DKK1 был первоначально идентифицирован как индуктор эмбриональной головы у эмбрионов Xenopus и показан как секретируемый белок, который противодействует передаче сигналов Wnt [8], [19]. Белки плазматической мембраны, впервые идентифицированные как рецепторы DKK1 и DKK2, - это LRP5 и 6 (LRP5/6) [13] (рис. 2B). DKK1 и DKK2 имеют два богатых цистеином домена (CRD1 и 2), и было показано, что CRD2 непосредственно связывается с β-пропеллерными/EGF-подобными доменными повторами (3-4) LRP6 [13], [20] (рис. 2A). Показано, что N-концевая область DKK1, включая CRD1, также связывается с β-пропеллерным/EGF-подобным доменным повтором(1-2) [20]. DKK4 имеет общие CRD1 и 2, а CRD2 связывается с LRP6 [21]. Поскольку аминокислотные последовательности DKK3 отличаются от трех других DKK и не обладают способностью связываться с LRP6, DKK3 не ингибирует Wnt-сигнализацию [8]. Предсказанные структуры с помощью AlphaFold [22] действительно показывают, что DKK1 похож на DKK2 и немного отличается от DKK4, но разительно отличается от DKK3. Таким образом, похоже, что трехмерная структура DKK3 отличается от структуры других DKK. Это ставит вопрос об качественных способностях рецептора DKK3.

Вторыми идентифицированными рецепторами DKK1 являются Kremen1 и 2 (1/2), которые содержат внеклеточный kringle, чувствительный к стрессу компонент клеточной стенки (WSC) и домены комплемента C1r/C1s, Uegf, Bmp1 (CUB) и были идентифицированы методом экспрессионного клонирования как DKK1-связывающие белки [23-25]. Kremen2 образует комплекс с DKK1 и LRP6 и индуцирует эндоцитоз LRP6 из плазматической мембраны. CRD2 из DKK1, DKK2 и DKK4 имеет высокое сродство к внеклеточной области Kremen1 [21], [26]. Сообщалось, что мыши с одним мутантом Kremen демонстрировали нормальное формирование костной ткани и костную массу, в то время как мыши с двойным мутантом (Kremen1/2) демонстрировали увеличенный объем кости и параметры формирования избытка костной ткани. Кроме того, у мышей с тройным мутантом (Kremen1, Kremen2 и DKK1) наблюдался усиленный рост эктопических пальцев, что указывает на генетическое взаимодействие DKK1 и Kremen во время развития конечностей [27].

Третьим идентифицированным рецептором является CKAP4, который был обнаружен как DKK1-связывающий белок в плазматической мембране с помощью иммунопреципитации и масс-спектрометрического анализа [28]. CKAP4 в основном локализован в эндоплазматическом ретикулуме (ER), но небольшое его количество (менее 10% от общего количества) перемещается к плазматической мембране легочных, сосудистых гладких мышц и эпителиальных клеток мочевого пузыря [17]. CKAP4 связывается со всеми членами семейства белков DKK через их CRD1 [29]. Хотя на сегодняшний день не выявлено соответствующего рецептора клеточной поверхности для DKK3, CKAP4 может функционировать как рецептор DKK3. Таким образом, DKK3 больше не является сиротским лигандом, о чем будет сказано ниже.

Эти три рецептора DKK1 являются однопроходными трансмембранными белками, и их внеклеточные области связываются с DKK1 со значениями Kd 0,01-0,4 нМ [13], [21], [28], [30], хотя они не имеют структурного сходства (рис. 2A).

CKAP4 представляет собой трансмембранный белок II типа с внутриклеточной областью (aa 1-105), трансмембранной областью (aa 106-127) и внеклеточной областью (aa 128-602) [31] (рис. 2B). Предсказанная вторичная структура внеклеточной области CKAP4 состоит из доменов coiled-coil (aa 127-214 и aa 361-460) с лейциновой молнией (aa 468-503), за которой следует домен coiled-coil (aa 533-602) [32]. Область, расположенная ближе к С-концу, имеет более случайную и рыхлую структуру. Домен coiled-coil имеет склонность к олигомеризации и, как правило, участвует в межмолекулярных взаимодействиях, что позволяет предположить, что внеклеточная область CKAP4 образует олигомеры более высокого порядка.

Во внутриклеточной области имеется только один остаток цистеина, в аминокислотном положении 100 (Cys100). CKAP4 обратимо пальмитоилируется по Cys100 с помощью пальмитоил ацилтрансферазой DHHC2 [33], [34]. Пальмитоилирование CKAP4 усиливается под действием brefeldin А [35], который блокирует транспорт белков из ER и приводит к разборке аппарата Гольджи, что позволяет предположить, что CKAP4 пальмитоилируется в ER. Кроме того, эффективность пальмитоилирования CKAP4 усиливается в плазматической мембране под действием DHHC5 [36]. Однако непальмитоилированный CKAP4C100S, в котором Cys100 мутирован в Ser, также перемещается к плазматической мембране [36], что позволяет предположить, что пальмитоилирование не является необходимым для локализации CKAP4 в плазматической мембране.

CKAP4 был первоначально обнаружен как белок, в значительной степени ограниченный ER и прикрепленный к шероховатой части ER микротрубочками [37]. Внеклеточная область соответствует люминальной области в ER. Обычно считается, что белки, находящиеся в ER, либо никогда не покидают его и статически удерживаются, либо извлекаются из промежуточного компартмента ER-Гольджи (ERGIC) с помощью ретроградного транспорта, опосредованного комплексом белка оболочки (COP) I. Оба варианта обычно называют ретроградным транспортом ER. Оба механизма обычно называют механизмами удержания ER [38], [39]. CKAP4 покидает ER для перемещения в Гольджи, и большая его часть возвращается в ER из Гольджи через ERGIC (неопубликованные данные H. Yamamoto и A. Kikuchi). Небольшое количество CKAP4 перемещается к плазматической мембране из сети транс-Гольджи вместе с аннексином A2 (неопубликованные данные H. Yamamoto и A. Kikuchi). Аннексин A2 (также называемый p36, кальпактин I и липокортин II) играет роль в экзоцитозе, эндоцитозе и транспортировке мембран [40]. Взаимодействие аннексина A2 с CD44 также необходимо для формирования CD44-содержащих липидных плотиков и передачи сигнала [41]. В сочетании с наблюдением, что аннексин A2 часто избыточно экспрессируется в широком спектре раковых клеток [42], примечательно, что CKAP4 в плазматической мембране может формировать новый тип противораковой передачи сигналов с DKK, как описано ниже.

Как и CKAP4, LRP6, как известно, пальмитоилирован. Было показано, что пальмитоилирование LRP6 происходит по Cys1394 и Cys1399 в ER; однако, в отличие от CKAP4, недостаток пальмитоилирования LRP6 приводит к удержанию LRP6 в ER [43], что позволяет предположить, что такое пальмитоилирование необходимо для его перемещения из ER в плазматическую мембрану. И LRP6, и CKAP4 в первую очередь локализованы в липидных плотиках плазматической мембраны, и пальмитоилирование необходимо для локализации CKAP4 в таких липидных плотах [15], [36].

DKK1 вызывает де-пальмитоилирование обоих рецепторов, и депальмитоилированные LRP6 и CKAP4 перемещаются в не-липидные плотики, где они эндоцитируются через клатрин- и Rab5-зависимый путь, а затем рециркулируют в плазматическую мембрану через Rab11 [15], [36] (рис. 3A). Ацил-протеин тиоэстеразы (APT)1 и 2, которые являются хорошо известными депальмитоилазами [44], вовлечены в DKK1-индуцированное депальмитоилирование CKAP4 AKT-зависимым способом. Однако механизм, лежащий в основе депальмитоилирования LRP6 под действием DKK1, остается невыясненным. Таким образом, LRP6 и CKAP4 перемещаются по сходным путям транспортировки в ответ на DKK1 в плазматической мембране, в то время как подробный путь транспортировки Kremen под действием DKK1 в настоящее время неизвестен.



Fig. 3. The DKK1-CKAP4 axis. A: DKK1 receptors CKAP4 and LRP6 are localized to lipid rafts in the plasma membrane. The localization of the receptors to lipid rafts requires their palmitoylation. The binding of DKK1 to CKAP4 induces the formation of a complex between CKAP4 and the p85α subunit of phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K), which subsequently promotes cell proliferation through AKT activation. After AKT activation, CKAP4 is depalmitoylated by APTs. Depalmitoylated CKAP4 moves out of lipid rafts to non-lipid rafts where depalmitoylated CKAP4 is internalized in a clathrin- and Rab5-dependent manner. Internalized CKAP4 is recycled to the plasma membrane in a Rab11-dependent manner. In response to DKK1, LRP6 also moves to non-lipid rafts, and is internalized and recycled in a similar way to CKAP4, although the mechanism of depalmitoylation is unknown. APT, acyl-protein thioesterase. B: When DKK1 binds to both LRP6 and CKAP4 through different CRDs, LRP6 enhances DKK1-dependent activation of the DKK-CKAP4 pathway, thereby promoting cancer cell proliferation, rather than when DKK1 binds to CKAP4 alone.

Одной из потенциально важных ролей липидных плотов на поверхности клеток является регуляция трансдукции сигналов, включая сигналы Т-клеточного рецептора, EGF, Ras и Hedgehog [45]. Связывание DKK1 с CKAP4 вызывает образование комплекса между богатым пролином доменом CKAP4 и SH3-доменом субъединицы p85 PI3-киназы в липидных плотиках плазматической мембраны, что приводит к активации AKT и пролиферации клеток (рис. 3А).

CRD1 из DKK1 связывается с CKAP4, а CRD2 взаимодействует с LRP6 и Kremen. Сообщалось, что DKK1, LRP6 и Kremen1/2 образуют тройной комплекс, усиливающий активность DKK1 по ингибированию Wnt-сигнализации [21]. Однако неясно, может ли CRD2 одной молекулы DKK1 одновременно связываться с LRP6 и Kremen1/2. DKK1 также образует тройной комплекс с LRP6 и CKAP4 через свои CRD2 и CRD1, соответственно. Теоретически, DKK1 может одновременно активировать путь вниз по течению CKAP4 (путь DKK1-CKAP4) и ингибировать путь LRP6 (путь β-катенина) в одной и той же клетке, но экспериментальные данные показывают, что связывание DKK1 с LRP5/6 усиливает путь CKAP4-PI3K-AKT (рис. 3B). DKK1 может предпочтительно активировать AKT через передачу сигналов DKK1-CKAP4, а не ингибировать сигнализацию Wnt/β-катенин; в результате DKK1 способен стимулировать пролиферацию клеток, когда CKAP4 и LRP6 экспрессируются в плазматической мембране вместе.

В соответствии с тем, что высокий уровень экспрессии DKK1 в опухолевой ткани ассоциируется с агрессивностью при различных видах рака, избыточна экспрессия CKAP4 также обнаруживается в 50-80% опухолевых поражений при раке поджелудочной железы, легких и пищевода, в то время как в неопухолевых тканях она минимальна [28], [29], [46]. Примечательно, что пациенты, позитивные как по DKK1, так и по CKAP4, имеют плохой прогноз и сниженную безрецидивную выживаемость по сравнению с пациентами, с позитивными по DKK1 или CKAP4 или негативными по обоим показателям.

Однако были опубликованы сообщения, противоречащие этим выводам при внутрипеченочной холангиокарциноме (ICC) ) и гепатоцеллюлярной карциноме (HCC). Например, было установлено, что экспрессия CKAP4 положительно коррелирует с размером опухоли, но отрицательно - с отдаленными метастазами и метастазами в лимфатические узлы при ICC [47]. Пациенты с ICC с низкой экспрессией CKAP4 имеют более короткую общую выживаемость и более высокую частоту рецидивов, что позволяет предположить, что CKAP4 действует как опухолевый супрессор и является благоприятным прогностическим маркером. В другом исследовании сообщалось, что у пациентов с HCC с высокой экспрессией CKAP4 общая выживаемость и период выживаемости без проявлений болезни были выше, чем у пациентов с низкой экспрессией [48]. Однако уровень экспрессии DKK1 в этих исследованиях не изучался. Когда уровни экспрессии DKK1 и CKAP4 были исследованы иммуногистохимически у 415 пациентов с HCC, то случаи, положительные по обоим показателям, показали худший прогноз по сравнению с другими случаями (неопубликованные данные S. Matsumoto и A. Kikuchi). Таким образом, одновременная экспрессия DKK1 и CKAP4, лиганда и рецептора, играет критическую роль в агрессивности рака.

Важность DKK1 в процессе развития связана с созданием им петли отрицательной обратной связи для точной настройки Wnt-сигнализации. Его TCF4-связывающий сайт расположен в 5'-нетранслируемой области рядом с сайтом начала транскрипции гена DKK1, и экспрессия Dkk1 напрямую регулируется активацией передачи сигналов Wnt [49] (рис. 4). Поэтому увеличение экспрессии DKK1 в раковых клетках может быть результатом аберрантной активации передачи сигналов Wnt. Однако неясно, почему экспрессия DKK1 увеличивается в раковых клетках, в которых Wnt-сигнализация не активирована аберрантно. Одна из возможностей заключается в участии других сигнальных путей [50], [51].



Fig. 4. The mechanism of DKK1 expression. Right: The binding of Wnt ligands to Wnt receptors (Frizzled and LRP5/6) activates Wnt signaling to promote DKK1 expression via TCF4-binding to the 5?-untranslated region of the DKK1 gene. Left: The activation of ERK and AKT pathways in cancer cells induces FOXM1 expression. FOXM1 directly binds to the enhancer region of the DKK1 gene and stimulates DKK1 expression. Then, secreted DKK1 binds to CKAP4 in the plasma membrane, which activates the PI3K-AKT pathway to further increase DKK1 expression through FOXM1. Thus, DKK1 and FOXM1 enhance their expression mutually in a positive feedback loop and promote tumor cell proliferation.

Секвенирование РНК показало, что экспрессия транскрипционного фактора forkhead box M1 (FOXM1) и его генов-мишеней согласованно колеблется с экспрессией DKK1 в клетках рака поджелудочной железы [52]. FOXM1 является членом семейства белков forkhead box, которые имеют крылатую спираль ДНК-связывающего домена и являются важными регуляторами развития животных, дифференцировки и пролиферации клеток [53]. Избыточная экспрессия FOXM1 наблюдается при широком спектре раковых заболеваний, и он активно участвует в развитии опухоли, стимулируя пролиферацию через экспрессию генов, участвующих в регуляции клеточного цикла и клеточной пролиферации [54].

Исследование показало, что нокдаун DKK1 привел к снижению экспрессии FOXM1 в клетках рака поджелудочной железы и пищевода и наоборот в обеих раковых клетках [52]. Ингибирование либо пути DKK1-CKAP4-AKT, либо пути ERK подавляло экспрессию FOXM1, а одновременное ингибирование обоих путей оказывало синергетический эффект (рис. 4). Кроме того, обнаружено, что сайт связывания FOXM1 присутствует в 5'-нетранслируемой области около 2 kb от гена DKK1, и истощение этой области из генома снижает экспрессию DKK1 и пролиферацию раковых клеток. Кроме того, у больных раком поджелудочной железы и пищевода, одновременно экспрессирующих DKK1 и FOXM1, прогноз хуже, чем у тех, кто экспрессирует либо DKK1, либо FOXM1 [52]. Таким образом, DKK1 и FOXM1 создают новую петлю положительной обратной связи, способствующую пролиферации раковых клеток.

Экспрессия DKK1 подвергается эпигенетической регуляции и замалчиванию при некоторых типах рака. Метилирование ДНК - хорошо известный эпигенетический признак, связанный с опухолеобразованием в различных видах рака, включая рак пищевода и толстой кишки, а также лейкемию, и экспрессия DKK1 снижена в этих видах рака [55-57]. Кроме того, polycomb и GATA связываются с промотором DKK1 и подавляют его экспрессию [58], [59]. Было также показано, что EGF индуцирует экспрессию DKK1 в HCC через фосфорилирование и ацетилирование гистона H3 [51]. Таким образом, существует несколько механизмов, которые могут регулировать экспрессию DKK1. Таким образом, разнообразные сигнальные механизмы, как способствующие развитию опухоли, так и подавляющие ее, могут регулировать экспрессию DKK1.

DKK3 демонстрирует структурное расхождение с остальными представителями семейства DKK [8]. Общая гомология белковых последовательностей между DKK1, DKK2 и DKK4 составляет около 50%, а между DKK3 и другими DKK - менее 40% [60]. Кроме того, домен soggy присутствует только в DKK3, но не в других белках DKK. Более того, в отличие от DKK1, DKK2 и DKK4, DKK3 не взаимодействует с LRP6 и не противодействует Wnt-сигнализацию [8], [13]. Таким образом, DKK3 может обладать уникальными функциями, не зависящими от Wnt-сигнализации.

Сообщалось, что мыши с нокаутом DKK3 не проявляют явного фенотипа на этапах развития, но отличаются по гематологическим и иммунологическим параметрам, а также по легочной вентиляции [61]. В другом исследовании было обнаружено, что DKK3 снижен в иммортализованных клетках человека [62], а его экспрессия часто подавляется гиперметилированием промотора в раковых клетках человека, включая высокоагрессивный базальный рак молочной железы [63], HCC [64] и меланому [65]. Более того, DKK3 последовательно подавляет пролиферацию раковых клеток при эктопической избыточной экспрессии в различных типах раковых клеток [63]. В этом контексте DKK3, по-видимому, функционирует как опухолевый супрессор.

Напротив, сообщалось также, что DKK3 может выполнять функции, способствующие развитию опухоли. Например, он избыточно экспрессируется в тканях аденокарциномы пищевода и плоскоклеточной карциномы полости рта (СКК), способствуя пролиферации и миграции раковых клеток [66], [67]. Также было показано, что DKK3 защищает клетки сетчатки от про-апоптотических стимулов [68] и поддерживает де-дифференцированное и пролиферативное состояние клеток рака поджелудочной железы [69]. Хотя механизмы, лежащие в основе этих опосредованных DKK3 эффектов, не изучены, его функции способствующие существованию и клеточной пролиферации могут быть опосредованы взаимодействием с CKAP4 и последующей активацией AKT.

DKK3 экспрессируется при ~50% опухолевых поражений при плоскоклеточной карциноме пищевода (ESCC) [29]. DKK1 также экспрессируется в ~60% таких случаев, но поражения, в которых он экспрессируется, отличаются от поражений, экспрессирующих DKK3. Одновременная экспрессия DKK1 или DKK3 с CKAP4 ассоциируется с плохим прогнозом. Анти-CKAP4 антитела ингибируют связывание DKK3 с CKAP4 и образование ксенотрансплантата опухоли, индуцированной клетками ESCC. Белок p63, связанный с p53 транскрипционный фактор, часто усиливающийся в ESCC [29], связывается с 5'-нетранслируемой областью гена DKK3. Нокдаун p63 снижает экспрессию DKK3 в клетках ESCC. Более того, экспрессия ΔNp63?, активированного мутанта p63, и DKK3 увеличивает размер опухолевидных органоидов пищевода. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что ось DKK3-CKAP4 может служить новой молекулярной мишенью для ESCC. При ESCC различные транскрипционные факторы, FOXM1 и p63, индуцируют экспрессию DKK1 и DKK3, соответственно, и оба лиганда действуют на CKAP4, стимулируя пролиферацию раковых клеток.

DKK2 и DKK4 также связываются с LRP6 через CRD2 и ингибируют передачу сигналов Wnt, подобно DKK1 [13], [14], [21]. Однако DKK2 способен активировать каноническую передачу сигналов Wnt клеточно-зависимым образом [8]. Было показано, что мыши с нулевым мутантом DKK2 жизнеспособны, но слепы из-за полной трансформации эпителия роговицы в стратифицированный эпителий [70]. Что касается нокаутных мышей DKK4, то в настоящее время нет никакой информации. Таким образом, физиологические функции DKK2 и 4 остаются неясными.

Хотя DKK2 и DKK4, как сообщается, едва обнаруживаются в различных тканях и линиях раковых клеток [29], избыточная экспрессия DKK2 была зарегистрирована при саркоме Юинга [71] и колоректальном раке (CRC) [72], [73]. DKK2 также обнаруживается при раке поджелудочной железы, и было установлено, что его повышенная экспрессия предсказывает плохой прогноз для пациентов [74]. Механизм, лежащий в основе повышения уровня DKK2 при этих видах рака, остается неясным, но DKK2 может стимулировать пролиферацию раковых клеток путем связывания с CKAP4. В отличие от этого, экспрессия DKK2 снижена при раке желудочно-кишечного тракта [56], раке почек [75] и раке яичников [76]. В этих раковых клетках обнаружено гипер-метилирование промотора гена DKK2, а в нормальных клетках DKK2 может подавлять пролиферацию и миграцию клеток.

Сообщалось, что DKK4 повышается при колоректальном раке [72], [77]. Хотя в этих исследованиях не анализировалась связь между экспрессией DKK4 и клиническим исходом, вполне вероятно, что сигнал DKK4 связан с другими путями, помимо Wnt-сигнализации, поскольку 1α,25-дигидроксивитамин D₃ (1,25 (OH)₂D₃) подавляет экспрессию DKK4 в CRC [77]. 1,25(OH)₂D₃ проявляет противоопухолевый эффект во многих типах раковых клеток [78]. Поскольку экспрессия мРНК рецептора витамина D (VDR) и DKK4 обратно коррелирует, а VDR напрямую связывается с промотором гена DKK4 [77], 1,25(OH)₂D₃ может негативно регулировать транскрипцию DKK4. Генетические и эпигенетические изменения гена транскрипционного фактора AP-2 epsilon (TFAP2E) часто наблюдаются при CRC, а DKK4 является мишенью для нисходящего потока TFAP2E [79]. TFAP2E-зависимая химиорезистентность опосредуется через DKK4. Кроме того, когда клетки CRC вводили иммунодефицитным мышам через хвостовую вену, опухоли печени формировались после образования первичных опухолей желудочно-кишечного тракта [80]. DKK4 высоко экспрессируется в метастазах печени, а химиорезистентность при метастазах печени выше, чем при первичных опухолях. Таким образом, накапливаются доказательства того, что экспрессия DKK2 и DKK4 изменяется при различных типах рака. Однако для выяснения основных механизмов, посредством которых DKK2 и DKK4 участвуют в образовании опухолей, необходимы дополнительные исследования.

Серия экспериментов, касающихся роли DKK1 и CKAP4 в раковых опухолях, позволяет предположить, что оба белка являются молекулярными мишенями для терапии рака. Множественная миелома (ММ) - первое заболевание, при котором была обнаружена избыточная экспрессия DKK1 [81]. DKK1 повышен при ММ с остеолитическими поражениями, поскольку DKK1 ингибирует формирование костной ткани, противодействуя сигналам Wnt (см. раздел 6.1) [82]. В модели мыши SCID-hu, где клетки ММ, продуцирующие DKK1, вводились в имплантированную человеческую кость, наблюдались остеопороз, поражения костей с ростом клеток ММ и повышенный уровень растворимого DKK1 в мышиной крови [83]. Кроме того, введение гуманизированных анти-DKK1 моноклональнальных антител (mAbs) (BHQ880) увеличило количество остеобластов и уменьшило количество клеток ММ в человеческой кости. Поскольку BHQ880 не оказывает прямого действия на клетки ММ, но ингибирует рост клеток ММ в присутствии стромальных клеток костного мозга, ингибирующее действие BHQ880 может быть не связано с прямым подавлением сигнала Wnt в клетках ММ.

Еще одни гуманизированные анти-DKK1 мАб (DKN-01) были оценены в исследовании фазы 2 в первой линии рака желудка и гастроэзофагеального перехода (G/GEJ). Пациенты получали DKN-01 в сочетании с тизлелизумабом (анти-PD-1 mAbs) и химиотерапией. По сравнению с текущим стандартом лечения наблюдалось улучшение показателей общего ответа [84]. Однако основной механизм, с помощью которого эти анти-DKK1 мА подавляют рост рака, в настоящее время неизвестен, хотя доклинические данные, описанные ниже, позволяют предположить, что DKN-01 может усиливать врожденные иммунные реакции.

CKAP4, как рецептор DKKs, как ожидается, также будет представлять собой молекулярную мишень для терапии рака. Мыши с нокаутом CKAP4 (KO) выглядят фенотипически нормальными и неотличимы от своих гетерозиготных и WT (дикого типа) сородичей с рождения до 18 месяцев [85]. Детальный гистологический анализ различных органов у нокаутных мышей CKAP4 не выявил никаких отличий от мышей WT. Поэтому можно ожидать, что лечение анти-CKAP4 мАб не вызовет серьезных побочных эффектов. Анти-CKAP4 mAb демонстрируют ингибирующую активность в отношении связывания DKK1 с CKAP4, активности AKT, а также пролиферации и миграции клеток рака поджелудочной железы, легких, пищевода и печени. Анти-CKAP4 мАб также подавляет образование ксенотрансплантационных опухолей, индуцированных этими раковыми клетками у мышей nude (Т-клеточных иммунодефицитных мышей), и увеличивает выживаемость мышей, которым внутрибрюшинно вводили клетки рака поджелудочной железы [85]. Среди полученных mAbs только антитела, ингибирующие связывание DKK1 и CKAP4 in vitro, эффективны для подавления роста опухоли in vivo. Поскольку CKAP4 функционирует как рецептор всех DKK [29], анти-CKAP4 mAbs могли подавлять пролиферацию раковых клеток, стимулируемую DKK2, 3 и 4 (рис. 5A).



Fig. 5. Clinical usage of DKK1 and CKAP4. A: DKK1 and CKAP4 are promising molecular targets for cancer therapy. Anti-DKK1 and anti-CKAP4 antibodies are expected to block the interaction between the ligand and receptor, thereby suppressing downstream signaling and cancer cell proliferation. B: The anti-DKK1 and anti-CKAP4 antibodies are available for measuring DKK1 and CKAP4 levels in sera. Companion diagnosis using these antibodies is important for selecting cancer patients who should respond to molecularly targeted therapy.

Важно разработать методы диагностики для отбора онкологических больных, которые будут эффективно отвечать на молекулярную таргетную терапию. DKK1 - секретируемый белок, его концентрация в сыворотке крови измеряется с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) [18]. Уровень сывороточного DKK1 значительно выше у пациентов с раком легких и пищевода, чем у здоровых людей, и положительно связан с плохим прогнозом. Более чем у 70% пациентов с положительным уровнем DKK1 в сыворотке крови диагностируется рак легкого и пищевода, в то время как менее 5% здоровых контрольных групп являются DKK1-положительными, что позволяет предположить, что DKK1 полезен в качестве диагностического и прогностического маркера [86]. Экспрессия мРНК DKK1 в биопсиях опухоли при гибридизации in situ также была описана [87]. У пациентов с G/GEJ, получавших лечение препаратом DKN-01, у пациентов с высоким уровнем DKK1 общая частота ответа (ORR) составила 90% по сравнению с пациентами с низким уровнем DKK1, у которых ORR составил 56%, что позволяет предположить, что этот анализ может иметь диагностическое значение для лечения анти-DKK1 препаратом DKN-01.

Хотя CKAP4 является трансмембранным белком, было обнаружено, что он секретируется с небольшими внеклеточными везикулами (также известными как экзосомы) из клеток рака поджелудочной железы [85]. Считается, что экзосомы, выделяемые раковыми клетками, действуют аутокринным и паракринным образом, способствуя иммунной супрессии, ангиогенезу и формированию предварительных метастатических ниш, вызванных опухолью [88]. Экзосомы - это мембранные везикулы, которые образуются из крупных мультивезикулярных телец (МВТ) и высвобождаются во внеклеточную среду после слияния МВТ с плазматической мембраной [89]. Экзосомы имеют ту же топологию, что и клетки, и содержат широкий спектр биологически активного материала. К настоящему времени исследования экзосом привлекают значительное внимание как источник новых инструментов диагностики рака [88]. В частности, белки в экзосомах являются перспективными кандидатами в биомаркеры рака [90]. Например, глипикан-1, высвобождаемый с экзосомами, был предложен в качестве биомаркера для ранней диагностики рака поджелудочной железы [91].

Секреция CKAP4-содержащих экзосом опосредована DKK1-зависимыми путями эндоцитоза и требует молекул биогенеза экзосом [85]. С помощью анти-CKAP4 mAbs был разработан ELISA подход, способный выявлять секретируемый опухолью CKAP4 (рис. 5B). Также было установлено, что уровень CKAP4 в сыворотке крови у больных раком поджелудочной железы повышен по сравнению с уровнем у здоровых людей. Кроме того, было показано, что уровни у иммуногистохимически CKAP4-положительных пациентов выше, чем у иммуногистохимически отрицательных. Более того, при сравнении уровней CKAP4 в сыворотках дооперационных и послеоперационных пациентов, CKAP4 полностью исчез в сыворотках последних. Reverse-phase protein assay (RPPA) также показал, что уровни CKAP4 в сыворотке крови больных раком легких были выше, чем у здоровых контрольных лиц [92]. Кроме того, уровень CKAP4 был выше даже у пациентов с I стадией. Таким образом, CKAP4 может быть новым серо-диагностическим маркером рака поджелудочной железы и легких. Поскольку терапия анти-CKAP4 mAb теоретически может подавить пролиферацию раковых клеток, в которых CKAP4 экспрессируются в плазматической мембране, и из которых секретируется DKK1, ожидается, что обнаружение CKAP4 и DKK1 в сыворотке будет полезным для прогнозирования ответа на терапию анти-CKAP4 mAbs.

Накоплены доказательства того, что, помимо опухолевого генеза, DKK1 участвует в регуляции формирования костей, ангиогенеза, воспаления и иммунного гомеостаза [93], [94] (рис. 6). Передача сигналов Wnt играет анаболическую роль в поддержании костной массы, опосредованную усилением дифференцировки и активности остеобластов при одновременном подавлении дифференцировки и активности остеокластов [95]. DKK1, который вырабатывается из мезенхимных стволовых клеток, подавляет остеогенез и индуцирует адипогенез, эффективно переключая путь дифференцировки мезенхимных стволовых клеток путем ингибирования пути Wnt/β-катенин. Кроме того, DKK1 подавляет экспрессию Wnt-индуцированного остеопротегерина и усиливает экспрессию рецепторного активатора лиганда ядерного фактора каппа B (RANKL) в остеобластах, что приводит к активации остеокластов. Таким образом, ингибирование костеобразования под действием DKK1 хорошо объясняется оригинальной активностью DKK1 по подавлению Wnt-сигнализации.



Fig. 6. Various biological activities of DKK1. In addition to tumorigenesis, DKK1 participates in the regulation of bone formation, angiogenesis, inflammation, and immune homeostasis. The details of new functions of DKK1 are described in the text.

В отношении ангиогенеза сообщается, что DKK1 связан с ангиогенной реакцией в остеоартрозных коленных суставах. Сообщалось, что повышенный уровень экспрессии DKK1 совпадает с повышенным уровнем экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в синовиальной жидкости пациентов с прогрессированием заболеваний височно-нижнечелюстного сустава [96]. Кроме того, экспрессия VEGF, вызываемая DKK1, может быть опосредована индуцибельным фактором гипоксии [97]. Поскольку эти опосредованные DKK1 действия не требуют Wnt-сигнализации, то новая передача сигналов DKK1 должна быть активирована через рецепторы клеточной поверхности. Интригующе предположить, что рецептор VEGF действует как рецептор DKK1, но окончательные доказательства этого пока не получены. Что касается опухолевого ангиогенеза, сообщается, что DKK1, выделяемый клетками холангиоцеллюлярной карциномы, активирует опухолевый ангиогенез и коррелирует с плохим прогнозом [98]. В модели ксенотрансплантации мыши было показано, что DKK1, выделяемый опухолевыми клетками, связывается с CKAP4 в плазматической мембране эндотелиальных клеток, что затем вызывает экспрессию белка, связанного с везикулами плазмалеммы (PLVAP). Это, в свою очередь, формирует stomatal и fenestral мембраны кровеносных сосудов и регулирует базальную проницаемость через ось DKK1-CKAP4, что способствует ангиогенезу в микроокружении опухоли [98].

Сообщалось, что DKK1 является негативным модулятором противоопухолевого иммунного ответа при DNA deficient mismatch repair (dMMR)/microsatellite-instability (MSI) CRC посредством инактивации CD8+ Т-лимфоцитов [99]. В настоящее время dMMR/MSI CRC, по-видимому, чувствительны к PD-1 блокаде и имеют лучший прогноз и иммунный статус, чем микросателлит-стабильные CRC. Однако некоторые опухолевые клетки dMMR/MSI CRC выделяют DKK1, а в микроокружении опухоли DKK1 подавляет инфильтрацию и цитотоксичность CD8+ Т-клеток и коррелирует с плохой противоопухолевой иммунной реакцией. Блокада DKK1 у пациентов с высоким уровнем белка DKK1 в сыворотке крови может восстановить чувствительность к блокаде PD-1. DKK1, вырабатываемый из тромбоцитов, также поляризует Т-клетки на Th2-клетки, что приводит к выработке Th2-цитокинов, включая IL-4, IL-5, IL-13 и IL-10, посредством пути MAP-киназы и mTOR [100]. Нокаут DKK1 снижает продукцию цитокинов Th2-клетками и инфильтрацию лейкоцитов, тем самым защищая мышей от астмы, вызванной клещами домашней пыли, или инфекции Leishmania major. Таким образом, DKK1 из тромбоцитов является важным регулятором инфильтрации лейкоцитов и поляризации иммунного ответа при патологическом Th2-клеточно-опосредованном воспалении. Foxp3+ регуляторные Т (Treg) клетки, но не нативные или эффекторные CD4+ клетки, являются еще одним источником DKK1 [101]. Экспрессия DKK1 зависит от синтеза белка de novo и регулируется путем MAP-киназы, но не путем Wnt/β-катенина. Гипоморфные мыши с DKK1 не могли контролировать пролиферацию CD4+ Т-клеток и предотвращать Т-клеточно-опосредованный колит [101]. Таким образом, DKK1 может функционировать как Treg-производный медиатор для поддержания иммунологической толерантности при T-клетками обусловленными аутоиммунными болезнями.

Когда клетки карциномы легких Lewis (LLC) были введены мышам, мышиные остеобласты и остеоциты стали основным источником DKK1 [102]. Полученный из стромы DKK1 нацелен на миелоидные супрессорные клетки (MDSC) и оказывает иммуносупрессивное действие во время опухолевой прогрессии. Лечение антителами против DKK1 уменьшает рост опухоли и количество MDSC, а также восстанавливает привлечение Т-клеток у мышей, несущих клетки LLC. Таким образом, поскольку основным источником DKK1 не являются опухолевые клетки, высокий уровень DKK1 в опухолях не обязательно является предпосылкой для проведения DKK1-таргетной терапии. Метастазы могут развиваться спустя годы после удаления первичной опухоли. Было показано, что опухолевые клетки, распространившиеся из клеток рака легких и молочной железы, имплантированных мышам, вырабатывают DKK1 через транскрипционные факторы SOX2 и SOX9, переходят в состояние покоя и понижают уровень UL-16 связывающего белка, который связывается с рецептором естественных клеток-киллеров (NK), что приводит к NK-опосредованной очистке [103]. Эти клетки могут поддерживать длительное выживание и потенциал инициации опухоли на стадии латентного метастазирования. Рак легких является первичной опухолью, которая чаще всего метастазирует в мозг. Выделяемые раком легких экзосомы вызывают секрецию DKK1 из эндотелия микрососудов мозга, основного компонента барьера мозг-кровь, а DKK1 непосредственно инактивирует микроглию и переводит ее в предраковое состояние [104]. Эти изменения вызывают дефицит иммунного ответа в пред-метастатической нише и способствуют метастазированию клеток рака легких в мозг.

Было обнаружено, что мышиная базисная версия DKN-01, mDKN-01, подавляет вызванный меланомой рост опухоли у мышей RAG1-/- (дефицит Т- и В-клеток), но не у мышей NOD scid gamma (NSG) [105]. Кроме того, у мышей, обработанных анти-NK1.1 mAbs, у которых NK-клетки были истощены, mDKN-01 не проявил активности в подавлении роста опухоли. Таким образом, Т- и В-клетки не являются необходимыми, но NK-клетки необходимы для противоопухолевой активности, опосредованной mDKN-01 в модели меланомы. Также было обнаружено, что лечение mDKN-01 вызывает активацию NK-клеток и снижает количество MDSC-клеток в опухоли. Кроме того, экспрессия PD-L1 увеличивалась во внутриопухолевых MDSC при лечении mDKN-01, а комбинация mDKN-01 и анти-PD-1 mAbs оказывала аддитивный супрессивный эффект на рост опухоли. Если взять эти результаты вместе, то анти-DKK1 mAbs могут обратить вспять DKK1-опосредованную врожденную иммуносупрессию в микроокружении опухоли [105].

Предполагается, что DKK2 обладает иммуномодулирующей активностью [73]. Открытые наборы данных показывают, что DKK2 экспрессируется в колоректальном раке с мутациями в гене аденоматозного полипоза (APC) и что высокая экспрессия DKK2 коррелирует с плохой выживаемостью. Также сообщалось о корреляции между высокой экспрессией DKK2 и увеличением метастазирования в лимфатические узлы [106]. Хотя анти-DKK2 mAbs не влияют на пролиферацию клеток CRC in vitro, он подавляет рост опухоли, вызванной клетками колоректального рака, у мышей, что позволяет предположить, что он препятствует прогрессии опухоли, изменяя микроокружение опухоли. DKK2 подавляет активацию NK-клеток и CD8+ Т-клеток, препятствуя IL-15-индуцированной ядерной локализации фосфорилированного STAT5. Комбинация анти-DKK2 антител и анти-PD-1 антител дает дополнительную противоопухолевую активность в отношении ксенотрансплантатов опухолей, вызванных CRC [73]. Кроме того, было показано, что анти-DKK2 mAbs снижают васкуляризацию опухоли в мышиной модели с мутациями APC и Kras. Исходя из этих наблюдений, комбинация анти-DKK2 mAbs и антитела против рецепторов VEGF демонстрирует синергетический эффект в подавлении ангиогенеза и прогрессии опухоли.

Хотя регуляторные Т-клетки CD4+ вносят основной вклад в индукцию и поддержание периферической толерантности, подмножества Т-клеток CD8+ также играют определенную роль в этой толерантности. DKK3 был идентифицирован в толерантных CD8+ клетках [107]. DKK3 может подавлять пролиферацию и продукцию IL-2 CD8+ Т-клетками, а нокаут DKK3 привел к восстановлению антиген-специфической цитотоксичности Kb у мышей Des.KKb, у которых антиген Kb экспрессируется исключительно на кератиноцитах [108]. Сообщалось также, что анти-DKK3 mAbs отменяют толерантность и приводит к отторжению аутологичного кожного трансплантата, содержащего Kb-антиген [107]. Кроме того, было показано, что DKK3 участвует в развитии В-клеток путем притока Ca²⁺ через BCR-сигнализацию [109]. Более того, у нокаутных по DKK3 мышей увеличивается количество В1-клеток и из В1-клеток вырабатывается IL-10. Было установлено, что введение анти-DKK3 mAbs в мышиную модель системной красной волчанки также усиливает воспаление почек с инфильтрацией мононуклеарных клеток в почках и легких. Было также показано, что DKK3 экспрессируется в панкреатических звездообразных (stellate) клетках при раке поджелудочной железы [110]. DKK3, полученный из PSCs, подавлял пролиферацию CD3+ Т-клеток, а увеличение и инфильтрация CD3+ и CD8+ Т-клеток наблюдались в опухолях рака поджелудочной железы, имплантированных мышам-нокаутам DKK3. Комбинация анти-DKK3 и анти-CTLA4 антител более эффективно снижает рост опухоли из имплантированных клеток рака поджелудочной железы. Таким образом, DKK3 может непосредственно действовать на иммунные клетки и проявлять иммуномодулирующую активность, но лежащий в основе этого механизм пока неясен. Также предстоит выяснить, опосредует ли CKAP4 DKK3-зависимую иммуномодуляцию.

Экспрессия DKK4 коррелирует со стратификацией высокого риска и плохим прогнозом при гастроинтестинальной стромальной опухоли (GIST) [111]. Однако ни избыточная экспрессия, ни нокдаун DKK4 не влияют на пролиферацию, миграцию и способность к лекарственной устойчивости клеток GIST-T1 in vitro. Анализ обогащения набора генов с использованием данных профиля экспрессии генов у пациентов с GIST с высокой и низкой экспрессией DKK4 показал, что в группе с высокой экспрессией DKK4 был нарушен иммунный ответ и наблюдалась отрицательная корреляция между экспрессией DKK4 и маркерами CD8+ T-клеток. Более того, рекомбинантный белок DKK4 снижал миграцию CD8+ Т-клеток in vitro, а иммуногистохимические CD8+ Т-клетки снижались при более сильной экспрессии DKK4 в серийных срезах образцов GIST [111]. Таким образом, опухолевый DKK4 может облегчать инфильтрацию и активацию иммунных клеток в микроокружении опухоли.

Прошло более 20 лет с тех пор, как DKK1 был открыт как антагонист передачи сигналов Wnt. DKK1 необходим для развития эмбриона и, по-видимому, участвует в различных биологических действиях после рождения. Помимо DKK1, к членам семейства DKK относятся DKK2, 3 и 4. Накопились доказательства того, что члены семейства DKK, DKK1-4, имеют и свои собственные функции, независимые от Wnt-сигнализации. Очевидно, что DKK3 не ингибирует передачу сигналов Wnt, поэтому у него должны быть свои собственные функции. В этом контексте вывод о том, что CKAP4 действует как рецептор для DKK3, является важным. Также интригует предположение, что ось DKK3-CKAP4 вносит свой вклад в неразрешенные физиологические и патологические явления. Роль передачи сигналов DKK1-CKAP4 в опухолевом генезе была широко изучена, и механизмы пролиферации раковых клеток посредством аутокринной петли через DKK1 и CKAP4 были достаточно хорошо выяснены. Недавно появились также исследования, касающиеся иммунологических реакций, контролируемых DKK1. DKK1, выделяемый опухолевыми клетками, может влиять на иммунные клетки, экспрессирующие CKAP4, или раково-ассоциированные фибробласты могут выделять DKK1, тем самым контролируя иммунный контрольный пункт. Поскольку DKK2 и DKK4 еще недостаточно изучены, необходимы дальнейшие эксперименты для получения полного представления о функциях семейства DKK.