> Как и в случае с другими рецепторами и потенциальными лекарственными мишенями, изучение животных значительно продвинуло исследование P2X7. Чаще всего это достигается путем прямого молекулярного, биохимического, иммуногистохимического и функционального анализа клеток, тканей и органов животных, в частности мышей и крыс [55]. С этим связано непрямое использование животных для получения антител или нанотел против P2X7 человека и грызунов в качестве инструментов для обнаружения P2X7, а в некоторых случаях даже с ингибирующими или потенцирующими свойствами и потенциальным использованием в качестве биопрепаратов [56]. Классические процедуры включали использование кроликов для получения анти-P2X7 поли-клональных антител [57,58], а также использование грызунов для получения мышиных против человека P2X7 моноклональных антител (mAbs), таких как клоны L4 [59] и 4B3A4 [60], и крысиных анти-морских P2X7 mAbs, таких как клоны Hano43 [57] и 1F11 [61], последний из которых может ингибировать мышиный P2X7. Клон L4, обнаруживающий внеклеточный эпитоп и обладающий ингибирующими свойствами [59], нашел широкое применение в различных областях [62]. В совокупности это привело к появлению в продаже широкого спектра анти-P2X7 поликлональных антител (например, кат. № APR-004 и APR-008, Alomone Labs, Иерусалим, Израиль) и некоторых анти-P2X7 mAbs (например, кат. № 148702, BioLegend, San Diego, CA, USA; кат. No. ALX-802-027, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA). Антитела также позволили разработать иммуноферментный анализ (Cusabio, Houston, TX, USA) для количественного определения циркулирующего растворимого P2X7 [63], который может иметь диагностический потенциал при сепсисе [64], пневмонии Mycoplasma pneumoniae [65], остром инфаркте миокарда [66], COVID-19 [67], эпилепсии [68], но не шизофрении [69].

Недавние биотехнологические подходы привели к созданию античеловеческих (Dano1) и анти-муравьиных P2X7 (13A7 и 14D5) нанотел из лам [70]. Такие нанотела оказались полезными для идентификации P2X7-экспрессирующих клеток в тканях и органах грызунов [71,72] и человека [73], а также в качестве потенциальных биологических препаратов для ослабления болезней, что уже было показано на мышиных моделях воспалительных [70] и неврологических [74] заболеваний, а также рака [75]. Кроме того, анти-P2X7 нанотела были использованы для создания модифицированных по капсиду адено-ассоциированных вирусных (AAV) векторов [76], что позволяет селективно трансдуцировать P2X7-экспрессирующие клетки. Другой интересной разработкой является создание и использование AAV-векторов, кодирующих анти-P2X7 нанотела, для обеспечения безопасной, стабильной и длительной нанотелами опосредованной блокады P2X7 in vivo после однократной инъекции AAV-вектора [77]. Последняя методика показала способность ингибировать P2X7 на поверхности циркулирующих иммунных клеток, а также в микроглии мозга [78], и была использована для демонстрации роли P2X7 в опухолевом росте [79] на мышиных моделях. Данный методический подход представляет собой альтернативу процедурам нокаута или нокдауна P2X7, но при этом позволяет изучать долгосрочные эффекты биопрепаратов, направленных на P2X7 in vivo.

С момента первого клонирования P2X7 (первоначально называвшегося P2Z) у крысы [37] и человека [80] были клонированы P2X7 у различных видов животных (табл. 2), что позволило продвинуться в изучении P2X7 с помощью структурных, функциональных и фармакологических исследований [81,82]. Так, например, важной вехой в исследованиях P2X7 стало определение первой кристаллической структуры P2X7, которое было достигнуто путем скрининга усеченных вариантов P2X7 из 10 видов млекопитающих. Успешно решенная структура P2X7 гигантской панды выявила аллостерический карман связывания лекарств, с которым связывается большинство антагонистов P2X7, и помогла раскрыть механизм их действия [83]. Совсем недавно с помощью криоэлектронной микроскопии рекомбинантного P2X7 крысы была получена первая полноразмерная структура P2X7, впервые выявившая такие его цитоплазматические особенности, как пальмитоилированный "якорный домен C-Cys", который предотвращает десенситизацию, и также глобулярный "балластный домен", содержащий динуклеарный Zn+ комплекс и высокоаффинный сайт связывания гуанозинового нуклеотида [84], который может служить для стабилизации тримерного комплекса [85] независимо от внеклеточного ATP-связывающего домена [86].

Животные послужили моделью для оценки фармакокинетических свойств и безопасности ряда антагонистов P2X7. Например, препарат CE-224,535 продемонстрировал отличную фармакокинетику и безопасность у крыс, собак и обезьян [87], что позволило компании Pfizer провести первое исследование IIA фазы у людей с ревматоидным артритом, где этот препарат также оказался хорошо переносимым и безопасным [88]. Наряду с отсутствием фенотипа раздражения у животных с нокаутом гена P2rx7(P2rx7KO) (раздел 3.3), это стало важным шагом для использования ингибиторов P2X7 в будущих исследованиях и при лечении заболеваний. Однако по неизвестным пока причинам, несмотря на многообещающие данные, полученные на животных, терапевтическая ценность этого соединения у человека не оправдала ожиданий. Это может быть обусловлено различными причинами, такими как варианты сплайсинга или однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) с измененной функциональностью, агонистической специфичностью и/или фармакокинетическими свойствами.

Поскольку P2X7 рассматривается в качестве лекарственной мишени при различных заболеваниях центральной нервной системы, включая нейродегенеративные и нервно-психические расстройства, а также нейропатическую боль, в центре внимания оказалась разработка центрально доступных антагонистов [89]. Совсем недавно была показана потенциальная полезность радиомеченых лигандов P2X7 в качестве агентов диагностической визуализации in vivo, в частности в центральной нервной системе [90]. Так, например, не-человеко-образные приматы использовались для доклинической оценки [11C]GSK1482160 [91] и [18F]JNJ-644133739 [92]. Кроме того, исследования с использованием этих и других радиомеченых лигандов P2X7 в моделях грызунов подчеркивают их потенциал в качестве маркеров нейрального воспаления [93], воспаления при раке [94] или атеросклеротических поражениях [95].

Таблица 2. Рекомбинантные формы P2X7.

Физиология и патофизиология представляют собой сложные процессы, которые нелегко воспроизвести с помощью изучения клеток, тканей или органов ex vivo, а также с помощью биоинженерных или вычислительных методов. В отсутствие достаточных источников человеческих тканей, органов или моделей использование животных моделей остается необходимым для изучения роли P2X7 в здоровье и болезни, что в будущем принесет пользу как людям, так и животным за счет развития новых знаний, потенциальных биомаркеров, лекарств и методов лечения. Однако исследования на таких моделях, включая уход за животными, требуют применения этических, гуманных и ответственных принципов и практик, включая, помимо прочего, одобрение и соблюдение институциональных норм, а также учет принципов замены, сокращения и уточнения (3Rs) [104], руководства ARRIVE [105] и других специфических для данной области рекомендаций. Примером последних являются рекомендации по изучению препаратов для лечения бокового амиотрофического склероза у грызунов [106,107]. Несмотря на свою ценность, рекомендации по конкретным областям могут содержать ограничения [108] и поэтому должны тщательно рассматриваться в более широком контексте других имеющихся знаний и ресурсов. Учитывая ценность животных моделей, в оставшейся части данной статьи будет представлен обзор моделей мышей и крыс, используемых для изучения P2X7. Наконец, в статье будет описано ограниченное число исследований с участием морских свинок, кроликов, макак-резусов, собак, кошек, рыбок данио и других видов рыб, в которых изучался P2X7.

Мыши (Mus musculus) широко использовались для изучения роли P2X7 в широком спектре доклинических моделей заболеваний и для определения терапевтической эффективности воздействия на P2X7 с помощью ингибиторов малых молекул, биологических препаратов или стратегий нокдауна генов [54,109]. Хотя эти исследования значительно расширили понимание физиологической и патофизиологической роли P2X7, необходимо учитывать некоторые предостережения. Хотя в рамках данной статьи не представляется возможным рассмотреть все проведенные на сегодняшний день исследования, сравнение небольшого числа доклинических исследований позволяет выявить несколько важных моментов, которые следует учитывать при интерпретации результатов прошлых исследований и при проведении будущих исследований P2X7 у мышей, и которые могут быть применены к другим моделям животных.

В большинстве доклинических исследований на мышах до настоящего времени использовался антагонист P2X7 Brilliant Blue G (BBG) [110], что во многом объясняется его широкой доступностью, простотой применения и чрезвычайно низкой стоимостью по сравнению с другими антагонистами P2X7 [54]. Кроме того, BBG очень похож на Brilliant Blue FCF, который является разрешенным пищевым красителем [111]. Таким образом, BBG остается ценным препаратом для предварительных доказательных исследований, однако необходимо учитывать неспецифические эффекты. Например, BBG может связываться с различными белками и ингибировать их [112], в том числе и другие рецепторы P2X, хотя и с меньшей эффективностью, чем P2X7 [110,113]. Кроме того, BBG может ингибировать ATP-свободный канал паннексин-1 [114] и Na+-каналы нейронов [115], а также снижать активность прионов [116] и образование амилоидных фибрилл [117] и, наоборот, способствовать агрегации синуклеина [118]. Таким образом, влияние на P2X7 должно быть подтверждено с помощью более специфичных соединений. Ограниченная способность BBG преодолевать гематоэнцефалический барьер в высоких концентрациях [119] и его накопление в периферических органах мышей [120] еще больше снижают его пригодность. Важно отметить, что BBG, но не специфический антагонист P2X7 JNJ-47965567 [121], не смог снизить P2X7-опосредованное высвобождение IL-1β в анализе цельной крови человека [122], что ставит под сомнение возможность блокирования P2X7 в циркулирующих клетках крови или клетках в других внеклеточных средах, а также эффективность BBG при различных заболеваниях in vivo. Наконец, для BBG и других антагонистов P2X7 были отмечены существенные различия в видовой специфичности [54].

Во многих описанных доклинических моделях мышей режимы дозирования антагонистов, по-видимому, основаны на эмпирических, а не фармакокинетических данных. Например, первоначально BBG использовался на крысах, где однократное внутрибрюшинное введение 100 мг/кг, а не 40 мг/кг BBG снижало лихорадку, вызванную липополисахаридом [123]. В более позднем исследовании 10 мг/кг BBG, введенного в виде гранул, ослабляло развитие экспериментального аутоиммунного энцефалита (модель рассеянного склероза человека) у крыс [124]. Первое исследование с использованием BBG на мышах показало, что 45,5 мг/кг BBG, вводимого внутривенно каждый второй день, ослабляет развитие болезни Гентингтона [125]. Хотя эти исследования послужили важной основой для дальнейших исследований P2X7, режим дозирования BBG не был объяснен. Впоследствии доза примерно 50 мг/кг BBG внутривенно каждый второй день или три раза в неделю получила широкое распространение и была показана, например, для уменьшения бокового амиотрофического склероза у мышей с Glu93Ala супероксидазой дисмутазой 1 [126-128]. В одном из этих исследований [126] было показано, что 250 мг/кг ВВГ три раза в неделю дополнительно улучшает состояние здоровья и двигательную координацию, что свидетельствует о том, что 50 мг/кг BBG может быть неоптимальным и подчеркивает необходимость оптимизации режимов дозирования. Аналогичным образом, в гуманизированной мышиной модели (см. раздел 3.5) ежедневные инъекции 50 мг/кг BBG (дни 0-10) лучше снижали заболевание "трансплантат против хозяина" (GVHD) [129], частое осложнение аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [130], чем 50 мг/кг BBG каждый второй день (дни 0-8) [131]. Интересно, что ежедневные инъекции неселективного антагониста P2X7 пиридоксальфосфат-6-аксофенил-2'-4'-дисульфоновой кислоты [132] в дозе 300 мг/кг (дни 0-10) лишь частично снижали GVHD [129]. Кроме того, ежедневные инъекции антагониста P2X7 AZ101606120 [133] в дозе 2 мг/кг (дни 0-10) не дали эффекта [134].

Для обеспечения сопоставимости результатов важно оптимизировать и стандартизировать процедуры, и в этой области может быть полезен международный консенсус и рекомендации по этим вопросам. Разработка анти-P2X7 нанотел с длительным периодом полураспада [70] и создание AAV-векторов, кодирующих эти нанотела, способных к устойчивому, безопасному производству нанотел в течение 100 дней [77] и проникновению в центральную нервную систему [78], позволяют использовать альтернативные стратегии исследования P2X7 в мышиных моделях заболеваний, а также новые потенциальные методы лечения у людей и других животных. Наконец, следует упомянуть и об использовании агонистов и позитивных модуляторов в качестве инструментов в исследованиях P2X7. Например, недавно было показано, что малая молекула активатора P2X7 HEI3090 в сочетании с блокадой иммунных контрольных точек усиливает противоопухолевый иммунный ответ у мышей [135]. Интересно, что была также разработана потенцирующая анти-P2X7-нанотело (14D5), способная усиливать воспалительные нарушения у мышей [70]. Такие биопрепараты открывают возможности для лечения патофизиологических состояний, при которых активность P2X7 недостаточна или нуждается в усилении.

При использовании мышей для изучения P2X7 необходимо учитывать, что могут существовать SNP с измененной функциональностью, в том числе SNP с потерей функции P2X7, присутствующий в нескольких широко используемых штаммах мышей (табл. 3). Этот SNP кодирует замену пролина на лейцин в остатке 451 в цитоплазматическом С-конце P2X7 (рис. 1), что нарушает функцию рецептора в ряде тестов [136]. По сравнению с мышиным P2X7-Pro451 гетерологичная экспрессия мышиного P2X7-451Leu в клетках эмбриональной почки человека (HEK)-293 приводит к снижению индуцированных агонистом потоков Ca²⁺ и поглощения красителя, а также к снижению ATP-индуцированного воздействия фосфатидилсерина [136,137]. Кроме того, при экспрессии в клетках HEK-293 SNP Pro451Leu ухудшает агонистическое поглощение красителя в контексте варианта P2X7a, но не в контексте P2X7k [43], который в 8 раз более чувствителен к агонисту и демонстрирует более медленную кинетику деактивации [35]. Важно отметить, что индуцированные агонистом потоки Ca2+ и поглощение красителя были одинаковыми для вариантов Pro451 и 451Leu при их трансфекции в клетки человека 1321N1 [138]. Более того, та же мутация в рекомбинантном P2X7 человека не ухудшает поглощение красителя в клетках HEK-293 [139]. Таким образом, область вокруг остатка 451 может опосредовать клеточно-специфическое взаимодействие, которое может зависеть от различных внутриклеточных сигнальных механизмов. В соответствии с этим представлением данный SNP находится в С-концевом хвосте рецептора (рис. 1) в глобулярном "балластном домене", который, как считается, играет важную роль в стабильности гомотримерного рецептора, а также во внутриклеточной сигнализации.

Table 3. Distribution of the Pro451Leu SNP in the P2rx7gene of commonly used mouse strains.



Figure 1. Molecular models of the mouse P2X7 subunits with amino acid residue Pro451 or 451Leu. (A-D) The full-length mouse P2X7 subunit (NCBI) was modeled with the I-TASSER protein structure prediction suite [142,143] using the cryo-electron microscopy structure of rat P2X7, PDB ID: 6u9v [84] as a template. Sections of the P2X7 subunits are colored as depicted by the dolphin-like structure (inset) of the P2X4 subunit [144], including the head (blue), upper body (violet), right (magenta) and left (yellow) flippers, dorsal fin (red), lower body (gray), transmembrane domain-spanning fluke (green), and the intracellular ballast domain (not shown on inset; white). Boxed areas indicate the region containing the Pro451Leu SNP. (A) Modeling of P2X7-Pro451 returned a C-score of 0.25 with an estimated TM-score of 0.75 ± 0.11 and root mean square deviation of 7.1 ± 4.2 ?. (B) Close-up images of boxed areas, with Pro451 shown as ball and stick structures (magenta). Amino acid residues within 5 ? of the residue of interest are also labeled (cyan). (C) Modeling of P2X7-451Leu returned a C-score of 0.20 with an estimated TM-score of 0.74 ± 0.11 and root mean square deviation of 7.2 ± 4.2 ?. (D) Close-up images of boxed areas, with Leu451 shown as ball and stick structures (magenta). Amino acid residues within 5 ? of the residue of interest are also labeled (cyan). Images were produced using Mol* [145]. Figure created in BioRender.com with permission.

Функциональные различия между вариантами Pro451 и 451Leu P2X7 наблюдаются также в первичных клетках мыши. Индуцированные агонистом потоки Ca²⁺, воздействие фосфатидилсерина, отщепление CD62L и гибель клеток ниже в Т-клетках от мышей C57BL/6 или новозеландских черных мышей (451Leu), чем в Т-клетках от мышей BALB/c или новозеландских белых мышей (Pro451) [136,146]. Аналогичным образом, индуцированное агонистом высвобождение IL-1β снижается в спленоцитах новозеландских черных (451Leu) мышей по сравнению со спленоцитами новозеландских белых (Pro451) мышей [146]. Агонистом индуцированное поглощение красителя снижено в остеокластах мышей C57BL/6 и DBA/2 (451Leu) по сравнению с остеокластами мышей BALB/c и 129X1/SvJ (Pro451) [141]. Однако стимуляция фосфолипазы D, вызванная агонистом, не отличается между тимоцитами мышей BALB/c (Pro451) и C57BL/6 (451Leu), несмотря на меньшую гибель клеток, вызванную агонистом у последних [147]. Различия в активности P2X7, по-видимому, частично связаны с уменьшением количества P2X7, поскольку на клеточной поверхности CD4+ и CD8+ Т-клеток мышей C57BL/6 или FVB/N (451Leu) наблюдалось меньшее количество P2X7 по сравнению с Т-клетками 129 мышей (Pro451) [148]. Примечательно, что в этом же исследовании было обнаружено, что SNP P2rx7Pro451 сохраняется в качестве пассажирской мутации у мышей C57BL/6 с нокаутом по гену P2rx4 (P2rx4 KO), которые были сгенерированы с использованием стволовых клеток, полученных от 129 мышей. Близость генов P2rx4 и P2rx7 делает рекомбинацию при обратном скрещивании очень маловероятной, и поэтому Т-клетки мышей с нокаутом P2rx4 имеют более высокую активность P2X7, чем у мышей дикого типа C57BL/6.

Примечательно, что штаммы мышей, несущие P2X7 451Leu, также имеют фенотипические отличия, включая снижение болевой чувствительности [140], нарушение гомеостаза глюкозы (нарушение толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину) [149] и снижение прочности костей [141]. Кроме того, было показано, что этот SNP уменьшает различия в костном фенотипе между P2rx7KO и мышами дикого типа на генетических фонах 451Leu и Pro451 [150], и была высказана предположение, что пассажирская мутация P2X7 451Leu может частично объяснять костный фенотип у мышей P2rx4 KO [151]. Напротив, исследования нокаутных мышей P2rx7 на обоих фонах выявили ограниченное, но сходное влияние SNP на воспалительные и термогенные функции P2X7 в белых и бурых адипоцитах [152].

Первыми генетически модифицированными P2X7-моделями мышей были обычные P2rx7 KO мыши (табл. 4). Первая такая модель была разработана компанией GlaxoSmithKline и первоначально использовалась для исследований in vitro, продемонстрировав несущественную роль P2X7 в генерации оксида азота в макрофагах [153]. Однако подробное описание получения нокаутной мыши P2rx7(путем вставки кассеты LacZ-неомицина и делеции экзона 1, кодирующего N-концевую часть и часть первого трансмембранного домена) было представлено только в двух последующих работах [154,155]. В одном из этих исследований была установлена роль P2X7 в хронической воспалительной и нейропатической боли in vivo [154], а в другом при сравнении этого штамма и штамма P2rx7 KO компании Pfizer с использованием различных анти-P2X7 антител было показано отсутствие P2X7 в нейронах гиппокампа [155]. Вторая зарегистрированная нокаутная мышь P2rx7 была создана компанией Pfizer (путем введения неомициновой кассеты и делеции экзона 13, кодирующего внутриклеточный С-концевой участок) [156] и впоследствии использована для демонстрации роли P2X7 в развитии воспалительного артрита [157]. Третья мышь с нокаутом P2rx7, разработанная компанией Lexicon Genetics для Abbott Laboratories, показала роль P2X7 в развитии депрессии [158]. Четвертый нокаут P2rx7, созданный в Шанхайском университете с использованием технологии CRISPR/Cas9, показал, что P2X7 защищает от вирусной инфекции [159] и что P2X7 способствует развитию депрессии по мере старения мышей [160]. Кроме того, в Немецком исследовательском центре гигиены окружающей среды с использованием технологии коротких шпилек была создана мышь с частичным нокдауном P2rx7, которая снижала экспрессию мРНК P2rx7 в мозге на 88% [161], однако дальнейшие характеристики не приводились, и, насколько нам известно, эта модель мыши не изучалась далее. Кроме того, с помощью системы Cre/loxP были сгенерированы условно нокаутные мыши P2rx7, которые более подробно описаны ниже. Что касается условно нокаутных мышей P2rx7, то мыши Glaxo и, в частности, Pfizer на сегодняшний день использовались примерно в 400 оригинальных научных статьях. Некоторые из этих исследований включают скрещивание мышей с нокаутом P2rx7 со спонтанными моделями заболеваний. Парадоксально, но некоторые из этих исследований показали неожиданные результаты по сравнению с предыдущими исследованиями с антагонистами P2X7 или моделями индуцируемых заболеваний у мышей с нокаутом P2rx7, например, усиление аутоиммунного артрита у мышей K/BxN [162].

Table 4. Conventional P2rx7gene knockout mouse and rat models.

В целом у мышей с нокаутом P2rx7 не наблюдается грубых дефектов развития, хотя у мышей с нокаутом Pfizer P2rx7, которые являются, пожалуй, наиболее изученным штаммом мышей с нокаутом P2rx7, отмечено несколько фенотипических изменений. Эти изменения включают в себя нарушение развития костей [166], снижение пространственной памяти [167], снижение навязчивого поведения и агрессии [168], усиление пост-фоторецепторных реакций палочкового и колбочкового путей [169], различные изменения белков в строме роговицы [170], признаки ранней возрастной молекулярной дегенерации [171], уменьшение количества звездчатых клеток поджелудочной железы [172], увеличение массы тела и изменение распределения жира у старых мышей [173], повышение концентрации триглицеридов и холестерина с нарушением гомеостаза глюкозы и признаками стеатоза печени [174], а также снижение окисления жирных кислот и энергозатрат всего организма [175]. У других штаммов мышей с нокаутом P2rx7отмечено меньше фенотипических изменений. У мышей GlaxoSmithKline P2rx7KO наблюдается повышенное количество демиелинизированных аксонов седалищных нервов и пучков Ремаке [176]. Снижение обонятельной функции наблюдалось у нокаутных мышей P2rx7Шанхайского университета с повышением обонятельной функции у старых мышей [177]. Наконец, как недавно отмечалось другими авторами [2], на сайте Международного консорциума по фенотипированию мышей (https://www.mousephenotype.org) доступны фенотипы более 8300 различных нокаутных мышей. В настоящее время на этом сайте сообщается, что у нокаутных мышей P2rx7^tm1a(EUCOMM)Wtsi наблюдается снижение концентрации циркулирующего глицерина, а у некоторых нокаутных мышей P2rx7^tm1a(EUCOMM)Wtsi - аномальная морфология хрусталика и раннее развитие катаракты.

В ранних исследованиях сообщалось об отсутствии различий в соотношении зрелых лейкоцитов у нокаутных мышей P2rx7компании Pfizer по сравнению с мышами дикого типа [156,157]. Недавнее, более детальное исследование этих мышей расширило эти результаты, сообщив о сходном количестве зрелых клеток крови и гемопоэтических стволовых и клеток предшественников, но об увеличении количества мегакариоцитов, эритроидных предшественников и предшественников В-клеток в костном мозге мышей с нокаутом P2rx7[178]. В других исследованиях сообщалось об увеличении числа регуляторных Т-клеток в лимфатических узлах [179], γδ тимоцитов [180] и фолликулярных хелперных Т-клеток (Tfh) Пейерова пятна [181], а также о снижении числа γδ Т-клеток в брыжеечных лимфатических узлах [180]. Увеличение количества Tfh-клеток у нокаутных мышей P2rx7было связано с усилением реакций герминального центра и секреции IgA, но снижением продукции IgM [181]. Эти изменения были связаны с уменьшением колонизации слизистой оболочки [181], но обогащением колонизации Lactobacillus [182], что привело к изменению гомеостаза глюкозы и увеличению массы тела [182,183]. Таким образом, учитывая широкую роль микробиома желудочно-кишечного тракта и, возможно, других микробиомов в здоровье и болезни [184], при изучении P2X7 у нокаутных мышей P2rx7следует учитывать изменения в этом микробиоме. Происходят ли изменения в микробиоме также при длительном применении антагонистов P2X7 или биопрепаратов, еще предстоит выяснить.

Несмотря на возможное наличие усеченных вариантов P2X7, лишенных С-концевого хвоста (что еще предстоит продемонстрировать на функциональном уровне) [185], наиболее широко используется P2rx7KO мышь Pfizer P2rx7KO, которая была предоставлена в свободный доступ оригинальными изобретателями [156] и впоследствии через Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Кроме того, в мышах P2rx7KO компании GlaxoSmithKline [35] удалось избежать инактивации гена, что сделало эту мышь сомнительной альтернативой, так как она обладает более высокой чувствительностью к агонистам - P2X7k (длина 592 аминокислотных остатка). В этом сплайс-варианте N-концевой участок и часть первого трансмембранного домена кодируются альтернативным экзоном 1'. Этот вариант оказывается доминантной формой в лимфоцитах и приводит к усилению активности P2X7 в CD4+ и CD8+ Т-клетках по сравнению с Т-клетками от мышей дикого типа, однако P2X7 отсутствует в макрофагах и дендритных клетках от этих нокаутных мышей [42,186,187]. Таким образом, результаты, полученные с использованием нокаутных мышей P2rx7, должны быть тщательно проанализированы на предмет возможного присутствия усеченных форм и подтвержденного отсутствия вариантов P2X7a и P2X7k в различных типах клеток, чтобы избежать возможных ошибок и неверных интерпретаций.

Еще одним моментом при изучении и подсчете клеток у мышей P2rx7KO и дикого типа является возможность смещения отбора при диссоциации тканей. Высвобождение NAD+ и ATP и последующая активация P2X7 на Т-клетках во время диссоциации ткани были задокументированы [188]. Хотя влияния ATP можно в значительной степени избежать, диссоциируя ткани при 4 °C, ADP-рибозилирование P2X7 может происходить и при низких температурах и приводить к активации P2X7 с фенотипическими и функциональными изменениями в Т-клетках при возвращении образцов к 37 °C [188]. Введение этено-NAD или ARTC2-блокирующего нанотела (s+16a) перед жертвоприношением мышей может предотвратить NAD⁺-индуцированную активацию P2X7 и последующие изменения в Т-клетках киллерах [188] или потерю регуляторных Т-клеток, естественных Т-клеток и/или CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти при обработке тканей [189-191]. P2rx7KO мыши также использовались для создания химерных мышиных моделей, в которых кости от P2rx7KO или мышей дикого типа трансплантировались мышам дикого типа или P2rx7KO, соответственно (наряду с соответствующим контролем), чтобы определить вклад P2X7 на гемопоэтических и не-гемопоэтических клетках в физиологию или патологию. Такие исследования позволили выявить роль P2X7 на анти-ген-презентирующих клетках хозяина в развитии GVHD [192], Т-клетках в защите от экспериментального аутоиммунного энцефалита [193] или более широко - на гемопоэтических клетках при аллергическом воспалении дыхательных путей [194], воспалении легких и эмфиземе [195], остром респираторном дистресс-синдроме [196], аффективных расстройствах [197] и опухолевом иммунитете [198]. Подобные исследования также выявили роль P2X7 на не-гемопоэтических клетках, таких как эпителиальные клетки желудочно-кишечного тракта, в рекрутировании дендритных клеток при заражении Toxoplasma и Trichinella [199]. Однако сообщалось и о противоположной роли P2X7 на гемопоэтических [200] и паренхиматозных [201] клетках в развитии ишемически-реперфузионного повреждения почек. Аналогичным образом в двух других исследованиях было показано, что P2X7 защищает от туберкулеза [202], но может также способствовать прогрессированию тяжелой формы туберкулеза [203]. Наконец, была продемонстрирована роль P2X7 как на гемопоэтических клетках, так и на клетках кровеносных сосудов в тканевом фактор-зависимом тромбообразовании [204].

В последнее время с помощью системы Cre/loxP было сгенерировано несколько условно нокаутированных мышей P2rx7. В Европейском архиве мышиных мутантов имеется мышь, сгенерированная путем направленной мутации P2rx7^tm1a(EUCOMM)Wtsi [205], которая при скрещивании с мышами, экспрессирующими флиппазу, приводит к мыши P2rx7^tm1c(EUCOMM)Wtsi или флоксированной мыши P2rx7^fl/fl. В дальнейшем их можно скрещивать с различными линиями cre-драйверов для получения мышей с нокаутом P2rx7по типу клеток или тканей. Сравнение мышей P2rx7^fl/fl с мышами, специфичными для нокаута P2rx7по типу CD4+ T (с CD4-cre), миелоидных клеток (с LySM-Cre) или эпителиальных клеток дыхательных путей (с CCT-cre), выявило роль P2X7 CD4+ T-клеток и миелоидных клеток в развитии острого респираторного дистресс-синдрома [196]. Мыши с нокаутом P2rx7, специфичным для Т-клеток, также позволили установить роль P2X7 на Tfh-клетках в ограничении развития системной красной волчанки [206]. Использование этой системы позволило выявить роль P2X7 в генерации CD8+ тканевых резидентных Т-клеток памяти после заражения вирусным менингитом [207]. Олигодендроциты (с CNP-Cre) или микроглия (с CX3CR1-Cre), специфичные для P2rx7нокаутных мышей, позволили подтвердить присутствие P2X7 в этих типах клеток [71]. При скрещивании P2rx7^fl/fl с мышами LySM-Cre было показано, что малый молекулярный активатор P2X7 HEI3090 действует на макрофаги, способствуя P2X7-опосредованной продукции IL-18 [135]. Хотя система Cre/loxP может предотвратить возможные компенсаторные эффекты и помочь определить клеточные или тканеспецифические эффекты, требуется тщательная характеристика линий cre и соответствующих мышей с нокаутом P2rx7, поскольку может произойти неполная или неожиданная рекомбинация, например, во время развития [208,209].

Недавно была описана модель нокаутных мышей с флоксированным P2rx7(P2rx7^KiKo mice), в которой N-концы вариантов P2X7a и P2X7k были помечены метками Flag-HA-AU1 и Flag-HA-IRS соответственно. Неожиданно оказалось, что мышечный белок P2X7 у этой мыши был удален (ablated) уже в отсутствие рекомбиназы cre. Тем не менее, эта мышь показала роль макрофагального, а не мышечного P2X7 в предотвращении дистрофической минерализации при мышечной дистрофии Дюшенна [210].

К настоящему времени для определения экспрессии и распределения P2X7 были созданы и изучены две трансгенные мыши P2X7. Первая из них, Tg(P2rx7-EGFP)FY174Gsat, была предоставлена Региональным ресурсным центром мутантных мышей Национального института здоровья США и впоследствии проектом GENSAT. В этой мыши под контролем промотора гена P2rx7(www.gensat.org/about.jsp), полученного из бактериальной искусственной хромосомы (BAC), синтезируется растворимый усиленный зеленый флуоресцентный белок (sEGFP), которая здесь названа репортерной мышью sEGFP. Впервые об использовании этой мыши сообщили Engel и коллеги, обнаружив sEGFP, являющийся маркером белка P2X7, в нейронах зубчатых гранул гиппокампа и в меньшей степени в пирамидных нейронах СА1 после длительного припадка (status epilepticus) [211]. Эти наблюдения были подтверждены в последующем исследовании наряду с увеличением количества sEGFP в микроглии [212]. Аналогичным образом, в клетках нейронов неокортекса наблюдалось увеличение количества sEGFP после длительного судорожного припадка [213]. С помощью репортерной мыши sEGFP также удалось показать, что дефицит тканеспецифической щелочной фосфатазы, вызывающий нарушение костной системы и судороги, приводит к снижению количества sEGFP в нейронах зубчатой извилины [214]. В мозге этих мышей при ишемической толерантности было обнаружено увеличение количества sEGFP в астроцитах, но не в микроглии [215]. Количество sEGFP увеличивалось в микроглии при нейровоспалении, индуцированном пептидом амилоида-β или липополисахаридом [216]. Эта репортерная мышь была также использована для дальнейшего изучения роли белкового фактора специфичности Sp1 как медиатора синтеза P2X7 в мозге [217]. В этом исследовании большое количество sEGFP было показано в перитонеальных макрофагах и селезенке и колокализовалось с Sp1 в некоторой степени в коре головного мозга и более четко в вароливом мосту. Наконец, эта репортерная мышь была использована для подробного картирования распределения P2X7 в эмбриональном (E18.5) мозге мыши [218]. Однако вторая трансгенная P2X7-мышь, Tg(RP24-114E20P2X7-StrepHis-EGFP)Ani, поставила под сомнение преимущественно нейрональную локализацию P2X7 в мозге [71]. В этой линии мышей слитый белок P2X7, усиленный зеленым флуоресцентным белком (EGFP), избыточно экспрессируется под контролем промотора гена P2rx7, полученного из BAC [71]. В дальнейшем эта модель получила название P2X7-EGFP reporter mouse. Работоспособность конструкции была подтверждена на так называемой спасательной мыши, в которой P2X7-EGFP скрещивали с P2rx7KO мышью. Сравнение сигнала EGFP с эндогенным P2X7 в диком типе (окрашенным P2X7-специфической нанотемой) выявило идентичный характер распределения. Дальнейший детальный анализ мозга этих мышей выявил P2X7-EGFP в микроглии, глии Бергмана и олигодендроцитах, но не в нейронах. Аналогичным образом, исследование локализации P2X7-EGFP в миэнтерическом сплетении дистального отдела толстой кишки выявило его присутствие в макрофагах и энтеральной глии, но не в нейронах [72]. Примечательно, что сама по себе избыточная экспрессия P2X7-EGFP не приводила к явной патологии или поведенческим изменениям в этих исследованиях в нормальных условиях (при отсутствии индуцированных заболеваний). После длительных судорог P2X7-EGFP также наблюдался преимущественно в микроглии и олигодендроцитах, но не в нейронах или астроцитах [219], а у мышей наблюдалось повышенное количество P2X7 в моноцитах периферической крови [68]. Интересно, что репортерные P2X7-EGFP мыши демонстрируют повышенную восприимчивость к фенциклидин-индуцированной шизофрении [220], сниженную чувствительность к противоэпилептическим препаратам [221] и больший размер инсульта после временной окклюзии средней мозговой артерии [74].

Прямое сравнение sEGFP и P2X7-EGFP мышей с помощью гибридизации in situ, иммуногистохимии и проточного цитометрического анализа подтвердило различное распределение EGFP в клетках: четкая локализация в нейронах у sEGFP мышей и локализация в микроглии и олигодендроцитах у P2X7-EGFP мышей. Помимо микроглии, уровень sEGFP был непостоянным или отсутствовал в других типах клеток, для которых присутствие P2X7 хорошо описано, таких как макрофаги, тучные клетки и CD4+ Т-клетки [222]. Однако распределение sEGFP и P2X7-EGFP было сопоставимо в сателлитных глиальных клетках и клетках Шванна в спиральном ганглии улитки [223]. Что касается причин аберрантного клеточного распределения репортера sEGFP, то обсуждалось нарушение важных регуляторных элементов [222]. Кроме того, в данном исследовании было показано, что sEGFP-мышь также избыточно экспрессирует BAC-производные P2X7 и (в отличие от P2X7-EGFP-мыши) P2X4.

Термин "гуманизированные мыши" относится либо к мышам, экспрессирующим специфические генные продукты человека (часто вместо мышиного ортолога), либо к приживлению человеческих клеток мышам (как правило, с ослабленным иммунитетом) [224]. В первом случае были описаны две гуманизированные линии мышей P2X7, названные P2rx7^{tm1.1(P2RX7)Jde} и P2rx7^{tm2.1(P2RX7*)Jde} [225]. В этих линиях экзон 2 гена P2rx7был заменен на комплементарную ДНК P2rx7человека, кодирующую экзоны 2-13, для экспрессии преимущественно (за исключением экзона 1) человеческого P2X7 под контролем мышиного промотора P2rx7[226]. Мышь P2rx7^{tm1.1(P2RX7)Jde} была определена как штамм дикого типа, а мышь P2rx7^{tm2.1(P2RX7*)Jde} кодировала SNP Gln460Arg человека [227], который был связан с депрессией и тревогой у людей [228,229]. Сравнение двух гомозиготных линий мышей и гетерозиготной комбинации выявило нарушения сна у мышей, гетерозиготных по SNP Gln460Arg [227], что указывает на повышенный риск развития аффективных расстройств у людей, гетерозиготных по этому SNP [230]. В совокупности эти исследования создают концептуальную основу для создания новых гуманизированных линий мышей для изучения других SNP P2rx7человека, некоторые из которых были связаны с такими состояниями, как воспалительные и костные заболевания, инфекционные болезни и рак [231,232]. Более того, фланкирование вставленной последовательности сайтами loxP в мышиной линии P2rx7^{tm1.1(P2RX7)Jde} позволило получить конститутивную и условную делецию P2X7 при скрещивании с Cre-экспрессирующими линиями мышей [226]. У этих нокаутных по всему телу мышей отсутствовали функциональные варианты ускользания (escape), а исследования клеточно-специфических нокаутных мышей P2rx7выявили экспрессию мРНК P2rx7в глутаматергических пирамидальных нейронах гиппокампа, а также в астроцитах, олигодендроцитах и микроглии коры, гиппокампа и мозжечка [226].

Для изучения P2X7 при различных видах рака, включая лейкемию, а также при GVHD, как будет показано ниже, в основном использовались гуманизированные мыши, полученные путем приживления человеческих клеток (обычно) мышам с ослабленным иммунитетом (модели ксенотрансплантации). Применительно к раку эти модели обычно включают приживление раковых клеток человека в организме мышей с ослабленным иммунитетом [233]. Такие модели дают возможность изучать P2X7, включая варианты P2X7, в P2X7-трансфицированных клетках HEK-293 [233] или лейкозных [234,235]. Исследование ксено-трансплантационных моделей в сочетании с ATP или BzATP и/или антагонистами P2X7 выявило роль P2X7 в пролиферации колоректальных [236,237] и панкреатических [238,239] раковых клеток, а также в инвазии и миграции клеток колоректального рака [237]. На некоторых ксено-трансплантационных моделях было обнаружено, что P2X7 может способствовать прогрессированию острого миелоидного лейкоза [235,240], в то время как в других исследованиях он опосредует апоптоз и предотвращает прогрессирование заболевания [234,241]. Различия в роли P2X7 при лейкозах могут объясняться относительной долей про-апоптотических и про-пролиферативных изоформ P2X7A и P2X7B соответственно [240]. Аналогичным образом получены данные о том, что активация P2X7 индуцирует гибель клеток и предотвращает рост раковых клеток молочной железы человека [242,243] и уротелия мочевого пузыря [244] у мышей. В совокупности эти исследования подчеркивают сложную роль P2X7 в раке, обусловленную опухолями, в дополнение к противоопухолевой роли P2X7 на иммунных клетках [245].

Что касается GVHD, то введение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) человека необлученным мышам NOD.Cg-Prkd^cscidIL2rg^tm1Wjl (NSG), далее называемым Hu-PBMC-NSG, приводит к развитию летальной GVHD в течение 10 недель [246]. Исследования на этой ксено-трансплантационной модели показали, что экспрессия мРНК P2rx7повышается во время GVHD [247] и что ее блокада с помощью BBG может уменьшить гистологические и клинические признаки заболевания и увеличить количество регуляторных Т-клеток человека [129], что подтверждает роль P2X7 в этом заболевании [248]. Эта модель также позволила привить мышам NSG PBMCs от здоровых доноров, кодирующих SNPs P2rx7с потерей или усилением функции [249], однако сравнение небольшого числа доноров и генотипов не выявило различий между двумя группами, что позволяет предположить, что генотип P2rx7донора не влияет на развитие GVHD. Эти данные согласуются с наблюдениями у людей после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [250]. Тем не менее, мыши Hu-PBMC-NSG предоставляют новые возможности для изучения других P2X7-опосредованных иммунных клеточных реакций человека in vivo, включая краткосрочные эксперименты, предшествующие развитию GVHD.

Крысы (Rattus norvegicus) использовались в качестве доклинических моделей для изучения P2X7, хотя и реже, чем мыши [54]. Что касается мышиных моделей, то обзор всех опубликованных на сегодняшний день исследований не входит в рамки данной статьи. Однако ниже приведены некоторые основные наблюдения.

Все субъединицы P2X первоначально были клонированы от крыс [81], и использование крысиных моделей значительно продвинуло ранние исследования P2X7. В этих исследованиях были детально изучены фармакокинетические профили специфических антагонистов P2X7 A-740003 или A-438079, которые, как сообщалось, уменьшали нейропатическую и воспалительную боль в различных экспериментальных моделях [251,252]. В совокупности эти исследования расширили область изучения P2X7 и позволили провести фармакокинетическое профилирование и клиническую оценку новых антагонистов P2X7 на крысах во все большем числе работ. Аналогичным образом на крысах были проведены фармакокинетическое профилирование и клиническая оценка CE-224,535 (раздел 2.3), JNJ-42253432 [253], JNJ-54166060 [254] и Lu AF27139 [255]. Таким образом, учитывая столь подробную характеристику, крысы могут служить лучшей основой для разработки будущих доклинических исследований P2X7. Однако эти исследования могут быть ограничены более крупными размерами крыс и соответствующим увеличением расходов по сравнению с мышами, а также тем, что некоторые, возможно, большинство из этих хорошо охарактеризованных соединений могут быть недоступны для всех исследователей из-за их клинического потенциала и тестирования на людях. Более поздние исследования с использованием локальной доставки малой интерферирующей РНК для подавления P2X7 у крыс выявили роль этого рецептора в диабетической нейропатии [256-258], эпилепсии [259] и внутримозговом кровоизлиянии [260]. Это дает альтернативу использованию ингибиторов малых молекул для исследования P2X7 in vivo. Следует отметить, что острый стресс (иммобилизация в течение 1 ч) потенциально может приводить к высвобождению ATP и последующей активации P2X7-воспалительного пути, вызывая высвобождение IL-1β у крыс [261]. Хотя данное исследование было частью более крупного исследования, изучавшего роль P2X7 в психологическом стрессе, оно подчеркивает возможное влияние внеклеточного ATP и P2X7 в моделях животных, где используются процедуры сдерживания (restraint).

Как и в случае с мышами, при рассмотрении крыс в качестве модели P2X7 следует отметить, что количество или активность этого рецептора также может варьировать между штаммами крыс или даже внутри них. Например, как экспрессия мРНК P2rx7, так и количество P2X7 больше в макрофагах крыс Wistar Kyota (WKY/NCrl) по сравнению с макрофагами крыс Lewis (LEW/CRL) [262]. Точная причина такого различия остается неизвестной, однако секвенирование генов показало, что это различие не связано с несинонимичной мутацией, а, скорее всего, обусловлено делециями или инсерциями в промоторной области гена P2rx7или в других местах генома [262]. В другом примере, при сравнении нокаутных крыс Sprague-Dawley Uox (uricase) с острым подагрическим артритом и крыс без этого заболевания, был выявлен мутировавший локус (1016) в 5' нетранслируемой области гена P2rx7, который ассоциировался с развитием подагры [263]. Это позволяет предположить, что варианты гена P2rx7существуют у крыс одного происхождения, что еще больше усложняет исследования крыс, по крайней мере, этой линии. Хотя для подтверждения этих результатов необходимы дальнейшие исследования, ученые должны учитывать возможные различия в P2X7 крыс в будущих исследованиях.

В последние годы несколько P2rx7KO линий крыс к стали доступны (табл. 4). CRISPR/Cas9 был использован для глобального удаления гена P2rx7у крыс PCK/CrljCrl-Pkhd1pck/Crl (PCK), полученных от крыс породы Sprague-Dawley с мутацией в локусе Pck и служащих моделью наследственной поликистозной болезни почек [163]. У крыс с этой делецией, по сравнению с крысами PCK дикого типа, нарушено развитие почечных кист и выделение ATP с мочой, причем последнее соответствует снижению количества почечного белка паннексина-1. Для глобального удаления гена P2rx7у крыс Вистар Киота была использована технология нуклеазы цинковых пальцев, хотя нельзя было исключить наличие вариантов проникновения в мозг [164]. Такая делеция не защищала крыс от нефротоксического нефрита, гломерулонефрита или аутоиммунного нефрита, это указывает на то, что P2X7 не является необходимым для развития этих заболеваний. Следует отметить, что препарат A-438079 защищал от нефротоксического нефрита как крыс с нокаутом P2rx7, так и крыс дикого типа, что указывает на вне-целевое действие этого антагониста P2X7 и подчеркивает потенциальную полезность животных с нокаутом P2rx7для изучения специфичности антагонистов P2X7. Наконец, в опубликованном тезисе конференции сообщается об использовании CRISPR/Cas9 для глобального удаления гена P2rx7у крыс F344/OciCrl, что приводит к нарушению эндотелий-зависимой вазодилатации у самцов, но не у самок крыс [165].

Несмотря на клонирование P2X7 у морской свинки (Cavia porcellus) [99] и первые исследования, в которых сообщалось о белке P2X7 и его функциональной экспрессии в энтеральной нервной системе тонкого кишечника [264] и белке P2X7 в гладких мышцах семявыносящего протока и эпителии мочевого пузыря [265] морских свинок, этот вид использовался для изучения P2X7 нечасто. Более поздние исследования на морских свинках показали наличие функционального P2X7 в миентериальных нейронах кишечника [266], экспрессию мРНК P2rx7в мочевом пузыре [267] и повышение регуляции P2X7 в лейкоцитах периферической крови в модели сенсибилизации аллергеном (овальбумином) [268]. Основным объектом изучения P2X7 у морской свинки является улитка. Сообщалось о низком количестве белка P2X7 в наружных волосковых клетках улитки [269,270], но о незначительном изменении количества этого белка в ответ на шум [271]. В другом исследовании роль P2X7 в слуховой нейротрансмиссии у морских свинок была отвергнута [272]; однако активность P2X7 в этом исследовании изучалась только с использованием BzATP, который, как было показано впоследствии, не активирует рекомбинантный P2X7 морской свинки [99]. Согласно исследованиям, проведенным на других видах животных, P2X7 может участвовать в глией опосредованных воспалительных процессах и при определенных условиях способствовать развитию слуховой нейропатии и потере слуха [273].

Как и у морских свинок, P2X7 изучался у кроликов (Oryctolagus cuniculus domesticus) в небольшом количестве ранних исследований, в самом раннем из которых сообщалось о минимальном количестве белка P2X7 в эндотелии аорты нормальных кроликов без изменения его количества после повреждения баллоном in vivo [274]. В другом раннем исследовании сообщалось о наличии функциональных P2X7-подобных реакций в реснитчатых клетках дыхательных путей кролика, однако подтвердить присутствие этого белка в этих клетках не удалось [275]. Также сообщалось, что активация P2X7 опосредует потоки Ca²⁺ [276] или стимулирует NF-κB [277] в остеокластах кролика, а также высвобождение простагландина E2 и гибель клеток в суставных хондроцитах кролика [278], однако роль этого рецептора в физиологии и патофизиологии костей у кроликов in vivo еще не установлена в отличие от мышей и человека [4]. Белок P2X7, как и P2X1-P2X5, повышен в мочевых пузырях кроликов при ишемии [279].

Другие исследования позволили предположить роль активности P2X7 у кроликов in vivo. Предполагаемый антагонист P2X7 бриллиантовый синий FCF может уменьшать утолщение интимы после приживления вены у кроликов [280], что позволяет предположить роль активации P2X7 в этом процессе. Однако другие исследователи показали, что это соединение нарушает работу мышиного паннексина-1, но, в отличие от BBG [110], не человеческого P2X7 [281], это ставит под сомнение полученные ранее результаты на кроликах. Это также подчеркивает важность исследований рекомбинантных рецепторов для определения видоспецифических фармакологических свойств с целью интерпретации данных, полученных в исследованиях in vitro и in vivo. Белок P2X7 был обнаружен в сетчатке здоровых кроликов, а в сетчатке кроликов с диабетом он распространялся на наружный слой и некоторые мелкие кровеносные сосуды [282]. В этом исследовании BzATP преимущественно снижал скорость кровотока в сетчатке у диабетиков по сравнению со здоровыми кроликами, и этот процесс блокировался антагонистом P2X7 - окисленным ATP [283]. В дальнейших исследованиях, касающихся глаза, сообщалось, что активация P2X7 опосредует бензалкония хлорид (консервант глазных капель) - индуцированную цитотоксичность [284] и додецил натрия - индуцированную цитотоксичность [285] в клетках роговицы кролика и человека. Кроме того, в последнем исследовании было показано, что высокомолекулярный гиалуронан может предотвратить этот процесс in vitro в клетках роговицы человека и in vivo у кроликов, однако прямых доказательств действия P2X7 в этом процессе in vivo не исследовалось.

Несмотря на все более широкое использование не-человекообразных приматов для изучения антагонистов P2X7 и радиомеченых лигандов в доклинических исследованиях (см. раздел 2.3), об изучении P2X7 непосредственно у этих животных сообщалось мало. Белок P2X7 был обнаружен во внутреннем ядерном, внутреннем плексиформном и ганглиозном клеточных слоях, но не в глии, сетчатки макак-резусов (Macaca mulatta) [286]. В то же время экспрессия мРНК P2rx7отмечена в макрофагах и микроглии, полученных из костного мозга этих животных [287]. Наряду с исследованиями рекомбинантного P2X7 макак-резусов [96], доказательством функционирования P2X7 у макак-резусов служат исследования высвобождения IL-1β, причем ATP-индуцированное высвобождение этого цитокина из макрофагов костного мозга и микроглии полностью и частично опосредовано активацией P2X7 соответственно [287].

После мышей и крыс собаки (Canis lupus familiaris) являются, пожалуй, наиболее изученными животными в отношении P2X7. Присутствие P2X7 у собак недавно было подробно рассмотрено [288]. Помимо подробного описания рекомбинантного P2X7 и полиморфных вариантов собачьего P2X7, в данной статье представлен полный обзор молекулярной и функциональной экспрессии P2X7 в клетках и тканях собак: P2X7 обнаружен в эритроцитах, Т- и В-клетках, моноцитах и макрофагах, а также в стволовых клетках жировой ткани, клетках почек, клетках нервной системы, включая раковые клетки мозга, и, возможно, в нейронах брыжеечного сплетения. Кроме того, в данной статье представлен полный обзор опубликованных исследований, посвященных фармакокинетике и безопасности антагонистов P2X7 у собак. Однако, кроме этих доклинических исследований, об изучении P2X7 у собак in vivo ничего не сообщалось.

Как и у морских свинок, кроликов и макак-резусов, в небольшом количестве исследований сообщалось о наличии P2X7 у кошек (Felis catus). Белок P2X7 обнаружен в эндотелии и мышечных клетках, но не в субэпителиальных нейронах мочевого пузыря кошек [289]. Напротив, белок P2X7 обнаружен в нейронах интрамурального ганглия мочевого пузыря [290] и дорсального корешкового ганглия верхней части крестца [291] у кошек. Однако в этих трех исследованиях, проведенных одной группой, использовалось одно и то же анти-P2X7 антитело (Roche, Palo Alto, CA, USA); таким образом, для подтверждения наличия P2X7, включая функциональные рецепторы, у кошки необходимы дополнительные исследования. Следует отметить, что с помощью анти-P2X7 антител, которые распознает нефункциональные P2X7 [292], было выявлено наличие таких рецепторов в нерезектабельной плоскоклеточной карциноме носа у кошки, а лечение этим антителом привело к полному разрешению этого поражения [293]. Впоследствии аналогичное антитело (BIL010t) было протестировано в клинических испытаниях фазы 1 при базально-клеточной карциноме человека, при этом частичный ответ наблюдался у 65% пациентов [294]. Однако о дальнейших клинических испытаниях этого биологического препарата не сообщалось, несмотря на разработку полностью гуманизированного одноцепочечного антитела (BIL03s) и мышиного mAb (BPM09) [295].

Рыбки данио (Danio rerio) являются распространенной экспериментальной моделью, используемой во многих контекстах, включая пуринергическую сигнализацию [296], и в ряде работ сообщается об использовании этих животных для изучения P2X7 in vivo (табл. 5). Одним из возможных предостережений при использовании рыбок данио в качестве модели для изучения этого рецептора является то, что рыбки данио P2X3 демонстрирует агонистический профиль, подобный таковому у P2X7 млекопитающих [297]. Прямое сравнение профилей агонистов и антагонистов P2X7 и P2X3 рыбок данио может помочь устранить это потенциальное ограничение.

На сегодняшний день наиболее распространенными исследованиями P2X7 у рыбок данио являются ксено-трансплантационные модели рака молочной железы человека. Используя клетки MDA-MB-435s, экспрессирующие мРНК P2rx7, и антагонист P2X7 A-438079, в первом из этих исследований была установлена роль P2X7 в инвазивности рака как модели метастазирования [298]. В отличие от этого, инвазивность клеток рака пищевода человека EO33, которые не экспрессировали мРНК P2rx7, в данном исследовании не ухудшалась под действием A-438079. Впоследствии эта группа подтвердила роль P2X7 в этом процессе: новый антагонист P2X7, anthraquinone emodin, снижал инвазивность P2X7-позитивных клеток MDA-MB-435s, но не P2X7-негативных клеток рака молочной железы человека MDA-MB-468 [299]. Данное исследование подчеркивает возможность использования рыбок данио в качестве дополнительной модели in vivo при создании и тестировании новых антагонистов P2X7. С этой целью другие исследователи использовали рыбок данио для демонстрации способности четырех новых антагонистов P2X7 на основе 1-piperidinylmidazole снижать инвазивность клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 [44].

В других исследованиях для установления роли P2X7 в таких заболеваниях, как поликистоз почек [300], судороги [301] и воспаление при повреждении тканей [302], использовались рыбки данио и антагонисты P2X7 или методы нокдауна гена p2rx7. В отличие от этого, использование A-740003 не позволило установить роль активации P2X7 в CuS04-индуцированном воспалении у этого вида, несмотря на то, что пробенецид нарушал этот процесс и указывал на потенциальную роль паннексина-1 в этой модели воспаления [303]. Аналогичным образом, использование этих же двух соединений выявило роль паннексина-1, но не P2X7, в модели боли у рыбок данио [304]. В другом исследовании сообщалось, что уменьшение печеночного стаза под действием растительного флаванола кверцетина было связано со снижением экспрессии мРНК P2rx7, что косвенно указывает на роль P2X7 в этом расстройстве [305]. Для оценки роли P2X7 в токсичности также использовали рыбок данио. Токсичность тяжелых металлов (HgCl2) снижала экспрессию мРНК P2rx7у рыбок данио, а совместное введение HgCl2 и ATP, но не каждого соединения в отдельности, снижало выживаемость, причем эффект комбинированного лечения предотвращался препаратом A-740003 [306].

Table 5. Study of P2X7 in zebrafish models.

В отличие от роли P2X7 в развитии различных заболеваний, аутокринная активация P2X7, как было показано, играет защитную роль в модели дегенерации сетчатки у рыбок данио, при этом A-740003 ухудшает фототоксичность, вызванную CoCl2 [307]. Ухудшение дегенерации сетчатки было связано с усилением пролиферации клеток Muller и активацией микроглии. В этом же исследовании введение BzATP в неповрежденную сетчатку также вызывало повреждение фоторецепторов и пролиферацию клеток Мюллера, которые можно было предотвратить совместным введением A-740003, что свидетельствует о противоположной роли P2X7 в фототоксичности.

Рыбки данио также можно использовать для скрининга библиотек соединений с целью поиска новых модуляторов P2X7. Исходя из установленной роли P2X7 в развитии туберкулеза у людей [309], на модели туберкулеза у рыбок данио было проверено 1200 одобренных препаратов, что привело к идентификации клинически одобренного антигистаминного клемастина в качестве положительного модулятора P2X7 [308]. Несмотря на то, что ранее в результате анализа библиотеки препаратов in vitro это соединение было идентифицировано как положительный модулятор P2X7 человека и мыши [310], это более позднее исследование позволило использовать рыбок данио для поиска модуляторов P2X7 [308]. Более того, в этом исследовании было установлено использование нокаута P2rx7и других трансгенных рыбок данио для подтверждения того, что анти-мико-бактериальная активность клемастина обусловлена активностью P2X7 на макрофагах. В соответствии с наличием P2X7 на макрофагах рыбок данио, изолированные целомических клетки рыбок данио, включающие представителей клеток периферической крови, макрофагов и клеток костного мозга, обладают функциональными рецепторами, что оценивается по ATP-индуцированному поглощению красителя, которое может быть заблокировано окисленным ATP, KN-62 или BBG [311].

Помимо рыбок данио, P2X7 исследовался и у других видов рыб. Первоначально P2X7 был клонирован и изучен у морского окуня, где было показано, что он индуцирует гибель клеток, но не созревание или высвобождение IL-1β в лейкоцитах [312]. Впоследствии было показано, что активация P2X7 не способна стимулировать активность капсазы-1 в этих клетках [313]. Напротив, BzATP или ATP, соответственно, вызывали активность каспазы-1 [313], воздействие фосфатидилсерина, отщепление микровезикул, а также созревание и высвобождение IL-1 [312] в клеточной линии фибробластов морского окуня SAF-1.

мРНК P2rx7присутствует в макрофагах, а также в селезенке, головной почке, жабрах, печени, мышцах, кишечнике и сердце сладкоперых рыб айю (Plecoglossus altivelis) [314]. В этом исследовании также сообщалось, что белок P2X7 присутствует в макрофагах рыб ayu (Plecoglossus altivelis) и что активация этого рецептора в этих клетках может вызывать гибель клеток, а также фагоцитоз и уничтожение бактерии Vibrio anguillarum. Кроме того, в данной работе была определена комплементарная последовательность ДНК рецептора ayu P2X7, предсказывающая наличие белка длиной 574 аминокислотных участка, и использована для получения рекомбинантного фрагмента эктодомена, который затем был использован для получения антител (aEPAb), способных распознавать белок P2X7 и блокировать активность P2X7 в макрофагах. Последующее исследование с использованием макрофагов ayu показало, что эндогенный антимикробный пептид cathelicidin индуцирует хемотаксис, синтез транскриптов мРНК, кодирующих IL-1β, IL-10 и фактор некроза опухоли, окислительный взрыв, фагоцитоз и гибель V. anguillarum P2X7-зависимым образом [315], что подтверждает взаимодействие между антимикробными пептидами и P2X7, наблюдаемое у мышей и людей при других видах инфекции [316].

Как и в случае с ayu, в другом исследовании было проведено клонирование P2X7 радужной форели (Oncorhynchus mykiss), предсказано, что длина белка составляет 551 аминокислоту, а транскрипты мРНК P2rx7обнаружены в В-клетках этой рыбы [317]. Это исследование также показало, что cathelicidins CATH-1a и CATH-2a могут индуцировать образование реактивных форм кислорода и способствуют гибели кишечной палочки в лимфоцитах форели, причем авторы постулировали роль P2X7 в этом процессе.

Исследование японской камбалы (Paralichthys olivaceus) показало высокую экспрессию мРНК P2rx7в hepatopancreas, промежуточную экспрессию в крови, мозге, гонадах, сердце, кишечнике, мышцах и коже и ограниченную - в жабрах, почках головы и туловища, селезенке [101]. Помимо получения функционального рекомбинантного рецептора, в данной работе и в другой [318] сообщалось, что активация P2X7 может способствовать синтезу транскриптов мРНК, кодирующих IL-1β и IL-6, в макрофагах японской камбалы. Кроме того, ATP индуцировала транскрипт мРНК, кодирующий каспазу-1, и активность каспазы-1 в макрофагах и лимфоцитах этого вида [319], однако прямые доказательства участия P2X7 в этих процессах отсутствовали. Аналогичным образом, этот же подход показал, что ATP может индуцировать транскрипты мРНК, кодирующие каспазы-2, -3, -6 и -8, и активность этих каспаз в тех же типах клеток [320]. Примечательно, что CD39 может ограничивать ATP-индуцированные реакции у японской камбалы [321], что согласуется с известными наблюдениями у грызунов и человека [322]. Было показано, что внеклеточный ATP вызывает и другие иммуномодулирующие эффекты: транскрипцию генов цитокинов, а также продукцию реактивных видов азота и кислорода в клетках японской камбалы, однако прямые доказательства участия P2X7 в каждом из этих ответов отсутствуют [323]. Наконец, исследования по совместной трансфекции показали, что связанная с апоптозом серин/треониновая киназа 17А усиливает P2X7-опосредованный апоптоз клеток японской камбалы FG-9307 [324].

Исследования различных видов животных, в частности мышей и крыс, значительно продвинули изучение P2X7, что позволило установить многочисленные физиологические и патофизиологические роли этого рецептора в здоровье и болезни человека. Использование животных способствовало созданию антител, нанотел, рекомбинантных рецепторов и радиолигандов для изучения P2X7, что позволило охарактеризовать фармакологические профили, выявить клеточное и тканевое распределение и определить функциональные роли этого рецептора. Использование нескольких видов животных способствовало также фармакокинетическому тестированию антагонистов P2X7, что привело к клиническим испытаниям препаратов, направленных на P2X7, на людях. Создание трансгенных моделей мышей, включая P2rx7KO и репортерных мышей, гуманизированных P2X7-мышей, а также P2rx7KO-крыс предоставляет инновационные инструменты, которые будут и в дальнейшем способствовать изучению этого рецептора. В то же время ограниченное число исследований на морских свинках, кроликах, макаках-резусах, собаках, кошках, рыбках данио и других видах рыб открывает возможности для дальнейшего определения роли P2X7 в здоровье и болезни. В конечном итоге изучение P2X7 приведет к получению новых знаний, которые могут быть использованы для улучшения здоровья и благополучия как людей, так и других видов животных.