilin-1 в Вольфовых протоках и зачатках мочеточников мышей не влияет на развитие морфологии почек, делеция cofilin-1 и adf полностью предупреждает развитие почек. И гемизиготная делеция гена adf и гомозиготная делеция гена cofilin-1 вызывают гипоплазию, дающую маленькие почки и неспособность к ветвлению уретрического зачатка (Kuure et al. 2010). Эти результаты показывают, что cofilin-1 и ADF выполняют перекрывающиеся роли в развитии почек. Активность cofilin важна для развития почек и минимальный уровень cofilin необходим для ветвления уретрических зачатков. Клетки подоциты, которые регулируют фильтрацию в клубочках, покрывают висцеральную сторону клубочков с переплетающимися, ступня подобными, богатыми актином отростками (foot process), приводя к образованию щелевой диафрагмы в качестве барьера фильтрации в межклеточных соединениях (Pavenstadt et al. 2003). Межклеточных соединений рецептор nephrin необходим для развития foot отростков. Nephrin соединяется с cofilin и PI3K, и использование nephrin вызывает дефосфорилирование cofilin посредством SSH1 , стоящего ниже PI3K (Garg et al. 2010). Специфичный для подоцитов нокаут cofilin-1 у мышей постепенно приводит к протеинурии в возрасте 3 мес., а foot отростки клубочков нарушаются после 6 мес. возраста. Дефект не проявляется вплоть до достижения мышами 3 мес. возраста, поскольку экспрессия ADF, которая может функционально замещать cofilin-1 в раннем развитии, постепенно снижается после рождения (Garg et al. 2010). У рыбок данио нокдаун cofilin также предупреждает развитие подоцитов в foot отростки и вызывает протеинурию (Ashworth et al. 2010). Т.о., активность cofilin важна для развития почек, включая образование эпителиальных трубок и ветвление для осуществления барьерной функции клубочков.
Установлена функция ADF в эпителиальных клетках роговицы во время развития глаз (Ikeda et al. 2003). Аномальное утолщение эпителия роговицы наблюдается при corneal disease-1 (corn1) у мутантных мышей. Позиционное клонирование идентифицировало Adf в качестве гена, вызывающего болезнь corn1. Мутация adf это миссенс мутация, при которой proline-106 замещается на серин. Активность ADF снижается с помощью мутации и накапливается F-actin в мутантных эпителиальных клетках роговицы, приводя к слепоте (Ikeda et al. 2003). Хотя нокаут limk2 не вызывает дефектов в нервной ткани или тяжелые дефекты в др. тканях, описываются умеренные дефекты в семенниках и дефекты коллективной миграции дермальных кератиноцитов век. Семенники limk2 нокаутных мышей меньше, чем у мышей дикого типа и сперматогенные клетки частично дегенерируют и они более чувствительны к тепловым стрессам при культивировании in vitro (Takahashi et al. 2002). Глаза мышей при рождении закрыты дермальной тканью век и LIMK2 экспрессируется в веках во время развития глаз. Веки новорожденных limk2 нокаутных мышей не закрыты из-за подавления коллективной миграции эпидермальных кератиноцитов (Rice et al. 2012). Перемещения клеток регулируются с помощью скоординированной экспрессии SSHs и LIMKs. Когда активность SSHs высокая, то динамика актинового цитоскелета увеличивается и вызывается клеточная подвижность. Напротив, когда активность LIMKs более высокая, то актиновый скелет стабилизируется и подавляется клеточная подвижность.

The function of cofilin and its regulators in Drosophila development


Одиночные гены кодируют cofilin (Twinstar, Tsr наз. у Drosophila), Aip1 (Fluer, Flr), CAP (Capulet, cap/Act up, Acu), LIMK, TESK (center divider, Cdi), and SSH в геноме Drosophila. Потеря функции мутантного cofilin, aip1, cap1, tesk и slingshot, но не limk, летально от эмбриональной до куколочной стадии (Benlali et al. 2000; Chen et al. 2001; Niwa et al. 2002; Eaton & Davis 2005; Sese et al. 2006; Chu et al. 2012). Тканевые дефекты на некоторых ст. развития были проанализированы с помощью термолабильного мутанта и индуцибельного мозаичного анализа у мутантов с потерей и избыточной функцией. Фенотипы мутантов обнаруживают тенденцию быть более тяжелыми, чем фенотипы мутантов млекопитающих из-за функциональной перекрываемости родственных генов, которая не столь сильна у Drosophila. Функции cofilin и его регуляторов у\в развитии Drosophila приведены в Table 1.

Neural tissue development and neurite growth


Роль cofilin и его регуляторов в нервной системе анализировали у мутантов Drosophila и в трансгенных экспериментах. У мутантов cofilin нарушена пролиферация клеток нейробластов и рост аксонов в грибовидном теле головного мозга Drosophila (Ng & Luo 2004). Slingshot необходим для удлинения аксонов, а мутация limk слабо подавляет рост аксонов. Ни Slingshot, ни LIMK не нужны для пролиферации клеток нейробластов в грибовидном теле. Экспрессия постоянно активного мутантного S3A-cofilin частично восстанавливает пролиферацию клеток нейробластов и рост акснов (Ng & Luo 2004). Эти результаты показывают, что активность cofilin важна для пролиферации нейральных клеток и роста аксонов и что собственно удлинение аксонов нуждается в phospho-регуляции cofilin. Исследования описывают молекулярный механизм, с помощью которого регуляция фосфорилирования cofilin регулирует рост аксонов. axon growth. Потеря sickie, ортолога у Drosophila mammalian microtubule-associated protein neuron navigator 2 (NAV2 MAP), супрессирует рост аксонов нервных клеток в грибовидном теле (Abe et al. 2014). Sickie, который является Rac эффекторным белком, необходим для снижения уровня фосфорилирования cofilin в развивающихся нейронах посредством механизма, который зависит от Rac, но не от Pak. Cofilin фосфорилирование увеличивается в нервных клетках мутантов sickie и индуцируется избыточная полимеризация actin, приводя к подавлению роста аксонов. Более того, дефект, вызываемый мутацией sickie устраняется с помощью избыточной экспрессии активных форм cofilin или slingshot, но не их неактивных форм (Abe et al. 2014). Эти результаты показывают, что рост аксонов нуждается в дефосфорилировании cofilin с помощью Rac-Sickie-slingshot пути, который действует параллельно с путем Rac-Pak-LIMK. [Correction added on 8 May 2015, after first online publication: 'stickie' has been corrected to 'sickie' in the above paragraph.]

Ovary development and oogenesis


Функция cofilin во время развития яичников и во время оогенеза исследовалась с помощью термолабильной мутации cofilin (Chen et al. 2001). Конвергентное схождение клеток овариальных терминальных филамент в третьем личиночном возрасте нарушено при подавлении cofilin. На более поздних стадиях миграция пограничных клеток в яйцевую камеру во время оогенеза также супрессирована (Chen et al. 2001), а экспрессия дикого типа и постоянно активного S3A-cofilin, но не доминантно негативного S3E-cofilin, в котором serine-3 замещен глутаминовой кислотой, устраняет дефект миграции мутантных пограничных клеток (Zhang et al. 2011). CAP1 участвует в развитии яйцевых камер. Потеря CAP1 вызывает скопления F-actin на апикальной стороне эпителиальных фолликулярных клеток в яйцевых камерах и подавление апикальной конструкции, приводя к пертурбациям полярности ооцита (Baum et al. 2000; Baum & Perrimon 2001).

Spermatogenesis


Поскольку cofilin необходим для формирования борозд дробления во время цитокинеза (Abe et al. 1996), неспособность к мейозу во время сперматогенеза является одним из основных дефектов у мутантов cofilin (Gunsalus et al. 1995). Хотя TESK преимущественно экспрессируется в семенниках млекопитающих, его функция во время сперматогенеза изучена недостаточно. Rac1 необходим для созревания спермиев во время сперматогенеза Drosophila. Гемизиготная делеция tesk усиливает стерильность самцов мух rac1. Мутантные спермии подвижны, но не могут вступать в семенные пузырьки. Эти результаты указывают на то. что путь Rac-TESK необходим для более поздниз стадий сперматогенеза у Drosophila (Raymond et al. 2004).

Development of epithelial morphogenesis


Собственно пространственно-временная регуляция реорганизации актинового цитоскелета необходима для , однако, я крыльев, глаз и эпителиальных тканей, а также для апико-базальной и планарной клеточной полярности (PCP). Летальность cofilin нулевых мутантов устраняется с помощью трансформации термолабильных cofilin мутантов (tsr139, tsrV27Q) (Blair et al. 2006). Восстановленные мутанты жизнеспособны при 18°C и у этих животных PCP крыльев, глаз и некоторых эпителиев нарушена. Frizzled и flamingo, которые являются PCP-связанными белками, располагаются неправильно в мутантных эпителиальных клетках. Экспрессия постоянно активной формы LIMK также нарушает PCP крыльев (Blair et al. 2006). Более того, активность cofilin необходима для элонгации и морфогенеза ретинальных клеток (Pham et al. 2008). Slingshot был первоначально выделен как ген, участвующий в морфогенезе щетинок. Фенотипы взрослых животных, которые были восстановлены для ssh нулевых мутантов, включают бифуркации и закрученность щетинок и волосков крыльев, нарушена организация омматидий и отсутствуют щетинки между омматидиями (Niwa et al. 2002). В др. работе показано, что истощение ssh или экспрессия tesk супрессирует генерацию дополнительных R7 фоторецепторов, которая вызывается трансформацией активной формы sevenless. TESK также необходим для апико-базальной полярности в улетках фоторецепторов (Sese et al. 2006). Фенотипы мутантов aip1был более слабыми, но сходны с теми, что наблюдаются у мутантов cofilin. Крыловые волоски у мутантов aip1 недоразвиты, небольшие или погнутые, и имеют аномальную полярность (Ren et al. 2007). Образование пред-кластеров омматидий также нарушения у мутантов aip1, и дефекты устраняются с помощью избыточной экспрессии cofilin (Chu et al. 2012). Мутации aip1 и cofilin индуцируют полимеризацию и стабилизацию актинового цитоскелета и снижают динамику актинового цитоскелета в эпителиальных клетках, приводя к подавлению реорганизации актинового цитоскелета и асимметричной локализации PCP белков. Отличающиеся фенотипы cofilin мутантов были также обнаружены у cap1 мутантов. Потеря функции cap1 вызывает избыточную полимеризацию актина в клетках глазного диска и предупреждает апикальные конструкции в их морфогенетических бороздах. Эти результаты подтверждают, что CAP1 супрессирует преждевременную дифференцировку фоторецепторов (Benlali et al. 2000).
Описаны взаимосвязи вышестоящих сигналов с phospho-регуляцией cofilin в эпителиальном морфогенезе. Избыточная экспрессия paxillin ( DpaxA у Drosophila), который участвует в формировании фокальных адгезий во время развития Drosophila, нарушает морфологию крыльев и ног посредством активации Rac и инактивации Rho. Эффекты экспрессии paxillin супрессируются с помощью экспрессии LIMK и TESK и с помощью дефектной мутации Slingshot и cofilin (Chen et al. 2005). Мут анты с потерей функции Rho имеют увеличенные объемы слюнных желез и дефект устраняется снижением экспрессии cofilin. Следовательно, cofilin и его регуляторы необходимы собственно для морфогенеза эпителиальных тканей для апико-базально и планарной клеточной полярности посредством реорганизации актинового цитоскелета.

Conclusion and perspective


Cofilin is primarily essential for the generation of actin cytoskeleton dynamics in cells. Properly controlled cofilin activity spatially and temporally regulates the dynamics of cell morphology and contributes to the morphogenesis of developing tissues and organs. Excess cofilin activity destabilizes various structures in cells such as pseudopodia, polarized cell structures, and cell-substrate and cell-cell adhesions. In contrast, cofilin defect results in the immobilization of the actin cytoskeleton and inhibits the proper morphological changes in cells. The various cofilin-related molecules and the signaling pathways involved in the spatiotemporal regulation of cofilin activity in development are described above. The differences in phylogenetic distribution of cofilin, Aip1, CAP, LIMKs, TESKs and SSHs suggest that the original functions of cofilin, such as the regulation of cell division, are critical for the cell viability, and that the phospho-regulation of cofilin was acquired for the more complex function of regulation of actin cytoskeleton reorganization during the evolution of more advanced multicellular organisms. Therefore, although the molecular mechanisms and the functions of cofilin and its regulators in actin filament dynamics in cellular processes of single cultured cells have been unraveled over decades, the roles of the regulation of cofilin activity in multicellular processes and in the morphogenesis in development remain unknown. One result that is still not well understood is why limk1 and limk2 knockouts in mice and flies did not cause severe defects even though depletion of LIMK1 inhibits cell migration, neurite extension, and neurite retraction in cultured cells. It remains unclear whether other molecules compensate for the lack of LIMKs. The functions of TESKs and SSHs in spermatogenesis and epithelial morphogenesis are also unclear. To further characterize these functions, further studies of the tissue- and the developmental stage-specific depletion of LIMKs, TESKs and SSHs are required. Other unknown functions of cofilin also need to be revealed. Recently, cofilin was shown to be involved in the Hippo pathway, which regulates organ size during development. The depletion of cofilin in mammary epithelial cells induces the nuclear import of YAP/TAZ, a key molecule of the Hippo pathway, and promotes cell proliferation through actin polymerization (Aragona et al. 2013). The regulation of cofilin activity in the cells of an organ may determine the volume of the organ by regulating cell number. Furthermore, recent advances in techniques that allow live imaging of cell migration, morphological changes, polarization, proliferation, and death in developing tissues will significantly advance the understanding of the functions of cofilin in development.