Стабильность генома имеет решающее значение для выживания клетки и, как следствие, организма. Клеточная ДНК постоянно подвергается атакам различных повреждений, вызываемых как экзогенными агентами, например генотоксичными химическими веществами, так и эндогенными факторами, например реактивными видами кислорода, образующимися в ходе нормального клеточного метаболизма (Chatterjee and Walker, 2017). Различные типы повреждений могут приводить к однонитевым и двунитевым разрывам ДНК, модификации оснований, перекрестным сшивкам и т.д. В результате повреждений в клетках развиваются механизмы репарации ДНК, которые позволяют предотвратить накопление повреждений ДНК. Для обеспечения безошибочной репликации в цикле взрослой соматической клетки повреждения ДНК обнаруживаются и репарируются до или во время репликации генома (Hu et al., 2015).

Рыбы обитают в разнообразных морских и пресноводных экосистемах и подвергаются воздействию повреждающих ДНК факторов на всех стадиях развития. Оплодотворенные извне эмбрионы рыб развиваются в водоемах, что делает их восприимчивыми к повреждениям ДНК, вызванным ксенобиотическими агентами, такими как генотоксичные химические вещества, металлы, пестициды, синтетические гормоны и т.д., а также факторами окружающей среды, такими как радиация, тепло и т.д. У позвоночных животных сформировалось несколько путей устойчивости к ксенобиотикам, таких как ABC-транспортеры или UDP-глюкоуронилтрансферазы (Ugts) (Li and Wu, 2007). Ugts - это семейство ферментов II фазы метаболизма лекарств, играющих роль в детоксикации ксенобиотиков (Huang and Wu, 2010; Wang et al., 2014). Тем не менее многочисленные антропогенные химические вещества попадают внутрь клеток и могут вызывать значительные повреждения ДНК. Ранние стадии развития особенно восприимчивы к воздействию ксенобиотиков, поскольку была зафиксирована зависимая от развития экспрессия ugt-транскриптов (Christen and Fent, 2014). Кроме того, генотоксиканты могут оказывать долгосрочное воздействие, что было продемонстрировано на примере Gasterosteus aculeatus (Santos et al., 2013), и вызывать эпигенетические изменения с трансгенерационным эффектом у рыб (обзор Terrazas-Salgado et al., 2022). В период раннего эмбрионального развития репликация ДНК и пролиферация клеток происходят быстро, а клеточный цикл проходит без G1 и G2 до перехода к середине ст. бластулы (Kermi et al., 2017). Таким образом, для предотвращения мутаций в активно пролиферирующих клетках во время раннего эмбрионального развития репарация ДНК является критически важной (Levine, 2004; Nordman and Orr-Weaver, 2012).

Большинство исследований, посвященных изучению путей репарации ДНК, проводилось на рыбах данио (Danio rerio) (обзор Pei and Strauss, 2013; Canedo and Rocha, 2021). Однако в ряде работ описана репарация ДНК у других видов рыб, включая Xiphophorus (обзор David et al., 2004), Kryptolebias marmoratus (Rhee et al., 2011) и медаки, Oryzias latipes (Armstrong et al., 2002; Barjhoux et al., 2014). Base excision repair (BER), репарация эксцизии нуклеотидов (NER), фотоферментная репарация, прямая реверсия (DR), репарация несоответствий (MMR), гомологичная рекомбинация (HR) и негомологичное соединение концов (NHEJ) - все эти пути репарации ДНК хорошо известны у рыб (Pei and Strauss, 2013). Однако белки, участвующие в путях репарации ДНК, по-видимому, выполняют не только функции исправления ошибок в ДНК. Они также участвуют в важнейших путях метаболизма ДНК в процессе развития (Shin et al., 2021). Тот факт, что белки, отвечающие на повреждения ДНК (DDR), демонстрируют сложные стадийные и тканеспецифические паттерны экспрессии и активности (Sun et al., 2019), может указывать на их роль в регуляции развития и органогенеза (обзор Friedberg and Meira, 2000; рис. 1).



FIGURE 1. DNA repair proteins are involved in both, normal embryo development, and DNA damage response. (A). During normal embryo development DNA repair proteins participate in organogenesis. (B). Genotoxicant exposure at embryonic stage can impair normal organogenesis. Genotoxicants induce DNA damage, which requires activity of DNA repair proteins. DNA damage response include changes in expression of DNA repair genes and proteins, changes in DNA-protein interactions, and affect the localization of DNA repair proteins. Taken together, these alterations may affect function of DNA repair proteins in organogenesis. This can consequently result in malformation.

Кроме того, мы предполагаем, что некоторые экзогенные повреждающие агенты могут нарушать функцию белков репарации ДНК. Любое изменение экспрессии или локализации этих белков в результате генотоксического стресса может повлиять на их роль в развитии и привести к порокам развития (рис. 1). Цель данного обзора - обобщить имеющиеся литературные данные о роли генов и белков репарации ДНК в развитии эмбрионов рыб и изучить взаимосвязь между формированием аномального фенотипа и нарушением путей развития при генотоксическом стрессе.

DDR - это путь передачи сигнала, который обнаруживает повреждение и запускает скоординированный клеточный ответ для защиты клетки. Ответ на повреждение ДНК может различаться в зависимости от стадии развития. Поэтому определение сроков экспрессии генов в эмбрионах очень важно для понимания динамики регуляции генов (Chechik and Koller, 2009).

Мы обобщили различные стадии развития эмбриона в отношении путей DDR (рис. 2). Большинство имеющихся в литературе исследований было выполнено на модели рыбок данио, однако важно учитывать, что сроки развития у разных видов рыб существенно различаются. Кроме того, информация об экспрессии генов DDR на разных стадиях развития у других рыб весьма скудна. Поэтому в настоящем обзоре мы приводим данные о развитии эмбриона и формировании механизмов репарации ДНК в основном для рыбок данио (рис. 2). Будущие исследования должны восполнить пробел в знаниях о DDR в эмбрионах немодельных видов рыб.



FIGURE 2. Scheme of zebrafish embryo development and main events in activation of DNA damage response. Developmental stages and approximate hours post-fertilization (at 28.5°C) for each stage are shown from cleavage (first cell divisions) to hatching (based on Kimmel et al., 1995). The mid-blastula transition (MBT) marks changes in cell cycle and activation of checkpoints. Activation of zygotic transcription at this stage is associated with expression of some DNA repair genes.

Развитие эмбриона рыбы начинается с серии синхронных и быстрых клеточных циклов (стадия дробления) (Kane and Kimmel, 1993). В отличие от взрослых особей, эмбрионы на стадии дробления проходят через S- и M-фазы без G1 и G2 (Siefert et al., 2015). Большинство зиготических генов молчат, и эмбрион в своем развитии полагается на материнские мРНК (Zhang et al., 2014). К материнским транскриптам репарации ДНК относятся: xrcc1, unga, lig3 для BER; xpc, ccnh, xpd и xpb для NER; msh6 и msh2 для MMR; rad51b, rad51c, rad54, brca2 и mre11a для HR; xrcc4, xrcc5, xrcc6 и lig4 для NHEJ (Honjo and Ichinohe, 2019; Silva et al., 2012; Wu et al., 2014; рис. 2).

Хотя у зигот и эмбрионов ранних стадий присутствует некоторая активность по репарации ДНК, их способность распознавать повреждения ДНК и реагировать на них снижена. Таким образом, регуляция контрольных точек различается между эмбриональными и взрослыми соматическими клетками (Munisha and Schimenti, 2021). Контрольные точки выявления повреждений ДНК - это механизмы, связывающие репарацию ДНК с событиями клеточного цикла. Контрольные точки останавливают клеточный цикл и дают поврежденной ДНК время на репарацию, либо инициируют апоптоз, если репарация невозможна (Hartwell and Kastan, 1994; Ford and Kastan, 2020). Однако у эмбрионов рыб на стадии дробления клеточные деления не подвергаются воздействию ингибиторов репликации ДНК или повреждающих ДНК агентов (Ikegami et al., 1997). Этот факт свидетельствует о нарушении checkpoint активности на ранних стадиях. После дробления происходит mid-blastula transition (MBT), который характеризуется удлинением клеточного цикла, потерей синхронности клеток и активацией контрольных точек (Kane and Kimmel, 1993; Ikegami et al., 1999). У рыб MBT соответствует активации зиготической транскрипции (Tadros and Lipshitz, 2009). При MBT удлиняется S-фаза, что соответствует необходимости наличия контрольной точки репликации ДНК у эмбрионов рыбок данио (Siefert et al., 2015).

Кроме того, механизм обнаружения поврежденной ДНК у рыбок данио неэффективен до 4hpf (Honjo and Ichinohe, 2019). Было обнаружено, что эмбриональные клетки на ст. 2hpf не способны формировать фосфорилированные фокусы H2AX (γH2AX). Образование γH2AX является консервативным механизмом раннего распознавания и ответа на двухцепочечные разрывы ДНК (Podhorecka et al., 2010). Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что такие механизмы, как распознавание повреждений ДНК, активация контрольных точек и апоптоз, нарушаются на ранних стадиях развития эмбрионов рыб. Это может быть адаптационной стратегией, обеспечивающей деление эмбриональных клеток даже в неблагоприятных условиях (Warkentin, 1995; Kermi et al., 2019). Задержка активации контрольной точки после МВТ может обеспечивать временные рамки для индукции цитогенетических повреждений ДНК-повреждающими агентами в развивающемся эмбрионе (Ikegami et al., 1997).

После стадии дробления со стадии 128 клеток до момента гаструляции начинается бластуляция (Kimmel et al., 1995; рис. 2). После MBT формируется желточный синцитиальный слой и начинается эпиболия. Далее, на стадии гаструляции, в результате морфогенетических перемещений клеток формируются первичные зародышевые слои и эмбриональная ось. Формируются эпибласт и гипобласт, которые дадут начало эктодерме, мезодерме и эндодерме. На стадии сегментации развиваются сомиты и начинается органогенез. Выделяется хвостовая почка, появляются первые движения тела. На следующей стадии, pharyngula, ось тела выпрямляется после раннего искривления вокруг желточного мешка, начинается развитие кровообращения, пигментации и плавников. Наконец, вылупление происходит, когда морфогенез первичных органов завершен, хрящи развиты в голове и грудном плавнике (Kimmel et al., 1995).

Экспрессия белков репарации ДНК временно регулируется в ходе органогенеза и может быть локализована в определенных органах и тканях (Vinson and Hales, 2002). Кратко охарактеризуем стадио-специфическую активность основных путей репарации ДНК в развивающихся эмбрионах (рис. 2; табл. 1). TABLE 1. Summary of the expression, localization and developmental role of zebrafish DNA repair genes and proteins during embryonic development. ND stands for "not determined". KD stands for knockdown.

BER - это критическая репарационная система, которая функционирует на всех стадиях развития рыб (Pei and Strauss, 2013). Небольшие повреждения оснований, вызванные деаминированием, окислением или метилированием, восстанавливаются с помощью BER. Этот путь состоит из нескольких этапов: распознавания повреждения ДНК, замены поврежденного основания и восстановления структуры ДНК. Более подробно, ДНК-гликозилазы распознают несовпадающее или модифицированное основание ДНК (Chatterjee and Walker, 2017). К таким гликозилазам относятся 8-оксогуаниновая ДНК-гликозилаза (Ogg1), урацил-ДНК-гликозилазы (Udg), Nth-подобная ДНК-гликозилаза 1 (Nthl1) и другие. После распознавания повреждения ДНК-гликозилаза удаляет несоответствующее основание, в результате чего образуется апуриновый или апиримидиновый участок, который затем расщепляется в 5' участке апуриновой эндонуклеазой (Ape1), оставляя свободным 3' участок. Впоследствии ДНК-полимераза β (Polβ) заменяет недостающий нуклеотид, а образовавшийся пропуск лигируется комплексом Xrcc1-Lig3α для восстановления исходной структуры ДНК (Pei and Strauss, 2013; Canedo and Rocha, 2021).

Примечательно, что активность BER в яйцах и ранних стадиях развития эмбрионов рыбок данио имеет ряд отличительных особенностей и менее эффективна, чем у взрослых особей (Fortier et al., 2009). Бесклеточные экстракты из яиц были способны удалять U-G несоответствующие пары и вставлять правильную пару оснований. Однако эффективность Udg и Ape1 у старых эмбрионов рыбок данио, находящихся в стадии 3,5 hpf, ниже, чем у взрослых особей (Fortier et al., 2009). Более того, в том же исследовании было показано, что эмбрион ранней стадии рыбок данио обладает дополнительной Mg2+-зависимой эндонуклеазой (Apex), в то время как взрослые особи обладают единственной основной Ape1.

Хотя мРНК для Polβ присутствовала на всех стадиях эмбриогенеза, в яйцах и эмбрионах рыбок данио до гаструляции отсутствовал репликативный белок Polβ, вместо него присутствовала ДНК-полимераза, чувствительная к афидиколину (Fortier et al., 2009). Pei et al. (2011) показали, что Apex регулирует транскрипцию creb1 и его партнеров по связыванию, которые, в свою очередь, регулируют экспрессию Polα в эмбрионах рыбок данио перед гаструляцией. Неясно, у всех ли видов рыб отсутствует белок Polα на ранних стадиях развития или это особенность, присущая только рыбкам данио. Однако в другом исследовании было обнаружено, что Polα имеет очень низкую активность на ранних стадиях развития Misgurnus fossilis (вьюн) по сравнению с полимеразами α и γ (Mikhailov and Gulyamov, 1983).

DR в основном решает проблему алкилирования в положении O⁶ гуанина (O⁶-алкилгуанина) с помощью O-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (O⁶-Mgmt), которая удаляет алкильную группу из положения O⁶ гуанина в поврежденной ДНК (Gasch et al., 2017). Rhee et al. (2011) выявили более низкие уровни транскриптов мРНК mgmt у эмбрионов на ст. 12 dpf и молоди K. marmoratus по сравнению со взрослыми особями. Этот факт может свидетельствовать о большей восприимчивости к повреждению ДНК алкилирующими агентами на ранних стадиях развития.

NER-путь в основном работает с повреждениями, деформирующими спираль, такими как пиримидиновые димеры, сшивки ДНК и крупные аддукты. Таким образом, этот путь отвечает за репарацию фотопродуктов, вызванных УФ-излучением, а также повреждений ДНК, вызванных химическими канцерогенами и химиотерапевтическими препаратами. Модифицированное основание сначала распознается комплексом распознавания повреждений Xpc (Xeroderma pigmentosum group C), что приводит к раскручиванию спирали ДНК. В качестве альтернативы используется вспомогательный комплекс распознавания повреждений (UV-Ddb), состоящий из двух субъединиц - Ddb1 и Xpe (Ddb2) (Dexheimer, 2013). После обнаружения начального повреждения транскрипционный фактор IIH (TfIIh) и Xpa рекрутируются в этот участок для подтверждения повреждения ДНК. Затем ДНК расщепляется в 3' и 5' позициях повреждения нуклеазами Xpg и Xpf, в результате чего повреждение удаляется. Наконец, используя неповрежденную нить в качестве шаблона, ДНК-полимеразы повторно синтезируют, заполняя разрыв, а ДНК-лигаза заклеивает выемку в восстановленной нити.

Экспрессия и активность белков, участвующих в NER-пути, по-видимому, регулируются в процессе развития (Hsu et al., 2001). Hsu et al. (2001) предположили, что в эмбрионах рыбок данио на разных стадиях развития, в отличие от взрослых особей, экспрессируются различные факторы связывания ДНК с UV-повреждениями. В том же исследовании была обнаружена регулируемая развитием экспрессия Xpa у рыбок данио. Экспрессия белка Xpa была обнаружена не ранее 84 hpf. Позднее Shen et al. (2017) подтвердили, что вителлогенин-1-подобный белок в эмбрионах рыбок данио играет роль фактора связывания УФ-поврежденной ДНК, и выявили его функцию на пост-инцизионном этапе NER (Shen et al., 2017).

MMR - это эволюционно консервативный путь пост-репликативной репарации для восстановления несовпадений оснований, инсерции и делеции нуклеотидов. MMR начинается с распознавания несовпадений оснований гетеродимером MutSα (Msh2/Msh6) и гетеродимером MutSβ (Msh2/Msh3) (Chatterjee and Walker, 2017). После этого в комплекс рекрутируются такие молекулы, как ядерный антиген пролиферирующих клеток (Pcna), фактор репликации C, MutLα и экзонуклеаза one, что приводит к диссоциации несоответствий (Liu et al., 2017; Pecina-Slaus et al., 2020). Разрыв эксцизии стабилизируется репликационным белком A (Rpa) (Genschel and Modrich, 2003). Наконец, ДНК-полимераза δ перекидывает мост через разрыв, а ДНК-лигаза I соединяет нить (Li, 2008; Li, 2013).

Уровни транскриптов Msh2 и msh6 были выше у личинок рыбок данио на 12-36 hpf, чем на 84 hpf (Yeh et al., 2004). Кроме того, продукция мРНК msh2 постепенно снижалась в 60-120 hpf рыбок данио. Авторы связали снижение экспрессии гена msh2 с уменьшением числа активно растущих клеток по мере созревания рыбок данио. Однако остается неясным, каким образом дифференцировка или рост клеток активируют экспрессию Msh в эмбрионах рыб.

Гомологичная рекомбинация - это шаблоном направленный, высокоточный путь репарации, который используется для восстановления двунитевых разрывов (DSB), разрывов ДНК и межнитевых сшивок ДНК. Сначала комплекс MRN (Mre-Rad50-Nbs1) инициирует репарацию, распознавая и связывая DSB (Chatterjee and Walker, 2017). Белок экзонуклеаза/эндонуклеаза/фосфатазный домен-1 (Eepd1) необходим для инициации HR и перезапуска репликации на остановленных вилках (Wu et al., 2015). Затем Rpa связывается с одноцепочечными хвостами ДНК, активируя киназный путь Atr. В результате рекомбиназа Rad51 проникает в гомологичную область и замещает Rpa. Наконец, ДНК-полимераза δ удлиняет и запечатывает вторгшуюся цепь с помощью ДНК-лигазы (Reinardy et al., 2013).

Brca1 и Brca2 - два основных фактора, играющих критическую роль в HR-пути путем рекрутирования Rad51 в окрестности DSBs (Vierstraete et al., 2017). Vierstraete et al. (2017) наблюдали активное участие Brca1 и Brca2 в HR-пути у эмбриона рыбок данио 72 hpf, что свидетельствует о вовлечении HR в репарацию DSB в развивающихся эмбрионах рыбок данио. Кроме того, CRISPR-Cas9-опосредованный нокдаун генов HR, таких как mre11a и wrn, приводил к гибели эмбрионов на 60 dpf (Shin et al., 2021).

NHEJ - это основной путь репарации ДНК DSBs, который активен в фазах G1 и ранней S. Путь NHEJ в основном опосредуется пятью генами: xrcc5, кодирующим белок Ku80, xrcc6, кодирующим белок Ku70, lig4 и xrcc4, кодирующими две субъединицы ДНК-лигазы, prkdc, кодирующим ДНК-зависимую протеинкиназу (Bladen et al., 2005; Bladen et al., 2007). Гетеродимер Ku70/80 связывается с двумя концами разорванной молекулы ДНК, образуя комплекс белок-ДНК, который привлекает каталитическую субъединицу ДНК-зависимой протеинкиназы. После этого концы разорванных молекул ДНК обрабатываются различными ферментами, такими как Artemis, полимеразы λ и µ, тирозил-ДНК фосфодиэстераза или полинуклеотидкиназа. Наконец, ДНК склеивается комплексом лигаза 4-Xrcc4 (Sonoda et al., 2006; Canedo and Rocha, 2021).

Было показано, что нокдаун гена lig4 (ген лигазы 4) у эмбрионов рыбок данио приводит к значительному нарушению пути NHEJ и гибели на ст. 24 hpf (Liu et al., 2012). Напротив, в том же исследовании было показано, что нокдаун гена rad51, вызванный морфолином, нарушает HR-путь и приводит только к порокам развития у эмбрионов 48 hpf. Можно предположить, что NHEJ является преобладающим путем репарации DSB на ранних стадиях развития эмбриона (Liu et al., 2012; Vierstraete et al., 2017; Canedo and Rocha, 2021). В то время как HR активен на более поздних стадиях и играет важную роль в органогенезе (см. ниже).

Помимо участия в путях репарации ДНК некоторые из упомянутых выше генов и белков играют важную роль в органогенезе эмбрионов рыб. В этой части мы кратко подведем итог тому, что известно о двойном функционировании факторов репарации ДНК. В большинстве имеющихся в литературе исследований роль репарации ДНК в органогенезе оценивалась путем нокаута и нокдауна определенных генов. Это позволяет исследователям оценить фенотип эмбриона, указывающий на то, какой путь развития требует определенного белка репарации ДНК. Другой подход ориентирован на локализацию экспрессии генов или белков внутри эмбриона. В табл. 1 мы обобщили имеющуюся информацию о нескольких генах репарации ДНК, касающуюся их локализации и фенотипов, характерных для нокдауна.

Было обнаружено, что несколько белков, входящих в состав BER-пути, участвуют в развитии эмбрионов рыб. Так, например, Wang et al. (2006) показали, что нокаут apex1 у ранних рыбок данио позволяет эмбриону выживать до ст. 7 dpf с отеком перикарда и отсутствием циркулирующих эритроцитов. Это исследование показало, что apex1 играет роль не только в развитии сердечно-сосудистой и кроветворной систем, но и в развитии нейронов и хорды (Wang et al., 2006). Далее Pei et al. (2019) показали, что потеря белка Apex1 в эмбрионах рыбок данио приводит к аномальному распределению и потере четырех ключевых факторов транскрипции мозга (fezf2, otx2, egr2a и pax2a). Это приводило к аномальному развитию мозга, включая маленькую голову и деформацию желудочков (Pei et al., 2019).

Wu et al. (2014) использовали гибридизацию in situ по всей поверхности для выявления пространственно-временной экспрессии материнской мРНК unga (урацил-ДНК гликозилазы a) в эмбрионах и личинках рыбок данио. На ранней стадии дробления unga был равномерно распределен, но во время сегментации на ст. 5 hpf он локализовался в нервной трубке и хвостовом бутоне. Его нокдаун приводил к увеличению глобального метилирования ДНК, снижению общей транскрипционной активности в ядре и эмбриональной летальности в период сегментации (Wu et al., 2014).

В ряде работ изучалась роль Ogg1 в развитии эмбрионов рыбок данио. Gu et al. (2013) изучали пространственно-временную экспрессию ogg1 в эмбрионе рыбок данио. Были получены данные о локализации мРНК ogg1 в зоне желудочков среднего мозга рыбок данио на ст. 17-24 hpf, в сетчатке (на 24-36 hpf) и в периферических нервах (на ст. 48 hpf). Кроме того, потеря ogg1 приводила к развитию аномальных мозговых пузырей с уменьшенным размером желудочков и деструкцией границы между средним и задним мозгом (Gu et al., 2013). Помимо функции в развитии мозга, Ogg1, по-видимому, играет роль в развитии сердца и кровеносной системы. Yan et al. (2013) исследовали значительную роль ogg1 в формировании кардиомиоцитов у рыбок данио. Нокдаун ogg1 привел к заметному снижению экспрессии nkx2.5 (фактора, определяющего судьбу кардиомиоцитов во время гаструляции) и репрессии foxh1 (важного партнера ogg1 в развитии сердца в ответ на повреждение ДНК) (Yan et al., 2013). Потеря nkx2.5 и foxh1 приводила к усилению апоптоза, снижению пролиферации и эмбриональной летальности на ст. 5 hpf (Yan et al., 2013).

Hu et al. (2015) исследовали роль ddb1, важного компонента NER-пути, в развитии эмбрионов рыбок данио. Мутантный аллель ddb1^m863 был получен путем химического мутагенеза с использованием N-этил-N-нитрозомочевины. В результате мутации белок Ddb1 оказался усеченным. Полученные мутанты демонстрировали выраженный фенотип с уменьшенным размером и аномальным строением глаз, мозга и скелета головы на ст. 3 hpf. Они также сообщили о повсеместной экспрессии мРНК ddb1 у ранних эмбрионов дикого типа, которая на третьи сутки развития ограничивается центральной нервной системой (ЦНС), скелетом головы, фарингеальной областью и эндодермой. Также была обнаружена корреляция между pcna, маркером пролиферации, и уровнем экспрессии ddb1, что указывает на зависимость пролиферации клеток от высокого уровня экспрессии ddb1 (Hu et al., 2015). Аналогичным образом, в работе Shin et al. (2021) с помощью CRISPR/Cas9-опосредованного мутагенеза были получены гомозиготные мутанты с нокаутом ddb1 и показано, что у мутантов ddb1-/- уже на ст. 6 hpf по сравнению с немутантными эмбрионами рыбок данио наблюдаются передние пороки развития с дефектами строения глаз и челюстей. Хотя фенотипы, наблюдаемые в обоих исследованиях, были сходными, сроки формирования фенотипов различались. Это может быть связано с генетической компенсацией у CRISPR-мутантов (Shin et al., 2021).

В ряде работ изучалась роль репарации mismatch белков - Msh2, Msh6 и Pcna - в развитии эмбрионов рыбок данио. Так, экспрессия Msh2 была обнаружена в мозге и вокруг глазного примордия эмбрионов рыбок данио на стадии шести сомитов (12 hpf) (Yeh et al., 2004). На стадии фарингулы (24 hpf) синтез мРНК msh2 был локализован в области головы. На стадиях 48 и 60 hpf экспрессия msh2 концентрировалась в теленцефалоне, тканях вокруг глаз и четвертом желудочке (Yeh et al., 2004).

Кроме того, было показано, что нокаутные рыбки данио - мутанты msh2 и msh6 склонны к развитию опухолей и преимущественно развивают нейрофибромы/злокачественные опухоли оболочек периферических нервов в области глаз и брюшной полости (Feitsma et al., 2008). Интересно, что расположение опухолей соответствовало экспрессии мРНК на эмбриональной стадии. Кроме того, уровни msh2 и msh6 были выше в активно дифференцирующихся клетках (Yeh et al., 2004). Было установлено, что белок Msh2 участвует в пролиферации, прогрессии клеточного цикла и апоптозе в тканях и опухолях млекопитающих (обзор Seifert and Reichrath, 2006). Однако неясно, как именно экспрессия белка Msh2 связана с регуляцией клеточного цикла, особенно на эмбриональной стадии у рыб.

Вероятно, наиболее известным примером белка репарации ДНК, играющего важную роль в развитии, является Pcna. Этот белок участвует как в пролиферации, так и в репарации ДНК. У эмбрионах рыбок данио Shin et al. (2021) обнаружили, что мутация со сдвигом рамки в pcna приводит к уменьшению размеров головы и глаз, к формированию искривленного туловищного ствола и усилению апоптоза в хвостовой кроветворной ткани (Shin et al., 2021). Ранее Leung et al. (2005) показали, что Pcna экспрессируется в головном и спинном мозге, а также в промежуточной клеточной массе эмбрионов рыбок данио на ст. 24 hpf (Leung et al., 2005). Таким образом, пороки развития, наблюдаемые у pcna-мутантов (Shin et al., 2021), коррелируют с тканями, экспрессирующими наибольшее количество Pcna в процессе развития.

Два основных пути репарации DSB, по-видимому, играют важную роль в развитии эмбриона рыб. Например, Eepd1 способствует HR и ингибирует NHEJ. Chun et al. (2016) предположили, что эндонуклеаза Eepd1 участвует в сомитогенезе и поддерживает стабильность генома у эмбрионов рыбок данио в условиях эндогенного репликационного стресса, вызванного быстрым делением клеток в ходе эмбриогенеза. Нокдаун белка Eepd1 приводит к задержке развития, повышенной летальности и порокам развития. Хотя NHEJ является преобладающим путем репарации ДНК на ранних стадиях развития эмбриона, HR также участвует в поддержании стабильности генома во время клеточной пролиферации (Chun et al., 2016).

В работе Shin et al. (2021) с помощью мультиплексного CRISPR-мутагенеза были получены мутанты генов, связанных с репарацией HR, у рыбок данио. Интересно отметить, что гомозиготные мутанты по генам brca2, blm, rad54l и rad51 развивали фенотип, не связанный с мужским полом. Мутанты rad54l демонстрировали нормальную фертильность, в то время как у мутантов brca2 и rad51 примордиальные половые клетки не выживали и не пролиферировали, что приводило к бесплодию самцов (Shin et al., 2021). Shive et al. (2010) сообщили о незаменимой роли brca2 в развитии яичников в процессе половой дифференцировки у линии рыбок данио с мутацией в 11-м экзоне brca2 (brca2Q658x). Гомозиготные мутанты brca2Q658x развивались как бесплодные самцы с мейотической остановкой сперматоцитов. Это показало, что brca2 необходим не только для развития яичников, но и для сперматогенеза (Shive et al., 2010). Белки репарации DSB, в частности Brca2, Dmc1 и Rad51, играют важную роль в мейозе у рыбок данио (обзор Sansam and Pezza, 2015; Imai et al., 2021). Хотя половая дифференцировка у рыбок данио происходит на ст. 20-25 hpf, нарушение работы белков HR на ранних стадиях развития может приводить к аномальному развитию гамет и апоптозу. Более того, нарушение HR-пути было связано с повышенным риском развития опухолей в гонадах (Shive et al., 2010; Shin et al., 2021).

В развивающемся мозге и ЦНС рыбок данио обнаружено несколько факторов пути NHEJ. Так, мРНК Ku80 равномерно экспрессируется в 2-клеточных бластомерах, на протяжении гаструляции, до конца сомитогенеза в стю 24 hpf эмбрионов рыбок данио и становится пространственно ограниченной в развивающейся сетчатке, передней части ЦНС и глазном пузырьке (Bladen et al., 2005). Аналогичным образом экспрессия мРНК Ku70 увеличивается у эмбрионов на ст. 24 hpf, остается повышенной до 72 hpf и пространственно экспрессируется в развивающейся ЦНС, включая зоны желудочков мозга и презумптивный слой ганглиозных клеток сетчатки (Bladen et al., 2007). Однако только при воздействии на эмбрионы низких доз ионизирующего излучения морфолино-опосредованный нокдаун Ku70 влиял на эмбриогенез рыбок данио (Bladen et al., 2007).

Приведенные выше исследования показывают, что гены репарации ДНК экспрессируются пространственно-временным образом в процессе органогенеза. Однако их непосредственная роль в органогенезе и механизм, лежащий в основе многофункциональности белков репарации ДНК, еще не изучены. Для понимания этиологии дефектов органогенеза в ответ на воздействие генотоксикантов необходимы дополнительные исследования роли белков репарации ДНК в процессе развития.

Генотоксиканты - это вещества, содержащиеся в окружающей среде, которые непосредственно связываются с ДНК или воздействуют на ферменты репарации ДНК, вызывая ее повреждение. Клетки обнаруживают генотоксический стресс и реагируют на него изменением транскрипции генов (Gasch et al., 2017), количества белков (Nouspikel, 2009; Soufi et al., 2009), пост-трансляционной модификации белков (Peng et al., 2003; Ptacek et al., 2005) или внутриклеточной локализации белков (Tkach et al., 2012). Загрязняющие вещества также могут вызывать повреждение ДНК, вмешиваясь в механизмы репарации ДНК. Мы предполагаем, что любое нарушение экспрессии генов репарации ДНК в ответ на воздействие генотоксикантов в период эмбрионального развития может нарушить их развивающую роль, что приведет к нарушению органогенеза. В табл. 2 приведены данные о влиянии различных ксенобиотиков на развивающиеся эмбрионы рыб, об экспрессии генов репарации ДНК и о индуцированных фенотипах. В данной главе представлен обзор исследований, посвященных изучению воздействия токсикантов на эмбрионы рыб, связанного с изменением экспрессии генов DDR и формированием фенотипов.

TABLE 2. Effect of xenobiotics on expression of DNA repair genes and proteins during fish embryogenesis and corresponding abnormality induced.

Эфиры фталатной кислоты - широко распространенные пластификаторы, часто обнаруживаемые в воде, которые, по имеющимся данным, вызывают окислительное повреждение ДНК (Berge et al., 2013). Воздействие фталатных эфиров, включая дибутилфталат (DBP), моно-(2-этилгексил)фталат (MEHP) и ди-(2-этилгексил)фталат (DEHP), на эмбрионs рыбок данио на ст. 4 hpf в течение 96 ч привело к изменению экспрессии BER-пути (Lu et al., 2021). После воздействия DBP повышался уровень мРНК ogg1, lig3, unga, pcna, pold, fen1 и lig1. Воздействие DEHP привело к повышению уровня мРНК ogg1, parp1, pcna, fen1 и lig1 и снижению экспрессии pold. Уровни мРНК ogg1, nthl1, apex1, parp1, lig3, pcna и polb увеличивались после воздействия 10 и 25 microМ MEHP и снижались при 50 мкМ (Lu et al., 2021). Интересно, что изменения в экспрессии генов были связаны с изменениями в поведении, с пороками развития и частотой вылупления во всех вариантах обработки.

Оксид графена (GO) - углеродный наноматериал, имеющий многочисленные применения в биологии и медицине (Ni et al., 2013). Воздействие GO связано с окислительным повреждением ДНК (Seabra et al., 2014). После воздействия наночастиц GO на эмбрионы рыбок данио на стадии бластулы в течение 24 ч наблюдалась повышенная регуляция генов apex1, ogg1, polb и creb1 (Lu et al., 2017). Авторы не обнаружили существенных различий в морфологии эмбрионов, их выживаемости и скорости вылупления. Обработка теми же наночастицами на 72 hpf, напротив, привела к порокам развития личинок и нейротоксичности (Ren et al., 2016).

При воздействии метилпирена, содержащегося в осадочных породах, с 1 до ст. 9 hpf у медаки (O. latipes) наблюдалось увеличение экспрессии ogg1 (Barjhoux et al., 2014). Метилпирен - polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH), потенциальный канцероген, попадающий в окружающую среду в результате неполного сгорания органических веществ, ископаемого топлива и других источников. В данном исследовании не наблюдалось значительного увеличения уровня разрывов нитей ДНК после обработки, что может быть связано с эффективным механизмом репарации повреждений ДНК (Barjhoux et al., 2014). Тем не менее, повышение уровня ogg1 было связано с повреждениями сердечно-сосудистой системы и, в меньшей степени, с деформацией скелета у эмбрионов медаки. Это согласуется с мнением Yan et al. (2013), которые предположили, что ogg1 играет роль в формировании кардиомиоцитов.

Пестициды широко используются в сельском хозяйстве, однако их применение связано с окислительным стрессом у нецелевых организмов (Yang et al., 2020). Так, было показано, что фенвалерат, пиретроидный инсектицид, вызывающий окислительное повреждение ДНК, снижает экспрессию гена ogg1 в эмбрионах рыбок данио ст. 24-96 hpf (Gu et al., 2010). Аналогичным образом Shi et al. (2011) обнаружили, что при воздействии циперметрина (инсектицида, используемого в сельском хозяйстве и вызывающего окислительные повреждения ДНК) на эмбрионы рыбок данио до 96 hpf экспрессия ogg1 снижается, а экспрессия tp53 повышается. Снижение экспрессии ogg1 в обоих исследованиях было связано с пороками развития скелета и усилением апоптоза в области мозга, что сходно с фенотипом нокдауна ogg1, наблюдавшимся в работе Gu et al. (2013) (табл. 2). В целом эти исследования показали, что при воздействии на эмбрионы рыб ксенобиотиков, изменяющих экспрессию генов в BER-пути, эти воздействия ассоциируются с пороками развития скелета, нейротоксичностью и повреждениями сердечно-сосудистой системы.

В ряде работ сообщалось об изменении экспрессии генов DDR в ответ на воздействие тяжелых металлов и ксенобиотиков. В работе Ling et al. (2017) при воздействии Cd2+ и параквата в течение 9 ч на эмбрионы рыбок данио на ст. 1 hpf обнаружено снижение регуляции гена xpc и повышение генов UV-ddb2 и ogg1. Авторы предположили, что наблюдаемое повышение экспрессии гена NER, ddb2, связано с окислительным стрессом. Индуцированный кадмием окислительный стресс также приводил к снижению экспрессии генов MMR, msh2 и msh6, у эмбрионов рыбок данио 1 hpf при воздействии сублетальных концентраций (3-5 мкМ) Cd2+ (Hsu et al., 2013). Ингибирование активности связывания белка Msh6 было зафиксировано после воздействия Cd2+ на эмбрионы рыбок данио 1 hpf (Ho et al., 2015). Воздействие Cd2+ во время развития эмбрионов рыбок данио не было связано со значительной смертностью или тератогенностью на личиночной стадии, но приводило к изменениям в поведении по сравнению с контролем (Shankar et al., 2021). Кроме того, Monaco et al. (2017) сообщили о повышении частоты апоптотических событий в головном мозге эмбрионов после 24 ч обработки Cd2+ (Monaco et al., 2017). Это согласуется с локализацией экспрессии ogg1, ddb1 и msh2 (табл. 1). Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы показать возможные долгосрочные последствия кадмий-индуцированной нейродегенерации у рыб.

Было показано, что Hg2+ вызывает разрывы нитей ДНК в результате окислительного стресса и препятствует работе механизмов репарации ДНК (Rooney, 2007; Barcelos et al., 2011). Hg2+ оказывал различное влияние на синтез белка Msh6 и экспрессию мРНК msh2, msh6 (Ho et al., 2015). Ингибирование синтеза белка Msh6 не приводило к снижению экспрессии мРНК msh6. Было высказано предположение, что Hg2+ может быть направлен не на транскрипцию, а на функцию белка репарации ДНК. Затем Chang et al. (2017) продемонстрировали, что Hg2+ ингибирует NER-ассоциированную активность по вырезанию повреждений у эмбрионов рыбок данио. Интересно, что воздействие Hg2+ не подавляло экспрессию генов факторов NER, но влияло на активность эндонуклеаз, например Xpg.

17α-этинилэстрадиол (EE2) - полусинтетический гормон, используемый в оральных контрацептивах и, как известно, способствующий мутациям (Notch et al., 2007; Notch and Mayer, 2013). Совместное воздействие 17α-этинилэстрадиола (EE2) и его метаболита, эстрона (E1), вызывало усиление транскрипции генов NER, а именно xpa, на 48 hpf и 72 hpf эмбрионов рыбок данио (Notch and Mayer, 2013). Однако способность EE2 вызывать повреждение ДНК не описана.

Бензо [a]пирен (BaP) - канцероген и модельный PAH, образующийся при неполном сгорании органических материалов (Soltani et al., 2019). У эмбрионов осетровых (Acipenser ruthenus), подвергшихся воздействию BaP с двухклеточной стадии до 8 dpf, наблюдались DSBs и повышенная экспрессия xpc (Gazo et al., 2021). Изменения экспрессии xpc были связаны с более высокой смертностью по сравнению с контролем. В отличие от рыбок данио (Srut et al., 2015), эмбрионы стерляди эффективно восстанавливали повреждения ДНК и не имели пороков развития к ст. 8 hpf (Gazo et al., 2021). Этот вывод может указывать на видовую специфичность механизмов DDR.

Камптотецин (CPT) - ингибитор ДНК-топоизомеразы I, широко используемый в качестве противоопухолевого препарата. По данным Gazo et al. (2022), CPT оказывает влияние на транскриптомный профиль эмбрионов осетровых. Обработка CPT увеличивала экспрессию генов xpc, rad50, xpa, xrcc1, msh2, rpa1, ercc5, pold3, ercc2, fen1, blm, rad51ap1, nbn и eme1. Повышенная регуляция этих генов была связана с увеличением частоты пороков развития и снижением жизнеспособности эмбрионов. У эмбрионов, подвергшихся воздействию СРТ в период нейруляции, экспрессия генов, участвующих в репарации ДНК, напротив, была незначительно повышена. Поскольку показатели жизнеспособности и вылупления в этой группе были сопоставимы с контрольной группой, полученные результаты свидетельствуют о зависимости чувствительности эмбрионов осетровых к воздействию СРТ от стадии развития.

Fenthion - фосфорорганический пестицид, вызывающий окислительный стресс и повреждение ДНК, что приводит к снижению экспрессии генов HR rad51 и rad18 у эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию в течение 24 ч (Wahyuni et al., 2021). Кроме того, воздействие в течение 48 ч подавляло экспрессию генов rad51, rad18, xrcc2 и NHEJ (xrcc6/Ku70). Кроме того, воздействие terbufos (другого фосфорорганического пестицида) в течение 48 ч подавляло экспрессию rad51, rad18, xrcc2, xrcc6/Ku70 (Wahyuni et al., 2021). В том же исследовании комбинированное воздействие фентиона и тербуфоса в течение 48 ч усиливало экспрессию rad51 и xrcc2. Авторы предположили, что воздействие одного пестицида нарушает пути репарации DSB, тогда как совместное воздействие тербуфоса и фентиона проявляет меньшую генотоксичность. В будущих исследованиях следует выяснить, могут ли вызванные ксенобиотиками изменения в экспрессии генов HR на стадии эмбриона привести к нарушению мейоза, фертильности или половой дифференциации на более поздних стадиях развития.

До настоящего времени в многочисленных исследованиях повреждение ДНК рассматривалось как конечная точка токсичности ксенобиотиков (обзор Kienzler et al., 2013; Canedo and Rocha, 2021). Однако некоторые токсиканты могут снижать экспрессию ключевых генов, участвующих в DDR, в результате чего клетка становится беззащитной перед повреждением ДНК (Notch and Mayer, 2013). Это обусловливает необходимость дальнейших исследований уязвимости путей репарации ДНК к стрессу. В данном обзоре мы рассмотрели различные роли генов и белков репарации ДНК в эмбриогенезе рыб. Мы также обобщили результаты исследований, в которых изменения в генах репарации ДНК были связаны с пороками развития. Однако лишь немногие исследования посвящены изучению взаимосвязи между типом повреждения ДНК, изменениями экспрессии генов репарации ДНК и фенотипом эмбриона (Gu et al., 2010; Shi et al., 2011; Lu et al., 2017). Таким образом, необходимы дополнительные исследования для понимания взаимосвязи между DDR и формированием фенотипа, в частности того, как изменения уровня экспрессии, пост-трансляционных модификаций белков и их транслокации в условиях генотоксического стресса могут влиять на развитие эмбриона.

Быстро развивающиеся эмбрионы рыб, оплодотворяемых извне, подвергаются воздействию окружающей среды или инкубационных условий, где они сталкиваются с многочисленными факторами, повреждающими ДНК. Ингибирование апоптоза и контрольных точек на ранних стадиях развития эмбриона свидетельствует о его чувствительности к генотоксическому повреждению. Клетки, пролиферирующие с поврежденной ДНК, могут приобретать мутации, замедляющие рост отдельной рыбы и, в конечном счете, всей популяции. Таким образом, эффективный механизм репарации ДНК является критически важным для предотвращения толерантности к повреждениям.

Летальность может быть обусловлена дефектами в экспрессии генов репарации ДНК. Белки, участвующие в DDR, также уязвимы к повреждениям. В связи с этим крайне важно определить сложные пути, по которым белки DDR участвуют в органогенезе. В целом имеющиеся литературные данные свидетельствуют о том, что изменения в экспрессии генов BER-пути могут влиять на развитие сердечно-сосудистой системы, ЦНС, мозга и приводить к изменениям в поведении (Wang et al., 2006; Gu et al., 2010; Gu et al., 2013; Yu et al., 2013; Barjhoux et al., 2014; Pei et al., 2019; Lu et al., 2021). Аналогичным образом, Cd2+-индуцированный стресс приводил к изменениям в NER-пути и к подавлению генов MMR, что может быть связано с наблюдаемой нейродегенерацией (Hsu et al., 2013; Ling et al., 2017; Monaco et al., 2017; Shankar et al., 2021). Однако для понимания изменений в экспрессии, структурной модификации, транслокации и ингибировании, которым подвергаются белки-репараторы в ответ на воздействие генотоксикантов, необходимы дополнительные исследования. Эти будущие исследования необходимы для понимания связи между воздействием генотоксикантов и формированием фенотипа.

Кроме того, эффективность механизмов репарации ДНК, по-видимому, зависит от стадии развития. В связи с этим необходимо описать пути DDR, задействованные на различных стадиях развития эмбрионов рыб, чтобы определить, какие стадии наиболее уязвимы к стрессу и требуют немедленного внимания. Кроме рыбок данио, наблюдается поразительная нехватка исследований по DDR у других видов рыб, однако чувствительность к повреждениям и DDR могут быть видоспецифичными. В связи с этим мы считаем, что необходимы дополнительные исследования по изучению DDR у немодельных видов, важных для аквакультуры, а также исследования, направленные на понимание уровня толерантности к повреждениям ДНК и их репарации у немодельных видов рыб на эмбриональной стадии. Это может привести к открытию новых генов и белков DDR, особенно на эмбриональном этапе.