Кстати, почти каждый белок, идентифицированный как партнер по связыванию внеклеточного компонента Dag1 содержит, по крайней мере, один laminin G (LG) домен. Эти взаимодействующие белки включают laminins,^{1, 25} Agrin,^28-30 Perlecan,³¹ Neurexins,³² Pikachurin,³³ Slit2,³⁴ и Celsr3/Adgrc3.³⁵ Biglycan является исключением из правил, т.к. связывается с α-Dag1 независимо от гликозилирования Dag1.³⁶ Matriglycan повторы на гликозилированном α-Dag1 составляет сайт связывания LG-домена. Минимальная длина matriglycan, по-видимому, равняется примерно четырем повторам, при этом самая длинная цепь обнаруживает повышенное связывание.¹⁵ С увеличением matriglycan повторов, Dag1 способен связывать многие белки одновременно.¹⁴ Считается, что множественные повторы matriglycan увеличивают сродство к LG доменам за счет разрешения быстрых повторных связываний после диссоциации.³⁷ Принимая во внимание, что степень гликозилирования варьирует от ткани к ткани, это может быть результатом варьирующей способности к связыванию у Dag1 в разных контекстах.

Не все LG домены способны к связыванию Dag1. Связывание с Dag1 зависит от Ca²⁺ и часто нуждается в координации тандемных доменов LG.¹³ До сих пор единственный известный белок был способен связывать Dag1 с одиночным доменом LG это Slit2.³⁴ LG4-5 домены ламинина α2 представляют собой канонический Dag1-связывающий сайт и поэтому все 5 изоформ laminin alpha-цепи, каждый содержит множественные LG домены, не все alpha-цепи изоформы связывают Dag1 (rev. in Dempsey et al., 201938). Интересно, что α4 и α5 цепочки связывают Dag1, поскольку они по прогнозу не содержат консервативный Ca²⁺-связывающий карман, необходимый для взаимодействия с Dag1.³⁹ Ca²⁺ связывание не является необходимым для собственно укладки в β-сэндвич, что и создает LG домены, но присутствие катиона, скорее всего, стабилизирует структуру.⁴⁰ Вполне возможно, что др. двухвалентный катион, такой как Mg²⁺, также может достаточно стабилизировать структуру, чтобы обеспечить взаимодействия LG-домена с matriglycan.

Вскоре после идентификации Dag1 в качестве компонента DGC, было показано, что внутриклеточный домен β-Dag1 взаимодействует с dystrophin непосредственно.^{41, 42} С момента инициального открытия, идентифицированы и др. внутриклеточные взаимодействующие с Dag1 белки. Адапторный белок Grb2 является одним из таких белков, которые взаимодействуют с β-Dag1 как в мышцах, так головном мозге и, скорее всего, действуют, чтобы купировать Dag1 с различными сигнальными каскадами. Напр., и Grb2 и focal adhesion kinase p125FAK (FAK) были изолированы из synaptosomal экстрактов с помощью хроматографии на иммобилизованном рекомбинантном β-Dag1. FAK, как известно, является перекрестком для многих сигнальных путей, включая путь Ras/MAPK.^{43, 44} Juxtamembrane регион β-Dag1 соединяется с ERM-доменовым белком Ezrin, чтобы регулировать активацию Cdc42 и образование филоподий.^{45, 46} Недавнее исследование с использованием беспристрастных протеомых скринов в нервной системе взрослых Drosophila идентифицировало взаимодействие между Dg (гомолог у Drosophila DAG1) и комплексом exocyst, которое необходимо для транспорта Dg в плазматическую мембрану.⁴⁷

По всему телу, гликозилированный Dag1 служит для соединения клеток с внеклеточным матриксом, и в особенности, с базальными мембранами. Прекрасными примерами этого могут служить сарколемма мышечных волокон и нейроэпителиальные клетки в ЦНС. Соответственно, мутации, которые затрагивают функцию Dag1 приводят к возникновению форм прогрессирующей врожденной мышечной дистрофии, обозначаемой как dystroglycanopathy. Первичная дистрогликанопатия возникает в результате мутаций в самом Dag1, хотя примеры этого очень редки.⁴⁸ Скорее, большинство мутаций, приводящих к dystroglycanopathy находятся в 1 из 19 генов, необходимых для функционального гликозилирования Dag1 (Table 1). Их относят ко вторичным dystroglycanopathy, если мутации затрагивают энзимы, которые участвуют непосредственно в пути синтеза гликанов, или трагичными dystroglycanopathy, если мутантные гены необходимы для молекул предшественников, необходимы для удлинения цепочек гликанов.⁴⁹ Dystroglycanopathy обычно диагностируются на азе гипогликозилирования Dag1с помощью western blotting или иммуногистохимии мышечных биоптатов.

TABLE 1. Genes involved in dystroglycan glycosylation

Клинические проявления dystroglycanopathy могут иметь широкий спектр тяжести, от легкой формы, возникающей у взрослых в виде мышечной дистрофии тазового пояса до тяжелых форм, которые сопровождаются широко распространенными нейрологическими аномалиями, которые могут заканчиваться гибелью в ранней жизни. Помимо выраженных мышечных и нейрологических симптомов, часто обнаруживается дисфункция сердца у пациентов с dystroglycanopathy. Гетерогенный диапазон симптомов не обязательно отражает специфические мутантные гены пути гликозилирования, но скорее природу мутации, как она затрагивает ферментативную активность возникающих в результате генных продуктов и и зависит от уровня Dag1 гипогликозилирования. Вовлечение нейрологии при тяжелых формах dystroglycanopathy может включать уродства головного мозга, которые проявляются в виде II lissencephaly или focal pachygyria/polymicrogyria, midbrain/pontine/cerebellar hypoplasia, hydrocephalus, white matter abnormalities и retinal dysplasia.^{50, 51} Большинство пациентов с аномальным МРТ имеют от умеренной до тяжелой степени умственную отсталость,^{52, 53} , а эпилепсия встречается приблизительно у 30% пациентов с обнаружимыми пороками развития головного мозга.⁵⁴ Умственная отсталость также часто наблюдается у пациентов с dystroglycanopathy при нормальном МРТ, подчеркивая в принципе важную роль Dag1 помимо регуляции раннего структурного развития головного мозга.⁵⁵

Dystroglycan высоко консервативен у метазоа, начиная с Porifera (губки). Наиболее сильно законсервированные регионы связывающего сайта расположены между alpha и beta субъединицами, C-терминальная часть alpha субъединицы, цитоплазматический домен и C-терминальный конец beta субъединицы. Внутриклеточный партнер по связыванию dystrophin сходным образом законсервирован у метазоа.⁵⁶ Многие из glycosyltransferases, ответственные за удлинение цепочек гликанов на α-Dag1, законсервированы ещё сильнее, чем сам DAG1. Эти ферменты присутствуют уже у choanoflagellat, одноклеточных предшественников эукариот, которые еще не экспрессируют DAG1.⁵⁷ Т.о., очень возможно, что Dag1 использует уже существующие энзимы для своих собственных нужд. Нематоды C. elegans представляет собой исключительный случай, демонстрирующий, что ни одна из Dag1-ассоциированых glycosyltransferases не присутствует в геноме C. elegans. В соответствии с этим гомолог DAG1 у C. elegans лишен mucin-подобного домена, в результате O-mannosyl цепочки присоединены к др. видам ^56-58 и не подвергаются O-гликозилированию, а вместо этого испытывают N-гликозилирование.

Высокая степень консервации генов среди метазоа позволила исследователям получить преимущества от широкого разнообразия модельных систем и генетических инструментов, доступных каждой системе. Существуют инструменты в виде conditional делеций и точечных мутаций у нематод, Drosophila, рыбок данио и мышей. Нематоды не экспрессируют DAG1 в мышцах, но остаются пригодными для изучения функции Dag1 в нервной системе. Хотя рыбки данио экспрессируют Dag1 и в мышцах и нервной системе, в опубликованной литературе модельные рыбки данио преимущественно используются для изучения мышечных фенотипов.^{59, 60}

У млекопитающих, DAG1 экспрессируется многими типами клеток по всему телу, но чаще всего исследования касаются мускулатуры или нервной системы. В головном мозге, DAG1 экспрессируется в гиппокампе, мозжечке, коре головного мозга, базальных ганглиях, таламусе, гипоталамусе, обонятельных луковицах, сетчатке и стволе мозга.^{23, 25, 61, 62} В этих регионах DAG1 экспрессируется нейроэпителиальными клетками, нейронами, глией и кровеносными сосудами. Из-за конституитивной потери функции Dag1 возникает ранняя эмбриональная летальность и возникает экспрессия в широком диапазоне тканей и типов клеток, поэтому целенаправленные генетические манипуляции оказываются неоценимыми для понимания функции в ходе развития и у взрослых. Во время раннего развития нервной системы Dag1 играет критическую роль в клеточной миграции, морфологии дендритов и в наведении на цель аксонов. Последующая экспрессия Dag1 в нейронах во время периода синаптогенеза, который является непрерывным у взрослых, индуцировали последующие исследования, которые показали, что Dag1 обладает важным структурным и функциональным значением как нейро-мышечных соединений (NMJ) , так и для центральных синапсов.

Type II lissencephaly является врожденной мышечной дистрофией, включая dystroglycanopathy и характеризуется эктопической миграцией нейрональных клеток в subarachnoid пространство. Мышиные модели dystroglycanopathy в точности воспроизводят фенотипические отклонения, наблюдаемые у пациентов. DAG1 экспрессируется нейроэпителиальными клетками, важными для собственно миграции клеток, включая радиальную глию в коре и гиппокампе и Bergmann глию в мозжечке.^{25, 63, 64} Белок Dag1 обогащен в синаптических нервных окончаниях радиальной глии, примыкающих к базальной мембране на поверхности коры головного мозга. Специфическая для головного мозга делеция DAG1 приводит к разрушению базальной ламины с четкими разрывами в местах расположения laminin на поверхности коры, что приводит к эктопической миграции.^{27, 64-68}

В неокортексе нарушения целостности нейроэпителиального каркаса у моделей dystroglycanopathy приводит к слиянию полушарий, т.е. фенотипу типа II lissencephaly, при котором кортикальные слои неспособны устанавливать соотв. расположение.^{27, 64, 68-70} Гранулярные клетки dentate gyrus гиппокампа обнаруживают сходные фенотипические отклонения миграции, с эктопией гранулярных клеток в нижнем листке (blade).⁶⁷ Во время развития мозжечка гранулярные клетки неспособны соот. образом мигрировать внутрь вдоль Bergmann глии, приводя в результате к эктопической гетеротопии гранулярных клеток.^{27, 65} В то время как нейроны Purkinje развиваются в основном нормально, иногда они случайно прорастают в молекулярный слой. Слияние долек мозжечка и слияние между средним мозгом и соседними дольками также встречаются с региональными отличиями в тяжести между дольками мозжечка.⁶⁶ В сетчатке внутренние ретинальные нейроны дезорганизованы, при этом эктопические клетки мигрируют через все бреши во внутреннюю ограничивающую мембрану.^{68, 71}

Большинство работ, проделанных, чтобы выяснить роль Dag1 в различных популяциях клеток, использовали conditional DAG1 делеции у мышей. Обусловленные определенными воздействиями делеции сегодня широко доступны с помощью системы Cre-lox (Box 1). Разные линии Cre драйверов были использованы для удаления DAG1 из нейроэпителиальных клеток и возникающих из них потомков, или во всем головном мозге (NestinCre, hGFAPCre) или избирательно дорсальной части переднего мозга (Emx1Cre). Это приводило к фенотипическим отклонениям кортикальной миграции, что напоминало типа II lissencephaly.^{27, 64-66, 70, 74} Напротив, если делеция DAG1 ограничена вновь рожденными пирамидальными нейронами с использованием NEXCre, то кортикальная миграция оказывалась нормальной.^{27, 75, 76} Это демонстрирует, что фенотипические отклонения миграции нейронов у мутантов DAG1 не является клеточно-автономными, при этом нейроэпителиальные клетки играют главную роль в качестве каркасов для поддержки собственно миграции нейронов. Сходным образом, в мозжечке NestinCre и hGFAPCre conditional мутации обнаруживают фенотипы описанной выше миграции гранулярных клеток, когда L7Cre (Purkinje нейроны) и mAlpha6Cre (гранулярные клетки) с conditional нокаутами обнаруживают формирование нормальных нейронов Purkinje и гранулярных клеток.⁶⁶ Для сравнения эффектов делеций DAG1 с помощью разных Cre линий, см. Table 2.

Box 1. Conditional genetics: The Cre-lox system In the Cre-lox system, a driver line is engineered to express the bacterial Cre recombinase sequence under the control of a specific promoter or gene regulatory sequence. Cre recombinase binds a 34-base-pair loxP recognition sequence. When two loxP sites in the same orientation are bound, the intervening sequences are excised from the genome, leaving a single loxP site "scar."72 In the case of dystroglycan, DAG1 conditional knockout mice were designed to have loxP sites flanking exon 2, which contains most of the coding sequence for the gene.73 When DAG1 conditional knockout mice are crossed to a Cre driver line, DAG1 is excised from Cre-positive cells, but its expression is retained in Cre-negative cells. This allows researchers to avoid the embryonic lethality associated with the global deletion of DAG1. Given the ubiquitous expression of DAG1, the Cre-lox system allows for careful dissection of Dag1's role in a specific cell population.

TABLE 2. Neurodevelopmental phenotypes in various Dystroglycan conditional knockouts

Генетический анализ показал, что Dag1 нуждается в собственно гликозилировании, руководить миграцией нейронов во всех описанных регионах головного мозга, тогда как передача внутриклеточных сигналов, по-видимому, безразлична. Мутации и в любом из генов, участвующих в гликозилировании α-Dag1 приводят к гипогликозилированию в разной степени. Подобно самому DAG1, полный нокаут этих генов приводит к ранней эмбриональной гибели, однако все же многие точечные мутации, химеры и conditional нокаутные линии мышей были сгенерированы для изучения роли гликозилирования Dag1 в скелетно-мышечной и ЦНС. Эти линии мышей имели тенденцию к фенотипическим отклонениям миграции в коре, мозжечке и гиппокампе, как при специфических нейроэпителиальных делециях DAG1. Однако, тяжесть фенотипа, по-видимому, варьирует в зависимости от специфичности мутации и коррелирует со степенью сохраненного функционального гликозилирования. (детали мутаций гликозилирования и дефекты от них в ЦНС см. Nickolls and Bönnemann, 2018.77) Напротив, мыши, экспрессирующие укороченный Dag1, лишены внутриклеточного домена, но имею нормальное гликозилирование alpha-субъединицы (Dag1^Δcyto), обнаруживающей нормальную клеточную миграцию по всей ЦНС.^{27, 35, 74, 78}

Способность Dag1 служить в качестве связи между внеклеточным матриксом и актиновым цитоскелетом уравновешивает влияние клеточной морфологии. Исследования in vitro с использованием shRNA-опосредованного нокдауна DAG1 в первичных культурах гиппокампа показали уменьшение сложности дендритов, тогда как избыточная экспрессия DAG1 вызывала увеличение сложности дендритов. В том же исследовании сообщалось, что matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) деградирует Dag1 в ответ на усиление синаптической активности in vitro, приводя в результате к снижению сложности дендритов в той же степени как и при нокдауне DAG1.⁷⁹ Сходным образом, эксперименты in vitro показали, что нокдаун DAG1 приводит к изменениям морфологии дендритных шипов и плотности и ретракции отростков астроцитов. Несмотря на наблюдаемое структурное ремоделирование, возбуждающая и ингибирующая синаптическая передача y остается неизменной.⁸⁰

Широко распространенные conditional делеции DAG1 по всей ЦНС с использованием NestinCre приводт к очевидным изменениям в морфологии кортикальных пирамидальных клеток. Однако, эти дефекты морфологии нейронов, скорее всего, вторичные по отношению к клеточной миграции, обусловлены потерей DAG1 в нейроэпителиальных клетках при Nestin^Cre conditional нокаутах, поскольку морфология нейронов нормальная, когда DAG1 избирательно делетируется из клеток пирамидальных нейронов с использованием NEX^Cre.^74,76 Сходным образом, делеция DAG1 из ретинальных нейроэпителиальных клеток с использованием Six3Cre приводит к аномальном расслоению (lamination) и стратификации дендритов внутренних ретинальных нейронов, в то время как делеция DAG1 избирательно из клеток постмитотических ретинальных ганглиев с использованием Isl1Cre не влияет на расслоение клеток или стратификацию.⁷¹ Итак, эти результаты подтверждают, что in vivo, Dag1 влияет на морфологию клеток клеточно неавтономным образом.

Продвинутый генетический скрининг разработан для идентификации новых генов, участвующих в развитии периферической нервной системы, выявил неожиданную роль Dag1 в наыведении аксонов.³⁴ Мыши с точечными мутациями в CRPPA (CRPPAL79*) и B4GAT1 (B4GAT1M155T) были первоначально идентифицированы, базируясь на дефектах развития нисходящих продольных трактов аксонов в заднем мозге. Как CRPPAL79*B4GAT1M155T мутанты обнаруживают гипогликозилирование Dag1. Чтобы подтвердить, что данные фенотпические отклонения наведения аксонов обусловлены дефектами функции Dag1, были получены Sox2^Cre;Dag1^cKOs (epiblast deletion) и было показано, что возникают идентичные фенотипы. Помимо отклонений в инициальном наведении аксонов, некоторые др. продольные тракты аксонов в спинном мозге также оказались аномальными у всех трех мутантов. Дорсальные пучки спинного мозга, представляющие центрально проецирующиеся аксоны от сенсорных нейронов в ганглии дорсальных корешков, являются неоднородными и имеют прерывистый вид. CRPPA^L79*, B4GAT1^M155T и Sox2^Cre;Dag1^cKOs также обнаруживали дефекты донной пластинки (floor plate) пересекаемой с помощью комиссуральных аксонов спинного мозга. У мышей дикого типа комиссуральные нейроны в дорсальной части спинного мозга проецируют свои аксоны к вентральной срединной линии, проходят через донную пластинку, и поворачиваются рострально после выхода из донной пластинки. Напротив, CRPPA^L79*, B4GAT1^M155T, and Sox2^Cre;Dag1^cKO мутанты обнаруживают остановку аксонов внутри донной пластинки и случайным образом разворачиваются после выхода из донной пластинки (Figure 3A).³⁴ Последующие работы показали, что эти дефекты не являются клеточно автономными, т.к. комиссуральные аксоны обнаруживают нормальное пересечение донной пластинки и поворот вперед, когда DAG1 удален из комиссуральных нейронов (Wnt1^Cre) и у Dag1^Δcyto мутантов, лишенных внутриклеточного домена.³⁵


FIGURE 3

Axon guidance phenotypes in Dystroglycan mutants. (A) Spinal commissural axons of Dystroglycan conditional knockouts exhibit both stalling at the floor plate and post-crossing randomized turning. This phenotype is a combination of the stalling phenotype observed in Slit KOs and the randomized turning phenotype observed in Celsr3 KOs. (B) The internal capsule contains descending corticothalamic axons (CTAs) and ascending thalamocortical axons (TCAs). "Corridor" cells are depicted in orange. Shaded blue regions depict areas of Cre recombination in various Dystroglycan conditional knockouts. Epiblast Dystroglycan conditional knockouts (Sox2^Cre) develop abnormal CTA and TCA trajectories. Neuroepithelial dystroglycan is required for CTA/TCA targeting (Foxg1^Cre). Dystroglycan is not required in CTA axons (Emx1^Cre), TCA axons (Gbx2^CreERT2 + E10 tamoxifen), or corridor cells (Dlx5/6Cre). PSPB = pallial-subpallial boundary; DTB = diencephalon-telencephalon boundary. (Figure adapted from Lindenmaier et al. 2019.35) (C) Under wild-type conditions, most retinal ganglion cell (RGC) axons primarily project from the retina to contralateral retinorecipient brain regions, crossing at the optic chiasm. A small proportion of RGC axons project ipsilaterally. In Six3^Cre;Dag1^cKOs (retinal neuroepithelial cells), RGCs project equally to the contra- and ipsilateral brain, as well as to the contralateral eye

Механистически, Dag1 локализуется в нейроэпителиальных клетках донной пластинки и клеточно не автономно и регулирует наведение комиссуральных аксонов множественными способами. У мышей дикого типа комиссуральные аксоны пересекают донную пластинку, находясь в тесном контакте с базальной lamina в вентральной части спинного мозга. Когда они проходят через донную пластинку, то комиссуральные аксоны сталкиваются с секретируемыми отталкивающими Slit белками, передают сигналы через рецепторы Robo, чтобы изгонять их донной пластинки и препятствовать их пересечению спинного мозга.^{81, 82} После выхода из донной пасттинки Celsr3/Adgrc3 , обеспечивая поворот кпереди в ответ на градиент Wnt.^{83, 84} В отсутствие функционального Dag1, белки внеклеточного матрикса (ECM) , а базальная ламина фрагментирована, аксоны удаляются из их ростового субстрата.³⁴ Кроме того, Dag1 непосредственно связывается со Slit2, чтобы ограничить расположение донной пластинкой.³⁴ Наконец, Dag1 в клетках нейроэпителия также формирует транс взаимодействия с Celsr3/Adgrc3, чтобы обеспечить после пересечения поворот кпереди.^{34, 35}

С момента открытия роли Dag1 в наведении аксонов в спинном мозге, дополнительные исследования идентифицировали важность Dag1 для наведения аксонов во внутренней капсуле, латеральном обонятельном тракте, передней комиссуре и перекресте оптического нерва, подтверждая консервативную роль Dag1 в наведении аксонов во многих системах.^{35, 74-76, 85} Внутренняя капсула представляет собой нисходящие corticothalamic axons (CTAs) и восходящие thalamocortical аксоны (TCAs). Третья популяция "corridor cells" действует как промежуточная мишень, облегчающая наведение CTAs и TCAs, т.к. они проходят через вентральную часть переднего мозга. Делеция в эпибласте DAG1 с использованием Sox2^Cre приводит к направлению на неправильные мишени CTAs и TCAs. Нисходящие CTAs в основном оказываются неспособными пересекать pallial-subpallial border (PSPB), и они формируют крупные эктопические пучки в вентральной части переднего мозга. Большинство TCAs формирует неправильные повороты на diencephalon-telencephalon border (DTB) скорее, чем проецируются дорсовентрально через коридор, они проецируются вентрально в зрительный тракт. Немногие TCAs, которые успешно проецируются в кору, посылают преждевременные микропроекции в верхние слои коры, скорее, чем останавливаются в промежуточной зоне. Благодаря повсеместной экспрессии DAG1 по всему головному мозгу, батарея линий драйверов Cre была использована для генетического выявления, где Dag1 функционирует, чтобы скоординировать корректную сборку внутренней капсулы. Формирование внутренней капсулы происходило нормально, когда DAG1 был удален из кортикальных нейронов (Emx1^Cre),таламических нейронов (Gbx2^CreERT2 ^+ΔE10.5 tamoxifen administration), и клеток коридора (Dlx5/6^Cre), демонстрируя, что его функции не являются клеточно автономными. Вместо этого, нейроэпителиальный Dag1 в вентральной части telencephalon (Foxg1^Cre) обеспечивает внутреннюю капсулу наведением аксонов, возможно путем регуляции формирования проходимого коридора (Figure 3B).³⁵

В развивающейся зрительной системе аксоны от клеток ретинальных ганглиев (RGCs) первоначально растут вдоль внутренней лимитирующей мембраны в направлении головки зрительного, где они выходят из сетчатки. Затем они перемещаются через перекрест зрительного нерва в вентральную часть переднего мозга прежде чем достичь 1 из 30 воспринимающих областей сетчатки. У мышей ~90% аксонов RGC пересекают зрительный перекрест и проецируются в контралатеральные регионы головного мозга, тогда как 10 % проецируются на ту сторону (ipsilaterally).⁸⁶ Делеция DAG1 из ретинальных нейроэпителиальных клеток и вентральной части переднего мозга с использованием Six3Cre нарушает формирование внутренней лимитирующей мембраны, вызывая дезорганизацию наведения аксонов внутри сетчатки из-за потери ростового субстрата.⁷¹ RGC аксоны у Six3^Cre;Dag1^cKOs также неспособны перемещаться соотв. образом через зрительный перекрест. Многие аксоны останавливаются внутри перекреста, а те что выходят из него проецируются равными долями в ontralateral и ipsilateral зрительных трактах, вызывая аномалии билатеральной иннервации retinorecipient регионов головного мозга. Помимо этого обнаруживаются аберрантные проекции в contralateral глаза (Figure 3C). Как дезорганизация внутриретинальных аксонов, так и ошибки в сортировке аксонов в зрительном перекресте (chiasm) зависят от соотв. гликозилирования Dag1 , т.к. фенокопии CRPPAL79* точечных мутаций DAG1 приводят к conditional нокаутам.⁸⁵

Помимо регуляции дально-действующего наведения аксонов, события соединяющего несопоставимые регионы нервной системы, Dag1 может также регулировать целенаправленное попадание аксонов в локальные circuits. В гиппокампе, DAG1 экспрессируется пирамидальными нейронами в CA1-CA3 и необходим для perisomatic иннервации этих нейронов с помощью пресинаптических CCK+ basket промежуточных нейронов. Постсинаптическая делеция DAG1 из пирамидальных клеток (NEX^Cre) приводит к тотальной потере аксонов CCK+ basket промежуточных нейронов, как было установлено с помощью иммуноокрашивания маркерами для спцифической популяции (VGluT3, CB1R), в то время как PV+ популяция basket промежуточных нейронов остается неизменной.^{75, 76} Интересно, что разные фенотипические отклонения, наблюдаемые, когда DAG1 делетирован из нейронов и глии (Emx1^Cre, Nestin^Cre). У таких мышей, аксоны CCK+ basket промежуточных нейронов присутствуют, хотя и с аномальным попаданием: аксоны больше не находят perisomatic компартмент пирамидальных нейронов и вместо этого проецируются диффузно по всем трем слоям CA1-CA3.⁷⁴ Это различие в дефектах таргетинга аксонов в случае постсинаптической делеции DAG1 из пирамидальных нейронов и в случае делеции из нейронов и глии указывает на то, что нахождение цели аксонами может использовать нервно-глиальные взаимодействия.

Целенаправленное наведение аксонов CCK+ basket промежуточных нейронов зависит от соотв. гликозилирования Dag1. Потеря гликозилирования Dag1 за счет conditional делеции гликозилтрансеразы POMT2 приводит к той же самому фенотипическому отклонению аксонов CCK+ basket промежуточных нейронов, что и в случае DAG1 conditional делеции. Умеренное состояние гликозилирования приводит к фенотипическим отклонениям разной тяжести, в соответствии со степенью редукции гликозилирования.⁷⁴ Внутриклеточный домен Dag1, по-видимому, в основном безразличен к нахождению цели аксонами CCK+ basket промежуточных нейронов, т.к. Dag1^Δcyto мутации во внутриклеточном домене обнаруживают относительно нормальную иннервацию.⁷⁴ Интересно, что mdx мыши, которые лишены специфической для мозга изоформы dystrophin, обнаруживают аномалии попадания в цель аксонов CCK+ basket, подобно Emx1^Cre;Dag1^cKOs.⁸⁷ Остается необъяснимым как внутриклеточный домен Dag1 оказывается несущественным дл этого процесса, но dystrophin, взаимодействующий внутри клетки партнер для Dag1, оказывается необходимым. Можо полагать, что mdx мышей, Dag1 располагается неправильно на субклеточной шкале, приводя к пертурбациям наведения аксонов CCK+ промежуточных нейронов. Это нуждается в Dag1, чтобы достичь нормальной субклеточной локализации независимо от его взаимодействия с dystrophin у мутантов Dag1^Δcyto.

Фенотипические отклонения в наведении аксонов были также идентифицированы у мутантов DAG1 у Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster, указывая тем самым, что это закрепленный эволюционно механизм.^{47, 88} У C. elegans, гомолог DAG1 (DGN-1) и Celsr3/Adgrc3 (FMI-1) , оба необходимы для сопровождения аксонов вдоль pioneer аксонов.^{88, 89} У D. melanogaster,гомологи DAG1 (Dg), Slit/Robo и Celsr3/Adgrc3 (Flamingo) все необходимы для правильного нахождения цели фоторецепторными аксонами в зрительной доле.^90-94

Впервые роль Dag1 в организации синапсов была описана в 1990s, когда было установлено, что Dag1 участвует в формировании кластеров ацетилхолиновых рецепторов (AChRs) в нейро-мышечных соединениях (NMJ) во многих модельных системах, включая мышей, кур, электрических скатов, Xenopus и Drosophila. Dag1 , как было установлено, ко-локализуетсяd с AChRs в NMJ.^{19, 28, 95} Высвобождение Agrin из пресинаптических моторных нейронов вызывает накопление постсинаптических AChRs в агрегатах.⁹⁶ Вскоре было установлено, что воздействие Agrin на мышечные трубки конкурирует с α-Dag1-специфическими антителами, предназначенными для соединения с Dag1.^{28, 29} Использование канонического партнера по связыванию Dag1, laminin, также вызывает агрегацию AChR и , по-видимому, стабилизирует AChR кластеры; собственно которые усиливаются с помощью воздействия Agrin.^{95, 97} Dag1 следовательро способен одновременно связывать, по крайней мере, две независимые внеклеточные молекулы в NMJ, для поддержания их структуры (Figure 4A).



FIGURE 4 A role for dystroglycan at synapses. (A) Dystroglycan is localized postsynaptically at the neuromuscular junction (NMJ) end plate. Secreted neuronal Agrin binds to dystroglycan to induce acetylcholine receptor (AChR) cluster formation. AChR clusters are then stabilized by laminin associated with the synaptic basal lamina. (B) Hippocampal pyramidal neurons (PyNs) receive inhibitory perisomatic input from two classes of interneurons: PV+ and CCK+ basket interneurons. Dystroglycan is selectively required at CCK+ basket synapses. Postsynaptic deletion of DAG1 (NEX^Cre) results in the loss of CCK+ basket synapses without affecting the PV+ population. GABAAR clustering is mildly affected. (C) Purkinje cells (PCs) receive inhibitory somatodendritic input from molecular layer interneurons (MLIs). PC deletion of DAG1 (L7Cre) results in a decrease in presynaptic inputs, fewer presynaptic vesicles in MLIs, reduced density of synaptic GABAARs, and reduced density of Neuroligin 2 (NL2), which is presumed to interact with a presynaptic scaffolding molecule such as Neurexin (Nrxn). Electrophysiological recordings from PCs show reduced IPSC frequency and amplitude. Additional abbreviations: LAM = Laminin; AP = Action Potential, IPSC = Inhibitory Postsynaptic Current

В качестве генетических инструментов для манипуляций с экспрессиией DAG1 становятся исследования, показавшие, что делеция DAG1 затрагивает кластеры AChR в NMJ. Химерные по DAG1 нокаутные мыши обнаруживают фрагментированные нервные окончания, а AChRs собираются в микрокластеры, которые неспособны стабилизироваться.^{98, 99} Dag1 также необходим для собственно локализации Acetylcholinesterase (AChE) (энзима, ответственного за быстрые распады acetylcholine в синапсах после пресинаптического высвобождения) в NMJ благодаря её взаимодействиям с heparan sulfate proteoglycan (Perlecan).¹⁰⁰

Электрофизиологические последствия делеции DAG1 в не были тщательно изучены. Единственное прямое доказательство, что Dag1 является важным для электрофизиологической функции NMJ получено в исследовании на Drosophila, у которой гомологи DGC млекопитающих также экспрессируются в Drosophila NMJ. В противоположность NMJ млекопитающих, которые являются cholinergic, Drosophila NMJ являются glutamatergic. RNAi нокдаун Dg , как было установлено, затрагивает постсинаптические кластеры glutamate рецепторов, подобно роли в образовании кластеров AChR у Dag1 у др. организмов. Электрофизиологические записи выявили снижение амплитуды evoked junctional currents (EJCs), хотя на миниатюрных изображениях EJC амплитуда остается неизменной. Было установлено, что quantal содержимое в пресинаптических пузырьках было снижено. Перемещение Dg RNAi в нервной системе с использованием elav-GAL4 не выявило электрофизиологических фенотипических отклонений, тогда как RNAi-обусловленный нокдаун в мышцах с использованием 24B-GAL4 воспроизводит фенотип глобального RNAi-обусловленного нокдауна, указывая тем самым, что постсинаптический Dg в мышцах обеспечивает пресинаптическое высвобождение в двигательных нейронах.¹⁰¹

У млекопитающих, дефицитные по dystrophin mdx мыши, которые обнаруживают сходную постсинаптическую фрагментацию и нарушения образования AChR кластеров,^{102, 103}, как было установлено, также обнаруживают нарушения электрофизиологической функции NMJ. Некоторые исследования выявили снижение амплитуды miniature endplate potential (mEPP) и изменения в quantal содержимом, при этом некоторые исследования сообщили об увеличении quantal содержимого, тогда как др. увидели снижение или даже отсутствие изменений.^103-106 Это расхождение может быть объяснено различиями в типе мышц или во временной точке измерения, или это может быть обусловлено различиями в методах подсчета quantal содержимого.

Учитывая роль Dag1's в формировании кластеров постсинаптических рецепторов в NMJ и его экспрессию в постсинаптических образованиях в коре, гиппокампе и мозжечке,²³ было предположено, что Dag1 может функционировать в качестве организатора в центральные синапсы. Dag1 ко-экспрессия с маркерами GABAergic синапсов,^24,107-110, но его значение для ингибирующих синапсов пока неясно, т.к. делеция DAG1 в культивируемых нейронах не влияет на дифференцировку ингибирующих синапсов.²⁴ Последующие исследования показали, что Dag1 играет роль и в регуляции масштабируемости (scaling) ингибирующих синапсов in vitro. Хроническое воздействие на первичные нейроны гиппокампа ант агониста GABA рецептора, bicuculline, увеличивает размер поверхности GABAA рецепторов (GABAARs) в качестве механизма восстановления гомеостаза, приводя к увеличению амплитуды miniature inhibitory postsynaptic current (mIPSC). Поверхность экспрессии Dag1 увеличивается в зависимости от действия bicuculline, а RNAi-обусловленный нокдаун DAG1 блокирует эту реакцию синаптического scaling. Нокдаун glycosyltransferase LARGE1 также блокирует синаптический scaling, указывая, что эта реакция нуждается в собственно гликозилировании Dag1. Это указывает на то, что внеклеточные взаимодействия обеспечивают этот эффект. Чувствительным лигандом может быть Agrin, т.к. хроническое воздействие Agrin достаточно для индукции накопления GABAAR и синаптического scaling Dag1-зависимым образом.¹¹⁰

In vivo исследование прояснило роль Dag1 в синапсах. Ранние работы отслеживали функциональные последствия делеции DAG1 в головном мозге, сконцентрировавшись на long-term potentiation (LTP) гиппокампа. Делеция DAG1 из нейроэпителиальных и клеток радиальной глии (и возникающих из них потомков), используя hGFAP^Cre, приводило в результате к нарушениям LTP.⁶⁵ Постсинаптическая делеция DAG1 из пирамидальных нейронов с использованием NEX^Cre также приводила к нарушениям LTP, подтверждая, что Dag1 действует внутри нейронов, чтобы регулировать синаптическую функцию. Тот же самый фенотип был обнаружен у Largemyd мышей, которые обнаруживали достоверное уменьшение matriglycan цепочек в α-Dag1, показывая, что роль Dag1's в синапсах зависит от гликозилирования.²⁷ Присутствующий механизм, с помощью которого Dag1 поддерживает функцию синапсов, отличается в разных регионах головного мозга. Генетическая делеция DAG1 приводит к уменьшению размеров кластеров GABAAR и плотности популяций специфических нейронов.^75,109 В гипокампе, постсинаптическая делеция DAG1 из пирамидальных нейронов с использованием NEX^Cre вызывает потерю пресинаптических импульсов из CCK+ basket промежуточных нейронов. Базовая линия спонтанных IPSCs остается неизменной м количество пресинаптических GABAergic окончаний, по-видимому, остается нормальным, только с одним легким отклонением в отношении размера кластера GABAAR (Figure 4B).⁷⁵ Это, скорее всего, обусловлено избирательной потерей импульсов (inputs) от CCK+ basket промежуточных нейронов, тогда как PV+ basket промежуточные нейроны остаются неизменными. В мозжечке, однако, делеция DAG1 из нейронов Purkinje с использованием L7^Cre приводит к снижению в количестве ингибирующих импульсов от промежуточных нейронов молекулярного слоя, снижение плотности GABAAR, уменьшение пресинаптических пузырьков и прогрессирующе снижение амплитуды спонтанных IPSC с увеличением IPSC interevent интервала (Figure 4C).¹⁰⁹ В сетчатке, Dag1 располагается пресинаптически в фоторецепторных ленточных синапсах - единственный известный пример пресинаптическгого Dag1. Conditional делеция DAG1 из фоторецепторов с использованием Crx^Cre приводит к снижению амплитуды и увеличению слабо выраженному времени b-волны электроретинограммы.^{33, 62} В этом контексте, секретируемая, LG-домен-содержащая молекула Pikachurin обеспечивает связь между пресинаптическим Dag1 и постсинаптическим трансмембранным рецептором GPR179.¹¹¹

Многие находки касательно функции Dag1's в синапсах были воспроизведены на dystrophin-дефицитных mdx мышах. Dystrophin, принципиальный компонент DGC, локализуется совместно с Dag1 и маркирует ингибирующие синапсы .^24,109,112 Плотность и интенсивность GABAAR снижены как в гиппокампе, так и мозжечке mdx мышей по сравнению с контролем дикого типа.¹¹² В соответствии с этой находкой, считанные и спонтанные и miniature IPSCs с mdx нейронов Purkinje мозжечка, продемонстрировали снижение частоты и амплитуды.^113-116 Парное считывание с нейронов Purkinje и промежуточных нейронов молекулярного слоя (MLIs) выявило снижение амплитуды evoked IPSC, частично за счет увеличения доли синаптической неспособности у mdx мышей. Было установлено, что пресинапсы имеют более мелкий легко разъемный (releasable) пул, снижение количества высвобождаемых пузырьков и снижение quantal размера. Электронная микроскопия вывила снижение от тела к дендритам импульсов в нейронах Purkinje.¹¹⁶ Электронная микроскопия L7^Cre;Dag1^cKOs (нейроны Purkinje, лишенные Dag1) также показала меньшее количество пресинаптических пузырьков в синапсах MLI:Purkinje нейронах.¹⁰⁹ Все вместе это подчеркивает роль DGC не только в формировании кластеров постсинаптических рецепторов, но в формировании и функции синапсов также.

Было предположено, что Dag1 взаимодействует с молекулами пресинаптических каркасов Neurexin in vitro³², а Dag1, как было установлено, конкурирует с neurexophilin для связывания Neurexin,¹¹⁷, указывая тем самым, что Dag1 может действовать как молекула синаптической адгезии. Точечная мутация T190M в DAG1 приводит к гипогликозилированному Dag1, редуцируя способность Dag1 связывать Neurexin.¹¹⁸ Однако, пресинаптическая иннервация пирамидальных нейронов в гиппокампе, по-видимому, нормальная у этих мышей,⁷⁵ подтверждая, что имеется неизвестный партнер по пресинаптическому взаимодействию для Dag1.

Dag1 участвует также в миелинизации как ЦНС, так и ПНС. В ЦНС, DAG1 экспрессируется олигодендроцитами, а нокдаун DAG1 в культивируемых предшественниках олигодендроцитов (OPCs) вызывая дефицит дифференцировки OPC и снижение специфичных для миелина белков. Сходным образом, совместное культивирование OPCs с нейронами в присутствии блокирующих Dag1 антител ингибирует способность к дифференцировке олигодендроцитов, чтобы сформировать комплекс myelin и инициировать миелинизирующиеся сегменты.¹¹⁹

В ПНС, DAG1 экспрессируется миелинизирующимися Шванновскими клетками, где он локализуется как в наружной мембране, противостоящей базальной ламине, так и в узелках Ranvier.¹²⁰ Conditional делеция DAG1 в Шванновских клетках с использованием P0^Cre вызывает дефицит радиальной сортировки, формирование миелиновых слоёв, структуры узелков, образования кластеров натриевых каналов, и снижение скорости проводимости периферическими нервами и амплитуды потенциала действия.^120-123 В узелках Ranvier, Dag1 рекрутирует Perlecan, который в свою очередь связывает gliomedin, чтобы инициировать образование кластеров натриевых каналов.¹²³

Dag1 располагается на синаптических нервных окончаниях (endfeet) от около-сосудистых астроцитов и на синаптических нервных окончаниях радиальной глии, примыкающих к поверхности мягкой мозговой оболочки.^{23, 124} Принимая во внимание такой характер расположения, Dag1 может быть важным для поддержания целостности гемато-энцефалического барьера. Этот барьер состоит из эндотелиальных клеток, поляризованных отростков астроцитов и окружающей базальной ламины - все соединены плотными соединениями. Проницаемость гемато-энцефалического барьера была оценена при DAG1 conditional нокаутах, приводящих к отсутствию Dag1 в нейронах и глии ЦНС (с использованием Nestin^Cre). После использования Evans Blue красителя для сосудистой системы, краска аберрантно пересекала барьер, проникая в паренхиму головного мозга Nestin^Cre;Dag1^cKOs.²⁶ Тот же самый фенотип просачивания описан у мышей, экспрессирующих мутации в др. DGC-ассоциированных генах, включая dystrophin и α-dystrobrevin.^{125, 126} Согласуется с протеканием гемато-энцефалического барьера то, что, Dag1 мутанты обнаруживают активацию периваскулярной микроглии,²⁶ как полагают, это воспалительная реакция на чужеродные субстанции.

Dag1 может регулировать целостность гемато-энцефалического барьера частично благодаря формированию кластеров водного канала Aquaporin-4 (AQP4) и inward-rectifying potassium channel Kir4.1, оба из них участвуют гомеостазе воды в астроцитах. Вместе, AQP4 и Kir4.1 поддерживают осмотический гомеостаз цереброспинальной жидкости путем перемещения воды и удаления внеклеточного калия в ответ на активность нейронов.¹²⁷ AQP4 взаимодействует косвенно с внутриклеточным доменом Dag1 посредством ассоциированного с dystrophin адаптерного белка α-syntrophin.¹²⁸ Локализация AQP4 и Kir4.1 изменяется у мутантов с отсутствием Dag1^{66, 78}, а взаимодействие Dag1 и laminin α2 , как было установлено, индуцирует образование кластеров AQP4 и Kir4.1 в синаптических нервных окончаниях астроцитов.^{25, 26, 129, 130} Эти кластеры AQP4 и Kir4.1 необходимы для соотв. поляризации астроцитов, которая поддерживает целостность нейро-сосудистых единиц, представляющих собой гемато-энцефалический барьер.

Dystroglycan's главная роль в качестве трансмембранного компонента DGC заключается в соединении внеклеточного матрикса с актиновым цитоскелетом. Повсеместная экспрессия DAG1 по всему телу позволяет ему исполнять многие роли в мышцах, ЦНС и ПНС и др. частях. Во время развития нервной системы Dag1 в нейроэпителии необходим для миграции нейронов в кору, гиппокамп, мозжечок и сетчатку.^{27, 64-66, 71} Dag1 также необходим клеточно неавтономно для правильного наведения аксонов в спинном мозге, внутренней капсуле, гиппокампе и зрительном тракте.^{34, 35, 74, 85} Устойчивая экспрессия нейронального Dag1 у взрослых указывает на его роль в периферических и центральных синапсах. На периферии Dag1 располагается в концевых пластинках NMJ, где он образует кластеры и стабилизирует ацетилхолиновые рецепторы.^{95, 97} В ЦНС Dag1 важен в ингибирующих синапсах гиппокампа и мозжечка и в фоторецепторных синапсах сетчатки.^62,75,109 Dag1 располагается в синапсах по всему развивающемуся и взрослому головному мозгу, где он выполняет дополнительные роли в развитии и функционировании синапсов, которые ещё рне изучены тщательно.

Существует ли общий механизм функционирования Dag1 в синапсах? Среди многих систем, Dag1, как было установлено, участвует в формировании кластеров рецепторов. Dag1/Dg индуцирует агрегаты постсинаптических ацетилхолиновых и глутаматовых рецепторов в NMJs млекопитающих и Drosophila, соотв.^{95,97, 101} Dag1 также образует кластеры натриевых каналов в узелках Ranvier водного канала Aquaporin-4 и inward rectifying potassium channel Kir4.1 в гемато-энцефалическом барьере.^{26, 66, 78, 123, 131} Учитывая эту консервативную роль Dag1 в формировании кластеров рецепторов во многих системах, становится весьма возможным, что Dag1 играет сходную роль в формировании кластеров постсинаптических элементов в головном мозге. Доказательством служат измененная плотность и размер кластеров GABAA рецепторов а гиппокампе и мозжечке при DAG1 conditional нокаутах.^{75, 109} Интересно, что conditional делеция GABRA1, который кодирует GABA_A α1 рецепторную субъединицу, в Purkinje нейронах с использованием L7^Cre приводит к снижению иммунореактивности Dag1 в коре мозжечка, указывая тем самым реципрокные взаимоотношения.¹⁰⁷ Необходимы дальнейшие исследования для понимания механизма, обеспечивающего этот феномен. Недавняя работа идентифицировала косвенное взаимодействие между Dag1 и InSyn1 посредством syntrophin и/или β-dystrobrevin, который регулирует организацию и субъединичный состав GABA рецепторных комплексов в гиппокампе.¹⁰⁸

Остается ключевой вопрос, действительно ли постсинаптическая роль Dag1 нуждается в его внутриклеточном домене (ICD). Давно известно, что ICD в Dag1 непосредственно соединяется с dystrophin, однако не известно, действительно ли (1) Dag1 необходим для соотв. локализации синаптического dystrophin, (2) что dystrophin необходим для соотв. локализации синаптического Dag1 или что (3) оба реципрокно необходимы для правильной локализации DGC в синапсах. Интересно, что Briatore et al.¹⁰⁹ осуществили иммуноокрашивание dystrophin и Dag1 в нейронах Purkinje у дефицитных по dystrophin mdx мышей и показали, что внеклеточный α-Dag1 поддерживает соотв. локализацию в ингибирующих синапсах, тогда как трансмембранный β-Dag1 остается неизменным. Др. разобщенность между dystrophin и Dag1 наблюдалась в гиппокампе, где делеция DAG1 приводила аномальному perisomatic целевому воздействию CCK+ basket промежуточных нейронов.⁷⁴ CCK+ basket промежуточные нейроны в гиппокампе mdx обнаруживали точно такое же аномальное наведение аксонов.⁸⁷ Однако, поскольку этот эффект неправильного нахождение цели зависел от гликозилирования α-Dag1, при этом внутриклеточный домен Dag1 оказывался ненужным.⁷⁴ Эта особенность, что потеря dystrophin, внутриклеточного партнера по связыванию Dag1, приводит к дефекту нахождения цели пресинаптическими аксонами, которое, по-видимому, не требует ICD в Dag1. Эти результаты подчеркивают взаимоотношения типа "яйцо или курица" между dystroglycan и dystrophin, которое требует дальнейшего тщательного изучения.^{74, 87}

Гликозилирование необходимо для миграции нейронов и наведения аксонов, поскольку мутации в генах пути гликозилирования приводят к почти полной потере гликозилирования, фенокопируя потерю самого DAG1.^{34, 69, 74, 85, 132} Однако, если гликозилирование необходимо для функционирования Dag1 в синапсах, то это остается неясным. В одном исследовании DAG^{1T190M> мутантов с существенным гипогликозилированием, продемонстрирована нормальная иннервация пирамидальными нейронами CCK+ basket промежуточных нейронов в гиппокампе. Напротив, делеция в переднем мозге POMT2, которая вызывает полую потерю гликозилирования Dag1, продемонстрировала дефекты нахождения цели CCK+ basket промежуточными нейронами, которые фенокопировали делецию DAG1.74 Точечные мутации в glycosyltransferases, которые приводят к градированным уровням гипогликозилирования Dag1, обнаруживали промежуточные фенотипы, подтверждая, что уровень гликозилирования является критическим фактором в предопределении тяжести синаптических фенотипических отклонений.74 Определение взаимоотношения между гликозилированием Dag1 и синаптической функцией является критическим для понимания фенотипов у пациентов с dystroglycanopathy, т.к. почти во всех случаях наблюдается снижение гликозилирования в качестве противоположности полной потери Dag1 белка.}