Внутри запутанной сети микротрубочек два семейства молекулярных моторных белков, сверхсемейство kinesin и dynein, работают совместно и вопреки др. др., чтобы транспортировать материал в обоих направлениях вдоль микротрубочек и поперечных связей, скользя и организуя микротрубочки во время образования веретена. Это высоко регулируемый процесс, где существенная пропорция моторного целенаправленного движения (targetting) и регуляции осуществляется посредством домена для груза. Однако, моторный домен сам по себе играет крупную роль в детерминации направления перемещения и кооперативности между моторами. Высокая сложность, возникающая в результате множественных типов моторов, транспортирующих множество грузов в обоих направлениях, нуждаются в утонченном и способном к адаптации уровню коммуникаций между моторами, чтобы гарантировать энергетически эффективный и своевременный транспорт. Эти коммуникации могут быть разорваны по трем главным причинам: коммуникации между головками моторов, когда они существуют в виде функциональных димеров, коммуникации между димерами в работающем ансамбле моторов и дальнодействующие коммуникации между моторами на одной и той же микротрубочке. Многие из этих коммуникаций, по-видимому, возникают после соединения с микротрубочками и в некоторых случаях происходят посредством самой сети (lattice) микротрубочек. Следовательно, знание структурных изменений, которые происходят, когда моторы взаимодействуют с микротрубочками, являются важными для понимания того, как осуществляются эти коммуникации. Наиболее выраженным структурным изменением, которое происходит после взаимодействия мотора и микротрубочки это снижение прирожденной симметрии макромолекулярного ансамбля по сравнению с той, существует в изолированных моторах и микротрубочках в растворе.

Сверхсемейство кинезинов включает к плюс-концу направляющие моторы, минус концу направляющие моторы и кинезины, которые регулируют динамику микротрубочек и могут быть подразделены на 14 подсемейств (Lawrence et al., 2004). Несмотря на эти различия, все кинезины содержат структурно законсервированный моторный домен, который включает сайты связывания микротрубочки и adenosine triphosphate (ATP), и они чаще всего оперируют как димеры. В целом, положение моторного домена внутри полипептидной последовательности предсказывает направление перемещения моторного белка. Моторы с N-терминальными моторными доменами обычно обладают поступательной (processive), направленной к плюс-концу подвижностью (Figure 1). Механистически направление перемещения связано со структурой шейки линкера, который состоит из приблизительно 15 класс-специфических аминокислотных остатков, которые располагаются непосредственно C-терминальнее по отношению к моторному домену у кинезинов, направляющихся к плюс-концу или располагаются непосредственно перед моторным доменом у моторов, направляющихся к минус концу (Sablin et al., 1998). Помимо противоположных направлений перемещения подсемейства кинезинов обладают разными характерными длинами пробега, скоростями, опрокидывающими силами и кооперативностью, отражающими разные функции этих моторов. Эти свойства обусловлены частично разными коммуникациями между головками молекулярных димеров, , однако, структурные и механистические детали во многих примерах всё ещё неясны.

Figure 1.

Topological organisation of plus- and minus-end-directed kinesins

Поступательные, направленные к плюс-концу кинезины, подвергаются действию асимметричного hand-over-hand механизма (Svoboda et al., 1993; Hackney, 1994; Hoenger et al., 1998; Hancock and Howard, 1999; Asbury et al., 2003; Kaseda et al., 2003; Yildiz et al., 2004). Для этого необходимо, чтобы головки действовали как функциональный димер, причем необходимо общение между головками, чтобы синхронизировать продвижение и предупреждать преждевременный отрыв от микротрубочки. Это, как полагают, происходит благодаря натяжению в шейке линкера, ориентации шейки линкера и благодаря химическому вентильному действию (gating) (Rice et al., 1999; Yildiz et al., 2008; Clancy et al., 2011). Напротив, семейство Kinesin-14, которое характеризуется движением, направленным к минус-концу не является поступательным (Vale and Fletterick, 1997; deCastro et al., 2000; Foster and Gilbert, 2000; Fink et al., 2009). Эти моторы используют механизм работы поршня (powerstroke), при котором одна головка непосредственно участвует в каждом цикле движения (Wendt et al., 2002; Endres et al., 2005); однако недавние исследования подтвердили функциональное значение и второй головки димера (Foster et al., 2001; Sproul et al., 2005; Kocik et al., 2009; Rank et al., 2012).

Полная модель механизма как направленных к плюс-концу, так минус-концу моторов нуждается в детальном знании структурных изменений в каждой головке во время взаимодействия с микротрубочками, одновременно с пониманием того, как состояние одной головки влияет на др., поскольку большинство циклов движения осуществляется, когда кинезины связаны с микротрубочкой. Сходным образом, понимание изменений, индуцированных в решетке микротрубочек c помощью кинезинов an understanding of the changes induced in the microtubule lattice by kinesins, необходимо для объяснения кооперативного связывания, оказываемого кинезинами, которые оперируют как ансамбли. Все эти биологические процессы вносят асимметрию в целом симметричную систему. Взаимоотношения между симметрией и асимметрией это суть данного обзора.

Asymmetry between kinesin heads

Хотя существуют некоторые доказательства, что даже в растворе кинезиновые димеры могут быть асимметричны (Stone et al., 1999; Kozielski et al., 2001), в первом приближении большинство кинезинов может быть рассмотрено как химически симметричные димеры в растворе, тогда как микротрубочки состоят из спирально симметрично расположенных тубулиновых гетеродимеров. Симметрия индивидуальных компонентов теряется в тот момент, когда макромолекулярные ансамбли взаимодействуют, поскольку кинезины не могут обладать спиральной симметрией, а микротубулярная решетка не соответствует оси симметрии второго порядка. В растворе две головки связаны c помощью двойной спирали и могут быть структурно эквивалентными, будучи связанными c помощью двойной ротационной оси параллельной двойной спирали и это состояние наблюдается в кристаллической структуре как для Kinesin-14 Ncd, так и Kinesin-1 (Figure 2) (Sablin et al., 1996; Kaan et al., 2011). Любая симметрия между головками в растворе скорее всего представляет собой среднее состояние, но это теряется в момент, когда одна из головок соединяется с микротубулярной решеткой. Каждая головка затем становится структурно уникальной, это имеет кинетические и подвижные последствия. У направленных к плюс концу процессивных кинезинов, это наиболее наглядно в кинетическом цикле, в котором состояние нуклеотида каждой головки контролируется не совпадающим по фазе состоянием др. нуклеотида (Rosenfeld et al., 2003; Klumpp et al., 2004). Для Kinesin-1 и Kinesin-7 CENP-E, асимметрия между состоянием нуклеотида моторных головок устанавливается в момент первой связи головки с микротрубочкой (Hackney, 1988; Ma and Taylor, 1997; Gilbert et al., 1998; Sardar and Gilbert, 2012). Асимметрия также проявляется сама по себе в более утонченной манере у прихрамывающих гомодимерных моторных конструкций.

Figure 2. Symmetry between motor domains in a dimer

На своем наиболее базовом уровне хромота гомодимерной моторной конструкции является результатом (доказательством) асимметричного hand-over-hand перемещения (Asbury et al., 2003; Higuchi et al., 2004). Хромота определяется как регулярная смена и разная скорость пошагового перемещения, как было показано в одном из молекулярных исследований, и строгое чередование в скорости указывают, что чередующиеся шаги являются механистически уникальными. Это исключает симметричную модель движения, как и симметричный или hand-over-hand или (подтягивание тыла) inchworm механизм. Дальнейшее доказательство асимметричного hand-over-hand механизма получено в двух ключевых экспериментах. Группа Gelles продемонстрировала, что микротрубочки не ротируют в ответ на перемещение Kinesin-1, будучи прикрепленными к покровному стеклу посредством торсионно жесткой двойной спирали (Hua et al., 2002). Этот результат не согласуется с симметричным hand-over-hand механизмом, поскольку последний нуждается в ротации на 180° с каждым шагом Kinesin-1. Yildiz et al. (2004) далее показали путем мечения каждой головки в димере Kinesin-1 с разными флюоресцентными зондами, что каждая головка Kinesin-1 делает шаг в 16 nm, что исключает inchworm модель. Дальнейшее исследование асимметричного hand-over-hand механизма было осуществлено (Fehr et al., 2009), показавшими, что хромота обусловлена тем, что каждая головка преодолевает разную вертикальную нагрузку во время цикла перемещения, как и предсказывалось (Xie et al., 2007). Это требует, чтобы один и тот же моторный домен испытывал две внутренне отличающиеся траектории во время цикла движения (Figure 3). Две траектории, осуществляемые иным пошаговым движением д. генерировать ротацию груза, чего не наблюдается.

Figure 3. Motor domain trajectories during asymmetric hand-over-hand mechanism

Хотя исследования хромоты были сконцентрированы на семействе Kinesin-1, все моторы, которые используют поступательный hand-over-hand механизм, испытывая асимметрию как в химическом состоянии каждой головки, так и в траектории, если груз не ротирует. Асимметрия наиболее выражена у членов семейства Kinesin-2 , которые существуют в виде гетеродимеров. Kif3a (Aizawa et al., 1992; Kondo et al., 1994) формирует гетеродимер или с мотором Kif3b (Yamazaki et al., 1995) или Kif3c (Muresan et al., 1998; Yang and Goldstein, 1998), и оба Kif3a гетеродимера, как полагают, подвергаются поступательному hand-over-hand движению (Muthukrishnan et al., 2009). Эволюционное развитие гетеродимерных кинезинов ставит вопрос, является ли головки оптимизированными, чтобы осуществлять максимальные перемещения при отличающихся вертикальных нагрузках. Искусственно сформированные гомодимерные Kif3a и Kif3b моторы обладали одинаковыми скоростями перемещений и длиной шага в гетеродимерами Kif3a/b (Muthukrishnan et al., 2009). Однако, Kif3b и Kif3c, но не Kif3a, содержали консервативный пролин в шейной области, которая считается регионом, чувствительным к изменениям в вертикальных нагрузках (Fehr et al., 2009). Имеются также законсервированные отличия последовательностей между Kif3a, Kif3b и Kif3c в регионе соединения с микротрубочками, особенно в петле 11, которая может влиять на сходство соединения с микротрубочками (Figure 4). Более детальные исследования одиночных молекул, кинетики и соединения с микротрубочками необходимы для выяснения роли этих законсервированных отличий в механизме гетеродимеризации в семействе Kinesin-2 .

Figure 4. Sequence conserved differences within heterodimeric Kinesin-2 motors

Подобно подсемействам Kinesin-1 и -2, моторные белки подсемейства Kinesin-5 обладают поступательным и направленным к плюс концу, асимметричным hand-over-hand движением (Valentine et al., 2006). Однако, гомодимерный Kinesin-5 член Eg5 обнаруживает очевидную асимметрию связывания adenosine diphosphate (ADP) в растворе, которая обнаруживает склонность слабого связывания ADP головкой, чтобы соединиться с микротрубочкой первой (Krzysiak et al., 2008). Это предполагает, что в растворе Eg5 головки димера д. быть структурно уникальными из-за асимметрии в сродстве с ADP. Это находится в строгом контрасте с гомодимерными головками Kinesin-1, которые неотличимы в растворе. Исследования с помощью Electron paramagnetic resonance (EPR) димеров и мономеров Eg5 выявили две отличающиеся популяции моторных головок, это предполагает сильно и слабо связывающие ADP головки и подтверждает идею о структурно асимметричном димере (Waitzman et al., 2011). Соотношение между этими двумя популяциями обнаруживаемые с помощью EPR постоянно как для мономерных, так и димерных моторов и головки, по-видимому, быстро переключаются между двумя состояниями (Waitzman et al., 2011). Итак, данные EPR вместе с 2/3-N-Methyl-anthraniloyl (MANT)-ADP титрованием из работы Krzysiak подтверждают, что внутри димера Eg5 головки свободно переключаются между состоянием сильного и слабого связывания ADP; однако, это энергетически неблагоприятно для обеих головок димера быть или в слабом или сильном состоянии связывания ADP в асимметричных головках внутри димера. EPR исследование также подтвердило, что это динамическое равновесие между головками теряется после связывания первой моторной головки с микротрубочкой, поскольку асимметрия задана (Waitzman et al., 2011).

Структурные исследования показали, что Eg5 обнаруживает новое положение шейного линкера, которые оказывается установленным перпендикулярно моторному домену, и необходимые остатки, чтобы стабилизировать эту конформацию, законсервированы только внутри подсемейства Kinesin-5 (Turner et al., 2001). Асимметричное связывание ADP в растворе может быть результатом новой установки позиции шейного линкера, поскольку эта конформация структурно препятствует образованию симметричности, связанной с растворимой фазой структуры, наблюдаемой у Kinesin-1 (Kaan et al., 2011). Предполагается, что одна головка внутри димера располагает перпендикулярно установленным шейным линкером, как это наблюдается в кристаллической структуре ADP (Turner et al., 2001); это ставит два вопроса: какова структура шеечного линкера во второй головке и какая конформация представляет собой сильное связывание ADP? Ответов пока нет.

Семейство Kinesin-14 из C-терминальных моторов также обладает функциональной и структурной асимметрией. Некоторые из них касаются гомодимеров, тогда как др. касаются гетеродимеров, где одна полипептидная цепь включает моторный домен, а др. несет домен, гомологичный моторному, который обладает кинезиновой складкой, но лишен сайта связывания нуклеотида (ADP). Обе головки, по-видимому, играют радикально отличающиеся роли в цикле перемещения, где на первый взгляд только одна головка кажется необходимой для генерации рабочего хода. В самом деле, искусственное получение гетеродимеров из хорошо изученного гомодимерного Kinesin-14 Ncd, может способствовать подвижности только при единственном моторном домене, а cryo-EM исследование подтвердило связывание только одной головки во время лишенного нуклеотида и Adenosine 5-(β , γ-imido) triphosphate (AMPPNP) состояния (Wendt et al., 2002; Endres et al., 2005; Cope et al., 2010). Пока налицо консервация последовательностей димера и кинетические исследования функциональной важности второй головки. Исследования растворов выявили кооперативные взаимодействия между головками Ncd (Foster et al., 1998; Mackey and Gilbert, 2000), где каждая головка обладает разным сродством к ADP в растворе. В принципе, это настраивает слабо связывающую ADP головку соединяться с микротрубочкой первой как у Eg5 (Foster et al., 2001). Кроме того, исследования гетеродимерных Ncd моторов, где одна головка была инактивирована, показали четкое взаимодействие между моторными доменами, которые влияют на ATPase активность и связывание с микротрубочками (Kocik et al., 2009).

Наиболее выраженным примером асимметрии является уникальный Kinesin-14 мотор Kar3, который действует как гетеродимер или с немоторным белком Cik1 или Vik1 (Page and Snyder, 1992; Page et al., 1994; Manning et al., 1999; Barrett et al., 2000). Неожиданно, Vik1, и предположительно Cik1, содержат гомолог C-терминального моторного домена, который сохраняет каноническую для кинезиновых моторов домен складку, но лишен сайта связывания ATP. На первый взгляд, это можно расценивать как подтверждение мнения, что вторая головка необходима с единственной целью, чтобы стабилизировать двойную спираль, и необходима для функционирования в качестве плеча рычага (lever arm), но что удивительно и Vik1 и Cik1 соединяются с микротрубочками более прочно, чем Kar3 (Allingham et al., 2007; Chen et al., 2011). Это означает необходимость второй головки, как было установлено, для Cik1 и Vik1 (Chen et al., 2011; Rank et al., 2012).

Во время цикла подвижности, Vik1 соединяется первым с микротрубочкой на соседней протофиламенте с использованием Kar3 в качестве нового сайта связывания микротрубочки, что не совсем ясно (Rank et al., 2012). Kar3 затем соединяется с микротрубочкой и высвобождает ADP. Во время состояния без нуклеотида, Vik1 диссоциирует от микротрубочки, позволяя тем самым Kar3 присоединять ATP и осуществлять рабочий ход подобно механизму, предложенному для Ncd's (Rank et al., 2012). Cik1, подобно Vik1, соединяется с микротрубочкой независимо от Kar3 (Chen et al., 2011). Однако, в отличие от Vik1, Cik1 нацеливает Kar3 на плюс конец микротрубочки, где такая локализация является критической для Kar3Cik1's полимеразной активности микротрубочки (Sproul et al., 2005; Allingham et al., 2007). Эти исследования подтверждают, что обе головки Kinesin-14 димера соединяются с микротрубочкой во время ADP состояния, используя два уникальных сайта связывания. Роль этого второго и нового сайта связывания микротрубочки непонятна, по-видимому, влияет на кооперативное связывание с микротрубочкой, как будет рассмотрено ниже. Эволюционно потеря сайта связывания ATP из Vik1 и мощная подвижность с одной головкой Ncd димеров указывает на то, что вторая головка непосредственно не нужна для продукции силы, но безусловно она также демонстрирует, что вторая головка играет роль, которая распространяется за пределы простого обеспечения структурной поддержки прилегающей двойной спирали.

Cooperative binding of kinesins to microtubules

In vivo микротрубочки существуют в форме B-lattice (решетки), где протофиламенты располагаются боками так, что соседний ?-tubulin обнаруживает аксиальное ротирование на 0.9 nm относительно соседней протофиламенты (McIntosh et al., 2009). Имеется единственное нарушение этой спиральной симметрии, наз. спай (seam), где две протофиламенты образуют A-lattice контакты и ?-tubulin смещаются закручиваясь на 4.9 nm. Симметрия внутри микротубулярной пространственной решетки в дальнейшем теряется после присоединения одиночного кинезинового мотора, короче говоря, ?,?-tubulin гетеродимеры так окружаются моторами, что не являются больше эквивалентами симметрии. Это событие сильно влияет на микроокружение кинезинами, связанными с тубулиновыми димерами и имеет следствием то, что последующие кинезины, приводят или к пертурбациям спиральной симметрии в подлежащей микротрубочке и/или приводят к контактам головками с уже связанным кинезином. ЭМ показала, что микротрубочки подвергаются структурным изменениям в ответ на насыщение связывания доменами кинезиновых моторов, при этом спиральная структура сохраняется (Krebs et al., 2004), так что можно предположить, что локальные структурные изменения будут происходить, когда присоединяется одиночная или небольшая группа головок. И Kinesin-1 и Kinesin-14 моторы обнаруживают кооперативное связывание с микротрубочками и эта кооперативность, по-видимому, не только влияет на сродство связывания последующих моторов, но и на их пространственную организацию. Пространственная координация, скорее всего, гарантирует, что все моторы внутри ансамбля будут позиционированы так, что каждый сможет нормально работать.

Kinesin-14 димеры in vivo действуют в виде ансамблей, чтобы осуществить направленную к минус концу подвижность, даже если индивидуальные моторы не являются поступательными (non-processive) (deCastro et al., 1999). Эффективное рекрутирование моторов, следовательно, важно для их биологической функции. Ncd димеры обладают сильным кооперативным связыванием в свободном от нуклеотида и AMPPNP состояниях, при которых одна головка связана с микротрубочкой, а вторая головка отделена, но привязана. Когда микротрубочки декорированы Ncd димерами в условиях ненасыщенности, то большинство микротрубочек или полностью декорированы Ncd головками, частично декорированы вдоль немногих протофиламент или не декорированы, как видно при ЭМ (Figure 5) (Wendt et al., 2002). Присутствие микротрубочек с комбинацией полностью декорированных протофиламент и голых протофиламент указывает на то, что такое кооперативное связывание распространяется в аксиальном направлении (Wendt et al., 2002).

Figure 5. A cryo-EM image of microtubules decorated with dimeric Ncd at sub-saturating ratios reveals a cooperative binding mechanism in the axial direction, along individual protofilaments

Очень сходная кооперативная декорация наблюдается также в случае Kinesin-14 гетеродимера Kar3Vik1 в свободном от нуклеотида и AMPPNP состояниях. Во время этих состояний Kar3, но не Vik1, как полагают, соединяется с микротрубочкой (Cope et al., 2010; Rank et al., 2012). В ADP состоянии, Vik1, как полагают, прочно связывается с микротрубочкой при этом Kar3 или связан или закрывает тубулиновый димер на соседней протофиламенте и в этих условиях не наблюдается поведения кооперативного связывания (Rank et al., 2012). Это подтверждает, что кооперативность прямо связана с присоединением Kar3. Интересно, что иммунофлюоресцентные исследования моторного домена Kar3 с помощью самообразования комплексов с AMPPNP продемонстрировало случайные связывания с микротрубочками, это указывает на то, что Vik1 необходим для кооперативного связывания Kar3. Напротив, Kar3Cik1·AMPPNP обнаруживает целенаправленное связывание с плюс концами микротрубочек, а Kar3Vik1·AMPPNP кооперативно связывается вдоль всей длины микротрубочки (Sproul et al., 2005; Allingham et al., 2007). Затем было предположено, что кооперативное связывание и целенаправленное присоединение к микротрубочкам не связаны исключительно с моторным доменом Kar3 , а скорее базируется на домене, гомологичном моторному, в Vik1 и Cik1 и/или прилегающей двойной спирали.

Присоединение направленного к плюс концу поступательного кинезинового мотора также влияет на связывание дополнительных моторов к микротрубочке, влияя на сродство связывания и пространственное расположение. Однако такое кооперативное поведение наблюдается только при близком или выше стехеометрического соотношения моторов к сайтам связывания на микротрубочках, это контрастирует с Kinesin-14 моторами. Более того, степень кооперативности варьирует между семействами. Напр., Eg5 димеры, которые оперируют in vivo в виде ансамблей, чтобы скользить вдоль анти-параллельных микротрубочек относительно др. др., обладают кооперативным связыванием с микротрубочкой, что определяется по профилю сигмовидного связывания при ко-седиментационных исследованиях с микротрубочками в AMPPNP и свободном от нуклеотида состояниях (Krzysiak et al., 2006). Напротив, Kinesin-1 димеры, скорее всего, работают индивидуально или как небольшие группы, когда транспортируют крупные грузы, такие как пузырьки или органеллы (Shubeita et al., 2008), и в соответствии с их биологическим поведением, кооперативное связывание с Kinesin-1 наблюдается только с помощью ЭМ, подтверждая, что такого класса моторы обладают более низкой кооперативностью, чем Eg5.

Kinesin-1 димеры обнаруживают кооперативное связывание с микротрубочками в AMPPNP состоянии, как показывают ЭМ исследования, сходное с таковым Kinesin-14 моторов (Vilfan et al., 2001). Однако в отличие от Kinesin-14s, которые соединяются с микротрубочками посредством одной головки при кооперативных условиях, обе головки Kinesin-1 присоединяются при кооперативных условиях и Kinesin-1 димеры иногда обнаруживают дополнительную 16 nm периодичность связывания, указывая тем самым, что когда обе головки димера связаны с одной и той же протофиламентой, они обладают поперечным центрированием вдоль микротрубочки. Это ведет к периодическому присутствию шеечного линкера каждые 16 nm (Hoenger et al., 1998; Thormahlen et al., 1998; Vilfan et al., 2001; Skiniotis et al., 2003). Поперечное центрирование, наблюдаемое для Kinesin-1 находится в полном контрасте с продольным (вдоль протофиламенты) кооперативным связыванием, наблюдаемым у Kinesin-14s (Figure 6). Механистически это согласуется с необходимостью для индивидуальных головок Kinesin-1 димера соединяться с той же самой протофиламентой, тогда как головки Kinesin-14, по-видимому, присоединяются к соседним протофиламентам (Rank et al., 2012). Это указывает на то, что Kinesin-14s и Kinesin-1s имеют разные механизмы обеспечения кооперативного связывания, при этом Kinesin-14s обладают сильным кооперативным связыванием, которое осуществляется прежде всего вдоль оси микротрубочки, а Kinesin-1s обладают очень слабым кооперативным связыванием, которое может включать поперечное центрирование вдоль протофиламенты.

Figure 6. Cooperative binding to the microtubule

Кооперативное связывание моторных доменов кинезинов с решеткой микротрубочки требует, чтобы связывание одного димера с микротрубочкой увеличивало шансы присоединения второго димера или посредством контактов между головками и/или благодаря изменениям решетки микротрубочки. Хотя дальнейшие исследования необходимы, чтобы различать между этими двумя механизмами, имеется несколько линий доказательств, которые подтверждают изменения решетки микротрубочек после присоединения кинезиновго мотора. ЭМ показывает, что микротрубочки подвергаются структурным изменениям в ответ на присоединение моторных доменов кинезинов (Krebs et al., 2004). Кроме того, присоединение Kinesin-1 димера к микротрубочке, по-видимому, склоняет дополнительные Kinesin-1 димеры присоединяться далее в направлении плюс конца микротрубочки (Muto et al., 2005) (Figure 6). Это отличается от кооперативного связывания, наблюдаемого с помощью ЭМ, где каждая головка мотора связана непосредственно рядом с другой головкой Kinesin-1. Кооперативность, наблюдаемая Muto et al. (2005) д. происходить благодаря изменениям в решетке микротрубочек, т.к. нет контакта между моторами.

Dynein

Семейство динеинов это второй большой класс молекулярных моторов для микротрубочек и эти моторы также используют АТФ, чтобы продуцировать направленную к минус-концу подвижность. Динеиновые моторы не имеют структурного сходства с кинезинами и вместо этого принадлежат к сверхсемейству ATPase associated with diverse cellular activities (AAA+). Каждая моторная головка состоит из шести AAA доменов, линкера и стебля, который содержит домен связывания с микротрубочками на своем кончике. Подобно большинству кинезинов, динеиновые моторы оперируют как функциональные димеры и обладают поступательным движущим механизмом со средним размером шага в 8 nm в направлении минус конца микротрубочки (Wang et al., 1995; King and Schroer, 2000; Mallik et al., 2004; Reck-Peterson et al., 2006). Однако шаги динеинов обнаруживают сильную изменчивость в отношении размера и направления и две головки мотора широко расставлены, чтобы оседлать соседние протофиламенты (Wang et al., 1995; Mallik et al., 2004; Reck-Peterson et al., 2006; Qiu et al., 2012). Кроме того, Dynein моторы, по-видимому, обладают очень незначительной координацией между головками мотора внутри димера, особенно когда моторные домены находятся близко др. к др. на решетке микротрубочки и вместо этого полагаются на высокое отношение коэффициента загрузки для поступательного движения (Shima et al., 2006; DeWitt et al., 2012; Qiu et al., 2012).

Подобно кинезиновым моторам, динеин также обладает наследуемой структурной и функциональной асимметрией между моторными доменами, при этом левый, как было установлено, наблюдением перемещением в направлении минус конца микротрубочек, моторный домен, скорее всего, является отстающей головкой, тогд как правый моторные домен, скорее всего, является ведущей головкой (DeWitt et al., 2012; Qiu et al., 2012). Однако кристаллическая структура динеинового мотора в растворе также обнаруживает псевдо двойную симметрию между моторными доменами (Figure 2), подтверждая, что динеины, подобно кинезинам осуществляют переход от конформации структурной симметрии в растворе к асимметричной конформации, как только соединяются с микротрубочками (Carter et al., 2011; Schmidt et al., 2012). Недавно рентгеновские кристаллические структуры доменов связывания с микротрубочками (Carter et al., 2008) при низком (Carter et al., 2011; Kon et al., 2011) и высоком (Kon et al., 2012; Schmidt et al., 2012) разрешении структур моторного домена начали детализировать с помощью структурного анализа механизм действия динеинов (Cho and Vale , 2012).

Соединение динеина с микротрубочкой происходит посредством небольшого глобулярного домена, прикрепленного к шести AAA доменам с помощью длинной ножки (Carter et al., 2008) и закрывает тот же самый сайт связывания тубулина как и кинезин (Mizuno et al., 2004). Динеин обладает более низким сродством связи с микротрубочками по сравнению с Kinesin-1 и это комбинирует с его способностью отступать вбок, чтобы позволить проходить кинезиновым моторам по микротрубочке (Mizuno et al., 2004).

Perspectives/conclusions

Сверхсемейство кинезинов снова демонстрирует важность симметрии и асимметрии в биологии. Асимметрия между моторными доменами является прирожденным следствием двукратного симметричного связывания мотора со спирально симметричной решеткой микротрубочки. Эта структурная асимметрия возникает в результате разного сродства связывания нуклеотида для каждой головки, когда две головки соединяются в решеткой и обеспечивают направленность перемещения. Асимметрия также присутствует в механизме hand-over-hand у поступательных направленных к плюс концу моторов, при этом каждая головка мотора подвергается уникальной траектории во время цикла подвижности и состояние нуклеотида головок удерживается несовпадающим по фазе. В Kinesin-14s, асимметрия ведет к циклу подвижности, при котором только одна головка непосредственно участвует в механизме рабочего хода (powerstroke), а др. головка, по-видимому, участвует в связывании с микротрубочкой, кооперативно, и в организации ансамбля. Асимметрия между динеиновыми головками менее понятна, но, по-видимому, способствует пространственной ориентации головок на микротрубочке во время цикла продвижения. Эти примеры четко показывают, что асимметрия универсально необходима для отличия и координации головок мотора во время цикла движения.

У к плюс концу перемещающихся моторов асимметричный hand-over-hand механизм наиболее вероятно действует, чтобы устранять увеличивающийся крутящий момент внутри двойной спирали (coiled coil) и ротацию груза по мере продвижения мотора. Однако этот механизм может также иметь целью поддержание состояния нуклеотида в двух головах несовпадающими по фазе, это является критическим для успешного поступательного движения, т.к. структурно гарантирует, что каждая головка является уникальной во время цикла движения. У Kinesin-14 моторов асимметрия между головками, по-видимому, позволяет двум головкам внутри димера осуществлять две полностью отличающиеся функции. Одна головка, по-видимому, управляет ATФ-обеспечиваемым рабочим ходом (powerstroke), тогда как др. головка действует, чтобы нацелить мотор на решетку микротрубочки.

Одним из наиболее примечательных следствий асимметрии внутри мотора и решетке микротрубочки является кооперативное связывание моторов. Кооперативное связывание с микротрубочкой ведет к удивительному потенциалу регуляции между моторами, т.к. такая кооперативность, по-видимому, не только затрагивает сродство связывания, но и также, как моторы пространственно расположены. Такое пространственное расположение, по-видимому, специфично для класса моторов и, скорее всего, гарантирует, что каждый мотор имеет такую позицию, чтобы они могли максимально исполнять свою функцию как группа. Kinesin-14 моторы обладают сильным кооперативным связыванием и располагают сами себя вдоль протофиламент в соответствии с их потребностью работать как ансамбль и соединяться с соседними протофиламентами. Напротив, поступательные направленные к плюс концу Kinesin-1 димеры выстраиваются по боковой линии вдоль микротрубочки, позволяя присоединиться второй головке к тубулиновому димеру вдоль той же самой протофиламенты и также обладают дальнодействующим кооперативным связыванием моторов далее по направлению к плюс концу микротрубочки.

Поперечное центрирование поступательных направленных к плюс концу кинезинов, скорее всего, не происходит при нормальных физиологических условиях, поскольку это кооперативное связывание наблюдается только при высоком стехиометрическом соотношении моторов к сайтам связывания микротрубочек. Кроме того, исследования одиночных молекул подтвердили, что две молекулы Kinesin-1, соединившиеся с микротрубочкой, не работают коллективно во время транспорта в виде sub-stalling сил (Leduc et al., 2007; Rogers et al., 2009; Jamison et al., 2010). Однако существуют доказательства, что Kinesin-1 моторы работают кооперативно под действием super-stall и ускоряющими груз силами и в таких случаях тесное пространственное расположение моторов является критическим для этой генерации кооперативных сил (Jamison et al., 2010; Jamison et al., 2012). Вполне возможно, что при таком обилии высоких сил, которые ведут к потере скорости ведущего Kinesin-1 мотора, дозволяются дополнительные моторы, чтобы 'нагнать' на решетке продвижение за счет локальной высокой концентрации моторов и при этих условиях поперечное центрирование может происходить благодаря тому, что моторы действуют коллективно, чтобы генерировать силы. Недавно было показано, что локальные взаимодействия, скорее всего, влияют на скорость пошагового перемещения и сродсво к микротрубочкам при тяжелых грузах на Kinesin-1 (Uppulury et al., 2012).

Ясно, что механизмы, с помощью которых Kinesin-1 и Kinesin-14 моторы кооперативно соединяются с микротрубочками, различны и это увеличивает провоцирующий (tantalising) потенциал для моторов, быть способными регулировать связывание моторов разных классов. Напр., связывание направленного к минус концу мотора Kinesin-14 не только рекрутирует связывание дополнительных моторов Kinesin-14, но и также редуцирует сродство связывания направленных к плюс концу моторов? Кроме того, связывание не моторных, ассоциированных с микротрубочками белков, влияет на связывание разных классов моторов? Имеются доказательства, что способ, с помощью которого микротрубочки стабилизируются (taxol, GMPCPP, 3R tau или 4R tau) ведет к различиям в скорости и поступательности Kinesin-1 (McVicker et al., 2011; Peck et al., 2011). In vivo, это д. создавать элегантный способ для регуляции подвижности или транспорта, когда разных классов моторы соединяются со сложной сетью микротрубочек. Кроме того, эта регуляция может служить для минимизации случаев, когда моторы передвигаются в разных направлениях и могут сталкиваться на микротрубочке, приводя к отсоединению, так что создается гарантия транспортировки груза в соотв. место в соотв. время с минимальными энергетическими затратами.

Functional asymmetry in kinesin and dynein dimersKatherine C. Rank, Ivan Rayment Biology of the Cell Volume 105, Issue 1, pages 1–13, January 2013

Functional asymmetry in kinesin and dynein dimers
Katherine C. Rank, Ivan Rayment
Biology of the Cell Volume 105, Issue 1, pages 1–13, January 2013