Иммунотерапия, такая как терапия рецепторами химерных антигеннов (CAR) Т-клеток, является многообещающим подходом в борьбе с раком. Эффективность терапии зависит от функции Т-клеток, которая определяется сетью генов, экспрессируемых этими иммунными клетками. Недавно исследователи из Университета Дьюка разработали скрининговую платформу на основе CRISPR для выявления ключевых эпигенетических регуляторов функции Т-клеток человека и обнаружили центральную роль транскрипционного фактора Basic leucine zipper transcription factor ATF-like 3 (BATF3) в перепрограммировании экспрессии нескольких генов и повышении эффективности CAR Т-клеток в уничтожении раковых клеток.¹ Их выводы, опубликованные в журнале Nature Genetics, могут помочь в разработке более эффективных иммунотерапевтических препаратов на основе Т-клеток.

The illustration shows an artistic rendering of CRISPR-enhanced T cells attacking a tumor.

Researchers used a CRISPR-based platform to identify master regulators of T cell function. Ella Maru Studio

"Это очень элегантное исследование. Очень интересно наблюдать за тем, как здесь развивают эту область CRISPR-скрининга, используя первичные человеческие Т-клетки, с которыми не так-то просто работать", - сказал Fredrik Wermeling, иммунолог из Каролинского института, не принимавший участия в исследовании.

В течение многих лет биомедицинский инженер и автор исследования Charles Gersbach из Университета Дьюка и его команда разрабатывали технологии для скрининга и манипуляций с экспрессией генов в клетках. В предыдущих исследованиях они использовали эти инструменты редактирования эпигенома для перепрограммирования фибробластов в нейронные клетки и для контроля дифференцировки клеток в популяциях нейронов и плюрипотентных стволовых клеток человека.^2-4

Заинтересованные в большем терапевтическом применении этих инструментов, исследователи обратили свое внимание на иммунотерапию на основе Т-клеток, в частности на CAR в Т-клетках. По словам Герсбаха, использование таких подходов к эпигенетическому улучшению Т-клеток может помочь расширить терапию на основе Т-клеток за пределы тех видов рака, например, рака крови, при которых они были эффективны.

Для своего исследования команда разработала подход к скринингу на основе CRISPR в первичных человеческих CD8+ Т-клетках. Исследователи соединили каталитически неактивную нуклеазу Cas9 с транскрипционным репрессором для CRISPR-интерференции (CRISPRi) или активатором для CRISPR-активации (CRISPRa). Используя направляющие РНК, нацеленные на конкретные гены, исследователи направили неактивную Cas9 на то, чтобы заглушить или активировать экспрессию.

Чтобы выбрать гены-мишени, ученые проанализировали публичные наборы данных, описывающие изменения в доступном хроматине по мере дифференцировки Т-клеток, и обратили внимание на факторы транскрипции, которые связываются с этими геномными областями. Они выявили 120 транскрипционных факторов, обогащенных в регионах хроматина, доступность которых меняется в процессе дифференцировки Т-клеток. Затем они направили CRISPRi и CRISPRa на гены, кодирующие каждый из этих транскрипционных факторов, чтобы определить, какой из этих белков, если таковой имеется, будет действовать как главный регулятор.

. 3D structural model of a Cas protein and sgRNA targeting and unwinding DNA for gene editing. The Scientist University CRISPR Gene Editing: Cas9 and Beyond

Соединив нарушения потери функции и усиления функции, команда выявила несколько потенциальных модуляторов функции Т-клеток. Одним из наиболее перспективных оказался BATF3, который способствует выживанию CD8+ Т-клеток.⁵

В последующих экспериментах in vitro команда обнаружила, что избыточная экспрессия BATF3 регулирует широкую сеть генов. В то время как некоторые из генов с повышенным уровнем экспрессии связаны с выживанием Т-клеток, некоторые из понижающихся по уровню генов связаны с истощением Т-клеток - естественным механизмом, который эволюционировал, чтобы держать Т-клетки под контролем, но который может препятствовать их способности вызывать противоопухолевый ответ в случаях рака.

Они также обнаружили, что избыточная экспрессия BATF3 повышает способность CAR T-клеток уничтожать раковые клетки in vitro. Лечение солидных опухолей было серьезной проблемой для CAR T-клеточной терапии, поэтому группа исследователей проверила, работает ли эта стратегия против таких опухолей. На гуманизированной мышиной модели рака молочной железы исследователи обнаружили, что CAR T-клетки, созданные для избыточной экспрессии BATF3, уменьшают размер опухоли больше, чем стандартные CAR T-клетки.

"Мы знали, что BATF3 важен для Т-клеток. Но мы не знали, что, избыточно экспрессируя его, мы можем глубоко изменить их фенотип и сделать их невероятно более эффективными в борьбе с этими моделями опухолей", - говорит Gersbach .

Чтобы оценить, связаны ли изменения экспрессии генов, вызванные BATF3, с положительными клиническими результатами, команда сравнила транскрипционные сигнатуры Т-клеток с избыточной экспрессией BATF3 и без нее с транскрипционными профилями пациентов, получивших терапию CAR T-клеток в недавнем клиническом исследовании.⁶ Они обнаружили, чтоизбыточная экспрессия BATF3 глушит более 30 процентов генов, связанных с глушением ответа, и активирует 20 процентов генов, связанных с ответом на терапию CAR T-клеток. "Если удастся установить закономерности экспрессии этих генов, это будет очень полезно как для CAR T-клеток, так и для противораковых вакцин или других видов терапии на основе T-клеток", - отметил Wermeling.

По словам Wermeling, важным следующим шагом в этом исследовании является перевод полученных результатов в клинические испытания, и Gersbach и его команда уже преследуют эту цель. "Мы очень рады, что можем реально повлиять на результаты лечения раковых больных с помощью подобных усовершенствований и вмешательств", - сказал он.

Чарльз Герсбах является соучредителем и научным консультантом компании Tune Therapeutics.

Здесь показана крио-ЭМ карта белка Fanzor в комплексе с его направляющей РНК (фиолетовый цвет) и ДНК (целевая нить - красный цвет, комплементарная нить - синий цвет).

McCutcheon SR, et al. Transcriptional and epigenetic regulators of human CD8+ T cell function identified through orthogonal CRISPR screens. Nat Genet. 2023;55(12):2211-2223.

Black JB, et al. Targeted epigenetic remodeling of endogenous loci by CRISPR/Cas9-based transcriptional activators directly converts fibroblasts to neuronal cells. Cell Stem Cell. 2016;19(3):406-414.

Black JB, et al. Master regulators and cofactors of human neuronal cell fate specification identified by CRISPR gene activation screens. Cell Rep. 2020;33(9):108460.

Kwon JB, et al. Myogenic progenitor cell lineage specification by CRISPR/Cas9-based transcriptional activators. Stem Cell Rep. 2020;14(5):755-769.

Ataide MA, et al. BATF3 programs CD8+ T cell memory. Nat Immunol. 2020;21(11):1397-1407.

Haradhvala NJ, et al. Distinct cellular dynamics associated with response to CAR-T therapy for refractory B cell lymphoma. Nat Med. 2022;28(9):1848-1859.