Hox-гены - это главные транскрипционные регуляторы, которые у дрозофилы определяют идентичность (качественные особенности) сегментов тела и, как следствие, играют ключевую роль в контроле построения плана тела эмбриона вдоль его передне-задней оси. Геном дрозофилы кодирует восемь различных Hox-генов, разделенных на комплексы генов Antennapedia и Bithorax (ANT-C и BX-C, соответственно; обзор приведен в Gehring & Hiromi, 1986). ANT-C включает пять генов: labial (lab), proboscipedia (pb), Deformed (Dfd), Sex combbs reduced (Scr) и Antennapedia (Antp) (Kaufman et al., 1980; Lewis et al., 1980), а BX-C состоит из трех генов: Ultrabithorax (Ubx), abdominal-A (abd-A) и Abdominal-B (Abd-B) (Lewis, 1978).

Общий план тела дрозофилы сохраняется на протяжении всего развития, начиная с эмбриогенеза. Тело разделено на 11 сегментов, которые составляют грудную клетку и брюшко. Грудная клетка состоит из трех грудных сегментов, называемых проторакс (T1), мезоторакс (T2) и метаторакс (T3), а брюшко - из 8-10 сегментов.

Белки Hox - это транскрипционные факторы, которые имеют общий ДНК-связывающий домен, называемый гомеодоменом (HD). Хотя белки Hox могут распознавать одни и те же ДНК-связывающие последовательности, их известная различная специфичность для генов-мишеней объясняется их связью с различными кофакторами. Antennapedia может образовывать транскрипционные комплексы (ANTENNAPEDIA transcriptional complexes) с различными кофакторами. Он связывается с множеством транскрипционных факторов и белков базового механизма транскрипции (Altamirano-Torres et al., 2018; Baeza et al., 2015; Jimenez-Mejia et al., 2022; Prince et al., 2008). Antennapedia, как и другие Hox-белки, интегрирует клеточно-специфическую информацию с базовым механизмом транскрипции для избирательной транскрипции некоторых генов-мишеней.

Обширные и превосходные классические генетические и молекулярные исследования локуса Antp позволили обнаружить эффекты экспрессии Antp на план тела дрозофилы (Abbott & Kaufman, 1986; Bermingham Jr. et al., 1990; Garber et al., 1983; Jorgensen & Garber, 1987; Schneuwly et al, 1986; Scott et al., 1983), и вместе с исследованиями других генов Hox было показано, что при нарушении экспрессии гена Hox структуры тела, определяемые выделенным геном Hox, трансформируются в структуры другого сегмента тела. Например, некоторые аллели с усиленной функцией Antp вызывают гомеотическую трансформацию антенн мухи в ноги (Schneuwly et al., 1987), а другие демонстрируют доминантную трансформацию дорсальных структур головы в дорсальные структуры грудной клетки (Scott et al., 1983). Но не только аллели усиления функции Antp вызывают гомеотическую трансформацию. Нулевые гомозиготные эмбрионы Antp (Antp-/-) демонстрируют трансформацию перспективного мезоторакса в прототоракс и погибают на поздних стадиях эмбриогенеза (Martinez-Arias, 1986; Wakimoto & Kaufman, 1981). Изучение аллелей с усилением и ослаблением функции показало, что Antp имеет решающее значение для развития мезоторакса и второй пары ног, а недавние работы показывают, что ген Antp также важен для развития крыловой пластинки (Fang et al., 2022; Paul et al., 2021).

Экспрессия Antp строго регулируется на протяжении всего развития. Его экспрессия направляется двумя различными промоторами (P1 и P2) в определенные области мезоторакальных тканей. Эти промоторы контролируются промотор-специфическими регуляторными областями. Для каждого промотора существует по крайней мере один ранний энхансер (EE1 и EE2), который активен в раннем эмбриогенезе. В дальнейшем экспрессия Antp в личиночных тканях контролируется множеством механизмов.

Локус Antp имеет сложную структуру. Он охватывает 103 кб ДНК, и наиболее известная организация локуса включает два промотора, P1 и P2, восемь экзонов и два сайта полиаденилирования (Garber et al., 1983; Schneuwly et al., 1986; Scott et al., 1983). В текущей версии Flybase (FB2023_04; Jenkins et al., 2022) с помощью методов экспрессированных меток последовательностей (ESTs) и РНК-секвенирования обнаружены два новых транскрипта, которые добавляют новый Transcription Start Site (TSS) к тем, которые известны по промоторам P1 и P2. Согласно этой модели, в нем должно быть не менее девяти экзонов и три сайта полиаденилирования. Поскольку эти новые транскрипты не были изучены, в рамках данного обзора мы сосредоточили наше описание на лучше охарактеризованной геномной организации локуса Antp. Первые четыре экзона (E1-E4) кодируют 5' нетранслируемую область (5'-UTR) транскриптов Antp (рис. 1a, серые квадраты). Последние четыре экзона (E5-E8) охватывают 3' нетранслируемую область (3'-UTR) и кодирующую область нескольких изоформ Antennapedia с массой около 43 кДа (Schneuwly & Gehring, 1985). Разнообразие транскриптов Antp обусловлено альтернативным сплайсингом различных экзонов (рис. 1а). Транскрипты без E6 образуются по механизму проскакивания экзонов (Bermingham Jr. & Scott, 1988). Помимо канонического сплайсинг-донорского сайта, E7 имеет необычный сайт сплайсинга, который генерирует увеличенную версию экзона (E7L), кодирующую так называемую "линкерную область" (см. впереди; рис. 1б). Изоформы Antennapedia с E7L более многочисленны в эмбрионах по сравнению с теми, которые присутствуют на других стадиях развития (Papadopoulos et al., 2019; Stroeher et al., 1988; см. далее). Хотя альтернативный сплайсинг обеспечивает трансляцию по меньшей мере четырех различных изоформ Antennapedia (рис. 1a), связь между альтернативным сплайсингом и использованием промотора отсутствует (Bermingham Jr. & Scott, 1988; Stroeher et al., 1988). Расположение локуса Antp сохраняется среди других видов рода Drosophila, что говорит о функциональной значимости этих особенностей в ходе эволюции (Hooper et al., 1992).



FIGURE 1 Antennapedia genomic region, transcripts, and protein domains. (a) Antp spans along 103 kb, and the most known locus organization shows that it has two promoters (P1 and P2), and eight exons (E1–E8). Untranslated (gray) and translated (white) exons are indicated, and representative transcripts are depicted. Different transcripts are generated by alternative splicing (dashed gray lines) between E6, E7, and E7L. E7L encodes a longer “linker region” between the HD and the HX (red box, a and b) than the E7 version. (b) The Antennapedia protein and its domains. The depicted isoform has 374 aminoacidic residues and the DNA regions in (a), encoding the protein domains, are represented with the same colors. The TSYF (a variant of the typical SSYF domain), PolyQ (poly-glutamine), HX (hexapeptide), and HD (homeodomain) domains are indicated.

Транскрипция Antp начинается в начале эмбриогенеза с двух разных промоторов, обозначенных как P1 и P2 (рис. 1a), которые расположены на расстоянии 65 кб друг от друга (Laughon et al., 1986). Эти промоторы имеют уникальные особенности, позволяющие избирательно регулировать их в ходе развития. Согласно современной классификации эукариотических промоторов (см. Ngoc et al., 2019; Sloutskin et al., 2021), P1 - это дисперсный промотор с четырьмя неканоническими TSS, а P2 - сфокусированный промотор с DPE-боксом (Juven-Gershon et al., 2008), мотив, распознаваемый субъединицами TAF6 и TAF9 фактора TFIID базового механизма транскрипции (Burke & Kadonaga, 1996, 1997).

Такая сложная структура генов и их экспрессия влияют на производство и дозировку различных изоформ Antennapedia. Hox-белки имеют несколько характерных доменов, как показано для Antennapedia на рисунке 1b. Один из них - HD, состоящий примерно из 60 аминокислот. HD Antennapedia расположен в С-концевой области белка (рис. 1а, синяя рамка) и кодируется в последнем экзоне Antp (E8). Структура HD состоит из трех альфа-спиралей, которым предшествует гибкий N-концевой рукав. Спирали 2 и 3 образуют мотив helix-turn-helix (HTH) - предковый ДНК-связывающий мотив, обнаруженный в прокариотических белках (Qian et al., 1989). Контакты HD с ДНК происходят со спиралью 3, называемой "спиралью узнавания", и с N-концевым плечом HD, которое помещается в минорную бороздку (Gehring et al., 1994). Кроме того, спираль 2 HD необходима для взаимодействия Antennapedia с TFIIEβ (Altamirano-Torres et al., 2018), показывая, что HD Antennapedia отвечает не только за ДНК-связывающую активность, но и необходим для установления важных контактов с базовым механизмом транскрипции. Antennapedia и другие Hox-белки связываются с основной последовательностью TAAT через свой HD (Desplan et al., 1988); однако in vivo они связываются с несколько иными ДНК-связывающими мотивами, что позволяет предположить, что более строгая селективность достигается за счет кооперативного связывания ДНК с несколькими кофакторами. Взаимодействие с этими кофакторами может повысить специфичность ДНК-связывания Hox-белков (Slattery et al., 2011).

Взаимодействие Antennapedia с кофакторами в значительной степени зависит от небольшого мотива, состоящего из гексапептидной последовательности (HX), содержащей четыре основных остатка YPWM (рис. 1б). Этот мотив Antennapedia взаимодействует с Extradenticle и субъединицами общего транскрипционного механизма (см. ниже). HX отделен от HD линкерной областью, длина которой варьирует в белках Hox Ultrabithorax, Antennapedia, Labial и Proboscipedia в результате дифференциального сплайсинга экзонов (Bermingham Jr. & Scott, 1988; Cribbs et al., 1992; Kornfeld et al., 1989; Mlodzik et al., 1988; O'Connor et al., 1988; Stroeher et al., 1986). Некоторые изоформы Antennapedia имеют линкерные области на четыре аминокислоты длиннее своих коротких аналогов, и в рамках данного обзора мы назовем их AntennapediaLL (Long Linker) и AntennapediaSL (Short Linker), соответственно (рис. 1а). Изоформы AntennapediaLL преимущественно экспрессируются во время эмбрионального развития (Bermingham Jr. & Scott, 1988).

Antennapedia содержит TSYF-домен, расположенный в N-концевой области, который является небольшой вариацией SSYF-домена (рис. 1b). Домен SSYF, присутствующий в белках Ultrabithorax и Sex Combs Reduced Hox, участвует в контроле экспрессии специфических генов-мишеней в имагинальных дисках (Tour et al., 2005). Взаимодействие N- и C-концевых областей Antennapedia с белками-мишенями может стабилизироваться PolyQ-доменом Antennapedia, содержащим неупорядоченную область из нескольких глутаминов (Laughon et al., 1986; Stroeher et al., 1986), которая участвует в транскрипционной активации путем стабилизации межбелковых взаимодействий (Atanesyan et al., 2012). Взаимодействие Antennapedia через эти домены с несколькими партнерами позволяет формировать различные транскрипционные комплексы ANTENNAPEDIA.

Antennapedia - это главный транскрипционный фактор, который действует как активатор или как репрессор, определяя генетическую программу формирования мезоторакса. Определение типа активности и целевой специфичности каждого Hox-белка, включая Antennapedia, определяется его взаимодействием с различными кофакторами.

С 1997 года Biggin and McGinnis предложили две модели для объяснения того, как кофакторы взаимодействуют с Hox-белками на хроматине (Biggin & McGinnis, 1997). Первая - "широко распространенная" модель, в которой белки Hox связаны по всему геному, а привлечение ко-фактора изменяет свойства белка Hox для регуляции экспрессии целевого гена. Вторая - "ко-селективная" модель, когда белки Hox не связываются с ДНК с высокой степенью сродства, если не присутствуют кофакторы. Эта модель подразумевает, что по крайней мере один ко-фактор вступает в тесный контакт с белком Hox, чтобы обеспечить правильное присоединение гетеродимера Hox-ко-фактор к определенным мотивам ДНК и либо подавить, либо активировать экспрессию его генов-мишеней.

Двумя хорошо известными кофакторами Antennapedia являются Extradenticle и Homothorax. Они представляют собой HD-транскрипционные факторы суперкласса TALE (Three Aminoacid Length Extension) (Rauskolb et al., 1993; Rieckhof et al., 1997). В экспериментах по иммунопреципитации хроматина (ChIP) можно выделить как минимум два различных транскрипционных комплекса ANTENNAPEDIA - Antennapedia-Extradenticle и Antennapedia-Extradenticle-Homothorax (Kribelbauer et al., 2020; рис. 2). Транскрипционные комплексы ANTENNAPEDIA распознают различные ДНК-связывающие сайты вдоль генома в зависимости от их субъединичного состава. Анализ ChIP-seq показывает, что комплекс Antennapedia-Extradenticle связывается с участками хроматина, отличными от тех, которые связываются комплексом Antennapedia-Extradenticle-Homothorax, что приводит к дифференциальной регуляции экспрессии генов (Kribelbauer et al., 2020).



FIGURE 2 Interactions of the subunits of the ANTENNAPEDIA transcriptional complex. Antennapedia (turquoise), Extradenticle (blue), and Homothorax (red). (a) The Antennapedia–Extradenticle (left) and the Antennapedia–Extradenticle–Homothorax complexes (right) are shown. The protein–protein interaction domains are indicated (double-sided arrows). (b) The specificity of Antennapedia binding is increased by Extradenticle and Homothorax, leading Antennapedia to specific regions within the genome (see text). Antennapedia can be assembled into complexes to integrate information on cell-specific (purple) and general transcription factors (light blue) interfaced by interactions with the MEDIATOR complex (gray) to regulate gene expression. (c) The embryonic assembly of the ANTENNAPEDIA transcriptional complexes occurs during gastrulation. Extradenticle is the only subunit present during cellular blastoderm and is cytoplasmic. Antennapedia and Homothorax begin to accumulate in a nuclear pattern after germband extension. Extradenticle is imported into the nuclei upon binding to Homothorax. As a result, the assembly of the ANTENNAPEDIA transcriptional complexes is coordinated by their subunit availability during gastrulation.

Extradenticle импортируется в ядро после связывания с Homothorax (Berthelsen et al., 1999; Kribelbauer et al., 2020; Rieckhof et al., 1997). Там HD из Extradenticle взаимодействует с HX из Antennapedia (Slattery et al., 2011; рис. 2а). Для образования комплекса Antennapedia-Extradenticle-Homothorax домен Homothorax-Meis (HM) из Homothorax взаимодействует с доменом PBC (PBX [фактор транскрипции пре-В-клеточного лейкоза] и Ceh-20) из Extradenticle (Ryoo et al., 1999; рис. 2а).

Фактически, для взаимодействия Antennapedia с хроматином необходим предварительно связанный ко-фактор TALE, чтобы получить доступ к функциональным сайтам связывания in vivo. Как Extradenticle, так и Homothorax позволяют Antennapedia распознавать сайты с низкой доступностью к хроматину (Porcelli et al., 2019), повышая селективность и специфичность Antennapedia к их геномным мишеням и поддерживая "ко-селективную" модель. В отсутствие Antennapedia кофакторы TALE могут способствовать связыванию множества транскрипционных факторов, помимо Hox-белков (обзор в Bobola & Sagerstrцm, 2022). Например, в отсутствие Antennapedia, Homothorax может регулировать несколько биологических процессов, таких как спецификация идентичности антенн и формирование паттерна проксимо-дистальной оси некоторых придатков (Abu-Shaar & Mann, 1998; Casares & Mann, 1998; Mann & Morata, 2000).

Antennapedia также взаимодействует с другими белками, как показал анализ интерактомов. Он связывается с членами общего механизма транскрипции, такими как субъединица TFIID TAF3 (также известная как dTAFII155, или Bric-a-brac interacting protein 2, Bip2), in vitro и in vivo (Papadopoulos et al, 2011; Prince et al., 2008), TFIIB (Balza et al., 2015), TFIIEβ (Altamirano-Torres et al., 2018), TBP (Jimйnez-Mejna et al., 2022) и субъединицу MEDIATOR Med19 (Boube et al., 2014; Рисунок 2b). Действительно, в анализах на клеточных культурах Antennapedia-TFIIEβ может репрессировать транскрипцию определенных мишеней и переключаться на активацию, когда TBP связан с этим димерным комплексом (Jimйnez-Mejna et al., 2022). Результаты бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) на живых эмбрионах (Balza et al, 2015) показали, что Antennapedia также связывается с множеством клеточно-специфических факторов, участвующих в различных процессах, включая эмбриональную сегментацию (Even Skipped и Krüppel), формирование мышц (Myocyte Enhancer Factor 2, MEF2, Twist и Biniou), спецификацию клеточной судьбы (Distal-less и Teashirt) и эффекторы многочисленных сигнальных путей, включая Bmp (Mothers Against Dpp), Ras (Pointed) и Notch (Suppressor of Hairless и Mastermind). Эти взаимодействия объясняют разнообразные и в то же время специфические геномные мишени Antennapedia, раскрывая ее центральную роль в сборе входного сигнала от клеточно-специфических и общих транскрипционных факторов (рис. 2b). Клеточно-специфические кофакторы Antennapedia могут способствовать регуляции экспрессии генов через различные механизмы в эктодерме и мезодерме (обзор приведен в Pinto et al., 2022).

Доступность субъединиц этих транскрипционных комплексов зависит, по крайней мере частично, от времени экспрессии кодирующих их генов, и, как правило, это происходит на разных стадиях эмбриогенеза (см. следующий раздел и рис. 2c).

Экспрессия Antp и (exd) extradenticle начинается на стадии клеточной бластодермы (Carroll et al., 1986; Wirz et al., 1986), но обнаруживаемый уровень белка Antennapedia не накапливается до конца удлинения зародышевого диска в середине гаструляции (см. следующий раздел и рис. 3b), вероятно, из-за времени, необходимого для трансляционной регуляции транскриптов Antp (Carroll et al., 1986; Wirz et al., 1986). Такая задержка в накоплении белка наблюдалась и у других Hox-белков, которые транскрибируются в ограниченных пространственных доменах, начиная со стадии клеточной бластодермы (Akam & Martinez-Arias, 1985; Irish et al., 1989; Karch et al., 1990; Martinez-Arias et al., 1987; Sбnchez-Herrero & Crosby, 1988). Экспрессия Homothorax (Hth) также задерживается до середины гаструляции (Kurant et al., 1998). Поэтому, поскольку ядерная транслокация Extradenticle зависит от Homothorax (Rieckhof et al., 1997), то вполне вероятно, что оба ко-фактора участвуют в транскрипционных комплексах ANTENNAPEDIA до середины гаструляции. Эта задержка, наряду с доступностью кофакторов, будет решающим шагом в установлении профиля генов-мишеней Antennapedia, экспрессируемых в каждом типе клеток во время развития.



FIGURE 3 Gap and pair-rule proteins regulate Antp promoters during the cellular blastoderm stage. The expression of Antp P1 (purple) and P2 (cyan) (middle panel) is indicated. Gap and pair-rule embryonic expression domains (red/green plus dark gray) known to regulate Antp expression. The specific domain(s) where each segmentation protein acts as an activator (green) or repressor (red) of Antp P1 or P2 is indicated. Even-numbered PS are shaded in light gray.

Будущие эксперименты относительно сайтов связывания для Antennapedia д. объяснить пластичность транскрипционных косплексов ANTENNAPEDIA и соседних сайтов связывания для разных кофакторов во всех экспериментах по дальнодействующим взаимодействиями с хроматином (e.g., 4C data) , чтобы лучше понять ролль Antennapedia в контексте стадии развития, клеточного типа и локального окружения хроматина.

Первые транскрипты Antp появляются после начальных этапов эмбриогенеза. После оплодотворения соматические ядра подвергаются 13 последовательным, почти синхронным ядерным делениям в виде синцития, образуя в итоге кортикальную оболочку из примерно 500 ядер, известную как бластодерма. Социализация этих ядер (клеточная бластодерма) происходит в первой половине интерфазы 14 (Foe & Alberts, 1983; обзор в Harrison et al., 2023), и к этому времени эмбрион делится на 14 парасегментов (PS) вдоль передне-задней оси. Именно на этой стадии впервые появляются транскрипты Antp (Bermingham Jr. et al., 1990; Levine et al., 1983).

После клеточной инвагинации средняя вентральная часть бластодермы инвагинирует, образуя три зародышевых слоя - эндодерму, мезодерму и эктодерму (Gheisari et al., 2020). Во время начала гаструляции формируется зародышевая полоса, дающая начало видимой сегментированной части животного, состоящей из гнатального, грудного и брюшного сегментов (Campos-Ortega & Hartenstein, 1997). Antp определяет идентичность перспективных мезоторакальных тканей с раннего эмбрионального развития. По мере развития паттерн экспрессии Antp уточняется и регулирует экспрессию генов в трех зародышевых слоях мезоторакальных тканей, которые в дальнейшем развиваются в кутикулу, мышцы и нервы мезоторакса, крыльев и второй пары ног. Antennapedia и другие Hox-белки имеют решающее значение для эмбрионального развития мышц (Poliacikova et al., 2021), которые впоследствии будут участвовать в формировании мускулатуры грудной клетки взрослого человека.

Как уже упоминалось, транскрипты Antp впервые появляются в некоторых PS на стадии клеточной бластодермы (Bermingham Jr. et al., 1990; Levine et al., 1983). Как и для других генов Hox, эмбриональная экспрессия Antp с промоторов P1 и P2 регулируется продуктами материнских генов, gap,и pair-rule генов (рис. 3). Например, до начала клеточного развития P2 репрессируется материнскими факторами, такими как Oskar, на задней стороне эмбриона (Irish et al., 1989; Riley et al., 1991). P1 управляет экспрессией Antp в широком кольце, расположенном от PS4 до PS6 (Bermingham Jr. et al., 1990; Irish et al., 1989; рис. 3а, средняя панель). Она регулируется в основном продуктами двух генов gap: Krüppel (Kr) кодирует положительный регулятор, который в точности повторяет паттерн экспрессии транскриптов Antp P1, а hunchback (hb) кодирует репрессор Antp P1, который предотвращает его активацию на передней стороне эмбриона (в то время как он является активатором Antp P2 в PS14, см. далее) (Irish et al., 1989; рис. 3а).

Транскрипты, образуемые Antp P2, экспрессируются в трех разных областях эмбриона (Bermingham Jr. et al., 1990; Irish et al., 1989; Riley et al., 1991; рис. 3б, средняя панель). Две из областей - это полосы, расположенные на PS4 и PS14, а третья - вентральная полоса клеток, расположенная на PS6. Сегментационные белки активируют экспрессию Antp P2 в этих трех доменах и поддерживают ее репрессию за их пределами.

Некоторые из этих регуляторов относятся исключительно к определенным доменам P2 (рис. 3b). Например, белковый продукт гена gap, hb, участвует в активации P2 в домене PS4 и является репрессором P1. С другой стороны, гены gap, giant (gt) и knirps (kni), участвуют в репрессии P2 в средней и передней части эмбриона (Riley et al., 1991).

Поскольку домены экспрессии P2 расположены в четных PS, одним из первых зиготических pair-rule генов-кандидатов на регуляцию экспрессии P2 стал fushi tarazu (ftz). Действительно, Fushi tarazu регулирует экспрессию трех доменов транскриптов Antp P2, но не транскриптов Antp P1, и поэтому на стадии клеточной бластодермы у ftz-эмбрионов не формируются домены транскриптов P2 (Ingham & Martinez-Arias, 1986).

После удлинения зародышевого диска оба промотора приводят экспрессию Antp в перспективный мезоторакс и распространяются дальше к PS12 для транскриптов Antp P1 и к PS14 для транскриптов P2 (Bermingham Jr. et al., 1990; Ingham & Martinez-Arias, 1986; Qian et al., 1991; рис. 4b).



FIGURE 4 Antp promoter-specific expression during embryogenesis. The location of Antp P1 (purple) and P2 (cyan) transcripts in different PS (numbers), in the cellular blastoderm (whole view). At later stages (section views), Antp transcripts are depicted in the mesoderm (gray) and the ectoderm (light gray). (a) During cellular blastoderm (Stage 5), P1 drives Antp expression to a wide ring located in the primordia of PS4–PS6. This ring is wider at the ventral surface and is uniformly tapering toward the dorsal side. Antp P2 transcripts are expressed in three domains. Two of these regions are bands located at PS4 and PS14, and the third one is limited to the ventral surface of PS6. (b) During germband extension (Stage 8), P1 is active in the mesoderm from PS5 to anterior PS6 and in the ectoderm, it is expressed strongly from PS4 to PS6 and weakly from PS6 to PS12. P2 transcripts are expressed in the mesoderm of PS4 and PS6 and in the ectoderm and are expressed strongly from PS3 to PS4 and weakly from PS6 to PS14. (c) During germband retraction (Stage 11), the ectoderm is delaminated to form the VNC (light gray circles). P1 transcripts are found at high levels in the mesoderm from PS5 to anterior PS6 and in the developing VNC from PS4 to anterior PS6 (purple circles). At this stage, P2 transcripts are only expressed in the developing VNC from PS3 to PS14 (cyan circles). (d) As head involution begins (Stage 14), Antp is expressed mainly in the VNC. In mature VNC (light gray), P1 transcripts are expressed strongly in PS4, weakly in PS5, and very weakly in PS6–PS12. P2 transcripts are expressed in mature VNC strongly from PS3 to PS6 and weakly from PS6 to PS14. The expression patterns driven by both promoters remain until hatching.

Во время ретракции зародышевого диска экспрессия транскриптов Antp P1 увеличивается в перспективном вентральном нервном тяже (VNC), а экспрессия Antp P2 почти исчезает в мезодерме перспективной мезоторакальной области (рис. 4c). На поздних стадиях эмбриогенеза транскрипты Antp P1 экспрессируются в подмножестве висцеральных мышц, расположенных вблизи кишечника. Транскрипты Antp P2 также экспрессируются в висцеральной мезодерме до вылупления (рис. 4d), и экспрессия Antp в этих мышцах важна для их правильного развития, поскольку у Antp-/- эмбрионов в ходе эмбриогенеза не происходит сужения кишечника (Reuter & Scott, 1990).

Чтобы обеспечить сложный паттерн экспрессии Antp в ходе эмбрионального развития за счет действия различных транскрипционных регуляторов, Antp имеет регуляторные области для промоторов P1 и P2, которые мы опишем в следующем разделе.

Экспрессия Antp чётко регулируется на ранних эмбриональных стадиях для достижения точного паттерна экспрессии во времени и пространстве. P1 - это дисперсный промотор с четырьмя неканоническими TSS. Экспрессия под действием P1 активируется во время целлюляризации, и первые сообщения показывают, что транскрипты Antp P1 появляются позже транскриптов P2, предположительно потому, что транскрипты P1 длиннее последних (65 против 100 кб; Bermingham Jr. et al., 1990).

Есть два гена, кодирующие длинные не-кодирующие РНК, и элемент PRE/TRE (Polycomb/Trithorax Response Element), расположенный на 700 п.н. выше P1 (Oktaba et al., 2008; рис. 5a), который поддерживает правильную экспрессию Antp P1 на поздних эмбриональных стадиях, как показано в системе с генами-репортерами, слитыми с этим регионом (Zink et al., 1991).



FIGURE 5 Antp promoter-specific regulatory regions during embryogenesis. Regulatory regions located around each Antp promoter. The FAIRE-seq chromatin accessibility profiles (gray peaks) from embryos at different hours after egg laying (AEL) are from (McKay & Lieb, 2013). Proteins bound to the indicated chromatin regions were analyzed in cellular blastoderm embryos (Bradley et al., 2010; MacArthur et al., 2009). Genomic regions (shaded vertical blue) accessible only during the cellular blastoderm that coincide with the binding profile of some gap and pair-rule proteins. Two of them are the early promoter-specific enhancers (EE1 for P1 and EE2 for P2), while ER1 and ER2 have not been studied. (a) Antp P1 regulatory region. The AU1 insulator (Li et al., 2018), a PRE (Oktaba et al., 2008), CR45899, and CR44933, which are two genes that encode long-non-coding RNAs (Karaiskos et al., 2017; Young et al., 2012) and the EE1 (Batut et al., 2022), are indicated. TE and DTE are tethering elements (Batut et al., 2022). Note that chromatin is accessible in two subregions of EE1 (FAIRE e 2–4 h) that are closed in later stages (FAIRE 6–8 h and 16–18 h). Hunchback (red peaks) and Krьppel (green peaks) bind to these subregions. (b) Antp P2 regulatory region. Several regions are dynamically accessible during development within 19 kb upstream of Antp P2. The Ultrabithorax regulatory element (Shlyueva et al., 2016; Ubx-responsive) represses the expression of P2-derived in posterior PSs. The Thoracic Ganglia and the Peripheral Nervous System (PNS) elements drive Antp toward the nervous system. Chromatin is accessible in two very close EE2 subregions (FAIRE e 2–4 h), which are not accessible at later stages (FAIRE 6–8 h and 16–18 h). The activators Fushi tarazu and Hunchback (green peaks) and the repressor Giant (red peaks) bind to the EE2 during cellular blastoderm. (c) Examples of Antp embryonic expression driven by specific regulatory elements shown in (a) and (b).

ChIP-анализ показывает, что во время клеточного развития белки gap Krüppel и Hunchback связываются с несколькими геномными областями вокруг Antp P1 (MacArthur et al., 2009), включая ранний энхансер 1 (EE1, рис. 5a), который расположен в 38 кб вверх по течению от P1. Этот энхансер отвечает за экспрессию P1 от PS4 до PS6 во время клеточной бластодермы (рис. 5). Профиль связывания ChIP позволяет предположить, что как активаторы, так и репрессоры могут действовать в одних и тех же регуляторных областях в разных клеточных контекстах для регуляции Antp P1 в определенных областях клеточной бластодермы эмбриона.

Классические генетические эксперименты показали, что дальние взаимодействия в локусе Antp важны для правильной экспрессии гена Antp (Southworth & Kennison, 2002). Сеть пограничных элементов хроматина и инсуляторов в ANT-C взаимодействует друг с другом, образуя хроматиновые петли. В частности, инсулятор AU1 был картирован рядом с Antp P1, опосредуя дальние взаимодействия с другими инсуляторами, расположенными в ANT-C (Li et al., 2018; Рисунок 5a). Недавние эксперименты показали, что физические взаимодействия между Antp P1 и EE1 важны для правильной активации P1 в клеточной бластодерме эмбрионов. Было высказано предположение, что взаимодействие P1-EE1 зависит от контактов между двумя привязывающими элементами (TE и DTE, рис. 5а), поскольку делеция последнего приводит к задержке активации Antp P1 (Batut et al., 2022).

Antp P2 также активен во время эмбриогенеза. Паттерн экспрессии Antp P2 более сложен, чем паттерн экспрессии P1 на стадии клеточной бластодермы. Он достигается за счет комбинаторного воздействия множества активаторов и репрессоров. P2 - это сфокусированный промотор без ТАТА с DPE-боксом (Juven-Gershon et al., 2008). DPE-бокс - это мотив, распознаваемый общими транскрипционными факторами, включая субъединицы TFIID, TAF6 и TAF9 (Burke & Kadonaga, 1996, 1997). Caudal - это HD-транскрипционный фактор, который связывается с промоторами DPE. Caudal может активировать транскрипцию Antp P2 in vitro, как показано в системе с репортером, слитым с областью от +61 до -3031 п.н. вокруг P2 (Juven-Gershon et al., 2008).

ChIP-анализ некоторых белков gap и paire-rule показывает, что они связываются с несколькими сайтами в области 65 кб вверх по течению P2 (Bradley et al., 2010; MacArthur et al., 2009). Например, Fushi tarazu связывается с ранним энхансером 2 (EE2) в хроматине из клеточной бластодермы эмбрионов (MacArthur et al., 2009; Рисунок 5b), который расположен примерно между -15,5 и -17 кб вверх по течению от P2 (Kazemian et al., 2010), и направляет экспрессию Antp на PS4 во время клеточной бластодермы (Рисунок 5c). Более того, ген-репортер, слитый с EE2, повторяет экспрессию транскрипта Antp P2 в PS4, и эта экспрессия сильно снижена у ftz-эмбрионов (Field et al., 2016; Irish et al., 1989). Хроматин вокруг EE2 доступен только на стадии клеточной бластодермы (рис. 5c), как это наблюдалось в ранее представленных данных FAIRE-seq (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) (McKay & Lieb, 2013), что позволяет предположить, что EE2 замалчивается на более поздних стадиях эмбрионального развития за счет поддержания закрытой конформации хроматина. Остальные домены Antp P2, активные на стадии клеточной бластодермы (PS6 и PS14), могут находиться под влиянием EE2 или соседних регуляторных областей, таких как ER1 и/или ER2 (рис. 5a). Будущие эксперименты покажут роль этих регуляторных регионов в других доменах экспрессии Antp, управляемых P2 в эмбрионах клеточной бластодермы.

Классические генетические исследования локуса Antp выявили важность ремоделирования хроматина для правильной экспрессии каждого промотора Antp (Kennison & Tamkun, 1988; Vbzquez et al., 1999). Например, исследования комплекса BRAHMA показали, что он играет решающую роль в активации именно Antp P2 (Kennison & Tamkun, 1988; Vbzquez et al., 1999; см. ниже), это позволяет предположить, что доступность всех этих регионов является важным шагом для активации промотора.

Во время гаструляции белок Ultrabithorax накапливается в задней части эмбриона, подавляя экспрессию Antp в этом регионе (рис. 5b,c). Ultrabithorax связывается с регуляторной областью, расположенной вблизи промотора Antp P2, как было показано в системе in vitro с геном-репортером, слитым с областью от -0,6 до -2 кб вверх по течению от промотора P2 (Boulet & Scott, 1988). Это было подтверждено ChIP-seq анализом Ultrabithorax в хроматине от 0 до 16 ч эмбрионов AEL, показавшим, что Ultrabithorax связывается с областью размером около 300 п.н., расположенной на 1,2 кб вверх по течению от Antp P2 (Shlyueva et al., 2016).

После гаструляции зародышевая полоса втягивается, и экспрессия Antp увеличивается в нервной системе. На поздних эмбриональных стадиях Antennapedia и другие Hox-белки определяют сегментарную идентичность нейральных стволовых клеток (Heuer & Kaufman, 1992; Maurange & Gould, 2005). Поэтому экспрессия Antp должна жестко регулироваться, чтобы обеспечить специфичность определенных линий нейробластов, но большинство этих регуляторных областей остаются плохо описанными. Описаны два поздних эмбриональных энхансера P2, которые направляют экспрессию Antp в сторону грудных ганглиев и периферической нервной системы. Они расположены на 2 и 4 кб выше по течению от P2, соответственно (Boulet & Scott, 1988; рис. 5b,c). Регуляторные области обоих промоторов нуждаются в более глубоком изучении. Например, точное расположение и состояние активности описанных регуляторных элементов может быть уточнено с помощью геномных данных о доступности хроматина, распределении гистоновых меток и ChIP-seq других соответствующих белков в интересующих тканях. Измерения расстояния между ядерными элементами в 3D позволяют предположить, что архитектура ANT-C в ходе эмбриогенеза может иметь складчатую конфигурацию, а не случайную или вытянутую форму (Li et al., 2021).

Дальнейшее изучение экспрессии Antp в ходе развития показало, что в процессе эмбриогенеза она зависит от нескольких специфических промоторных областей. Однако экспрессия Antp также имеет решающее значение на личиночных стадиях. Поэтому экспрессия Antp должна быть точно настроена в мезоторакальных имагинальных дисках с момента их формирования и до появления личинок третьего возраста, поскольку эти диски будут формировать мезоторакальные структуры взрослых особей (см. далее).

Во время ретракции зародышевого диска кластеры эпителиальных клеток в каждом сегменте эмбриона отделяются от эпидермиса, образуя имагинальные диски. Имагинальные диски сохраняют свою сегментную идентичность и пролиферируют на протяжении всего личиночного развития, пока не превратятся в мешковидные эпителиальные структуры (Tripathi & Irvine, 2022). Во время метаморфоза они дифференцируются и становятся частью тела и придатков взрослой мухи. Диски ног и крыльев образуют грудные структуры и придатки взрослой особи, составляющие мезоторакс, и на протяжении трех личиночных стадий Antp сохраняет свою экспрессию, чтобы наделить мезоторакс качественными особенностями.

Имагинальный диск крыла состоит из трех различных типов тканей: собственно диска, периподиальной мембраны и миобластов (Poodry, 1980; рис. 6a). Собственно крыловой диск подразделяется на три различные области: hinge даст начало одноименной структуре в крыле, сумка крылового диска сформирует крыловую лопасть, а нотум способствует формированию взрослых структур грудной клетки.



FIGURE 6 Antp expression during the development of the wing disc. (a) The presence of Antennapedia in different regions of late embryos in the prospective mesothorax (gray), and in first, second, and third instar wing imaginal discs. In the first and second instar wing discs, the presence of Antennapedia is uniform. In the third instar wing discs (front and lateral views), Antennapedia is excluded from the pouch (arrowhead) and is expressed strongly at the anterior margin of the columnar epithelia (CE) and the myoblasts (MB). (b) P1 transcripts are expressed in the columnar epithelia of a third instar wing disc (left, purple), with strong expression in the anterior margin that will form the prescutum, mesopleura, and pteropleura in the adult (right). (c) P2 transcripts are homogeneously expressed in columnar epithelia and myoblasts of the third instar wing discs (left, cyan). Myoblasts will form adult flight muscles (right). (c) Relative transcript abundance encoding AntennapediaLL (gray), and AntenapediaSL (green), according to (Papadopoulos et al., 2019; Stroeher et al., 1988). During embryogenesis, AntennapediaLL is the most abundant isoform. As development progresses, there is a shift in abundance to the AntennapediaSL isoform. The upper bar indicates the developmental stages (E for Embryo and L1–L3 for larvae at three instar stages) and hours after egg laying (AEL).

Antp экспрессируется в собственно дисках крыла и мезоторакальных дисках ног, а также в миобластах галтер и дисков крыла. У личинок третьего возраста Antp экспрессируется на переднем крае нотума крылового диска (рис. 6a) - области, которая будет формировать взрослые торакальные области, известные как прескутум, мезоплевра и птероплевра (Bryant, 1975; Milner et al., 1984). Последние данные показывают, что экспрессия Antp в мешочке крылового диска очень динамична во время личиночного развития (Paul et al., 2021). У личинок первого возраста экспрессия Antp в мешочке довольно однородна и постепенно ослабевает, пока практически не перестает отсутствовать у личинок третьего возраста (Levine et al., 1983; рис. 6а). Снижение экспрессии Antp у личинок первого возраста приводит к уменьшению размера крыла и слабым краевым дефектам крыльев у взрослых мух (Paul et al., 2021), что сходно с аномалиями, наблюдаемыми во взрослых крыльях с аморфными клонами Antp (Struhl, 1982). Как и в эмбриогенезе, для достижения такого сложного паттерна экспрессии в крыловом диске промоторы P1 и P2 регулируются по-разному.

P1 управляет экспрессией Antp в основном вдоль переднего края собственно диска (Engstrцm et al., 1992; Jorgensen & Garber, 1987; рис. 6b), в то время как транскрипты P2 менее многочисленны, чем P1, в этой области и являются единственными транскриптами Antp, присутствующими в миобластах (Jorgensen & Garber, 1987; рис. 6c). Гетероаллельные комбинации мутаций Antp P1 вызывают дефекты развития переднего края собственно крылового диска (Abbott & Kaufman, 1986; Schneuwly & Gehring, 1985), это указывает на то, что именно этот промотор запускает экспрессию Antp в этих регионах. С другой стороны, аналогичные эксперименты с аллелями, вызывающими потерю функции P2, не выявили никаких дефектов, связанных с собственно крыловым диском (Abbott & Kaufman, 1986).

В имагинальных дисках крыльев тримерный транскрипционный комплекс ANTENNAPEDIA авторегулирует экспрессию Antp P1, но не P2, причем субъединицей, связанной с этим механизмом, является AntennapediaSL (Appel & Sakonju, 1993; Boulet & Scott, 1988; Engstrцm et al., 1992). Наиболее многочисленная личиночная AntennpediaSL вызывает умеренную авторепрессию экспрессии транскрипта P1 (Papadopoulos et al., 2019). Поскольку длина линкерной области Antennapedia важна для взаимодействия HX-мотива с кофакторами (Saadaoui et al., 2011), возможно, что транскрипционный комплекс ANTENNAPEDIA, несущий AntennapediaSL, связан с другими кофакторами по сравнению с эмбриональным транскрипционным комплексом, несущим AntennapediaLL.

Этот механизм авторегуляции мало влияет на промоторы Antp во время эмбриогенеза, но впоследствии очень динамичен в ходе развития (Appel & Sakonju, 1993; Boulet & Scott, 1988; Engstrцm et al., 1992; Paul et al., 2021; рис. 6d). Исследования специфических субъединиц ANTENNAPEDIA показали, что Antennapedia авторегулирует активацию P1, связываясь in vitro со специфическими сайтами, расположенными вблизи P1 (Beachy et al., 1988; Krasnow et al., 1989; Saffman & Krasnow, 1994), и что Homothorax регулирует экспрессию Antp в крыловых дисках (Paul et al., 2021). Эксперименты по ChIP-seq трех субъединиц, Antennapedia, Extradenticle и Homothorax в крыловых дисках личинок третьего возраста, показывают, что транскрипционный комплекс ANTENNAPEDIA связывается с несколькими областями перед Antp P1 (Kribelbauer et al., 2020).

Исследование мутаций промотора Antp в присутствии мутаций, кодирующих субъединицы хроматин-ремоделирующего комплекса BRAHMA, показало, что он играет решающую роль в активации именно Antp P2 (Kennison & Tamkun, 1988; Vbzquez et al., 1999). Особи с гетероаллельными комбинациями мутаций Antp P2 и генов, кодирующих субъединицы BRAHMA, демонстрируют фенотип held-out крыльев, вероятно, обусловленный дефектами грудных мышц и/или нервной системы на определенном этапе развития, это указывает на то, что для правильной экспрессии P2 требуется воздействие и/или окклюзия соответствующих регуляторных элементов, и этот шаг должен быть облегчен ремоделированием хроматина. Вероятно, P2 регулируется несколькими регуляторными регионами в крыловых дисках, о чем свидетельствуют различия в данных о доступности хроматина (McKay & Lieb, 2013). Важность промотора Antp P2 в развитии крылового диска изучена недостаточно полно. Например, поскольку только транскрипты P2 экспрессируются в миобластах крылового и гальтерного дисков (Jorgensen & Garber, 1987), будет интересно найти регуляторные области, которые управляют экспрессией Antp в этом типе клеток. Насколько нам известно, регуляторные регионы Antp P2 в имагинальном диске точно не картированы. Будущая работа должна быть направлена на поиск и изучение P2-специфичных регуляторных регионов в личиночных тканях.

Развитие мезоторакса начинается на стадии клеточной бластодермы с началом экспрессии Antp. С тех пор оба промотора Antp дифференциально регулируются, обеспечивая сложный паттерн экспрессии в различных PSs эмбриона. С момента начала экспрессии Antp его присутствие неизменно сохраняется в мезоторакальных тканях на протяжении всего развития организма. Будет интересно уточнить знания о промотор-специфической экспрессии транскриптов Antp в разных типах клеток на разных стадиях развития с помощью новых технологий, таких как РНК-секвенирование одиночных клеток (scRNA-seq) и ATAC-seq (scATAC-seq), полученные от одиночных клеток эмбриональных, личиночных и взрослых тканей (Calderon et al., 2022; Li et al., 2022). Наличие двух промоторов в локусе Antp сохраняется и у других представителей рода Drosophila (Hooper et al., 1992), что подчеркивает их значение в тонкой регуляции экспрессии Antp во время развития мезоторакальных тканей у всех видов Drosophila.

Формирование мезоторакса во многом зависит от того, как транскрипционные комплексы ANTENNAPEDIA взаимодействуют с местным ко-факторным окружением для активации или подавления экспрессии своих целевых генов в различных типах клеток. Ранняя эмбриональная сборка транскрипционного комплекса ANTENNAPEDIA частично регулируется доступностью его субъединиц до середины гаструляции, это указывает на то, что этот комплекс действует на хроматин тканей, которые уже имеют эндо-, мезо- или эктодермальную идентичность. Поэтому в будущих экспериментах следует сравнить интеракторы Antennapedia в разных типах клеток, чтобы показать, как контекстно-специфические факторы могут изменить транскрипционный результат. Например, будет интересно сравнить интеракторы AntennapediaLL и AntennapediaSL у эмбрионов и личинок, соответственно, с помощью BiFC. Будущие исследования должны определить, могут ли AntennapediaSL и AntennapediaLL связываться с ко-факторами, специфичными для изоформ, и имеют ли они разное сродство к субъединицам Extradenticle и Homothorax. Кроме того, в будущих экспериментах можно объединить одноклеточные протеомные и транскриптомные методы, чтобы лучше понять, как транскрипционные комплексы ANTENNAPEDIA определяют судьбу различных тканей в процессе развития.