«В настоящее время неизвестно, происходит ли эволюция новых морфологических признаков в основном за счет модификации ранее существовавших цис-регуляторных элементов или за счет генерации новых элементов...» [25].

Люди давно заинтересованы в изучении генетических мутаций, которые лежат в основе признаков, уникальных для нашего вида. Например, была проделана большая работа по пониманию относительного вклада изменений, кодирующих белок, в регуляцию генов ^{34, 8, 9, 71, 19, 64}, а также того, сколько таких регуляторных мутаций действуют в цис- или транс положении ^{61, 1, 27-}. Однако до сих пор не было уделено особого внимания пониманию относительного вклада в регуляторные изменения генов, характерные для человека, как от модификации существующих регуляторных элементов, так и от создания новых элементов, уникальных для человека. Хотя исторически эта область была сосредоточена на первом варианте ^{47, 43, 7, 4, 14, 24, 73-, 38, 69}, ряд недавних работ показал, что создание новых регуляторных элементов имеет важное значение и более благоприятно для эволюции, чем считалось ранее ^{42-, 72-, 41-}.

С тех пор как в 2005 году был опубликован геном шимпанзе, в этой области был достигнут значительный прогресс в каталогизации генетических изменений, которые отделяют человека от других человекообразных обезьян [11]. Однако эффективно связать эти генетические изменения с конкретными человеческими признаками оказалось непросто ^{8, 66}. Эта сложность возникает из-за того, что в родословной человека имеются десятки миллионов мутаций, большинство из которых нейтральны или почти нейтральны и не оказывают существенного влияния на фенотип. Это представляет собой пресловутую проблему «иголки в стоге сена» при выявлении мутаций, существенно повлиявших на фенотип [66].

Давно существует гипотеза о том, что изменения в регуляции генов внесли значительный вклад в формирование уникальных человеческих черт ^{34, 8, 9, 71, 19, 64}. Однако в то время проверка этого предположения была затруднена из-за неэффективности идентификации регуляторных последовательностей генов и определения того, имеют ли специфические для человека изменения в них функциональные последствия [8]. В первых публикациях были выявлены специфические для человека изменения в промоторных областях. Это привело к интересным открытиям в области регуляции отдельных генов ^{54, 26}, а также групп генов, вовлеченных в определенные биологические функции, такие как метаболизм глюкозы и нейрогенез [28].

Озарение, позволившее включить дистальные регуляторные регионы, заключалось в выявлении специфических для человека мутаций в консервативных в другом отношении регионах ^{46, 47}. Использовать межвидовую консервацию было очень разумно, поскольку методы обнаружения регуляторных элементов в масштабах всего генома через открытый хроматин, эпигенетические модификации или связывание белков находились в зачаточном состоянии или еще не существовали ^{29, 44, 5}. Пилотная работа проекта Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE), изучающая всего 1 % генома, была опубликована в следующем году [16]. Первоначальное исследование, описывающее эти в остальном консервативные регионы со значительной дивергенцией по линии человека, назвало их ускоренными регионами человека (HARs) ^{46, 47}. За этим первоначальным скринингом последовал ряд дополнительных исследований, которые расширили наше понимание регуляции генов, специфичных для человека, за счет изменений в консервативных элементах ^{49, 3, 4}, включая делеции [43]. Это семейство скринингов, благодаря их ограничению предковыми консервативными регионами, представляет ранее существовавшие генные регуляторные элементы, которые были значительно изменены в человеческом роду. Элементы, идентифицированные в этих сравнительных геномных скринингах, были в центре внимания функциональных экспериментов, начиная с генетических изменений и заканчивая генными регуляторами и фенотипами на тканевом уровне ^{7, 14, 24, 73-, 38, 69}. В отличие от этого, экспериментальный анализ для понимания вклада новых генных регуляторных элементов в развитие специфических для человека признаков был ограничен. Это открывает возможность для изучения роли новых регуляторных элементов в эволюции человека, поскольку недавние исследования указывают на их потенциальную значимость ^{42-, 72-, 41-}.

Исследователи предлагали различные определения биологической новизны, и эта тема продолжает активно изучаться. Выработка универсального определения сопряжена с определенными трудностями, поскольку зачастую оно должно быть адаптировано к перспективе и конкретной шкале задаваемого вопроса ^{13-, 40-}. Например, новый морфологический признак ранее определялся как структура, которая не показывает гомологии с какими-либо предковыми структурами или другими структурами в том же организме [40]. Однако черты, которые кажутся новыми на уровне морфологии целого организма, могут быть гомологичны предковым состояниям, если рассматривать их на уровне типов клеток или паттернов экспрессии генов развития ^{57, 68}. Это делает важным рассмотрение масштаба, на котором мы хотим исследовать новизну, то есть отдельно рассматривать новизну вовлеченных типов клеток и новизну вовлеченных морфологических структур. В то время как большая часть работ по изучению новизны была сосредоточена на масштабах от белок-кодирующих генов до морфологии организма, меньше внимания уделялось определению новизны на уровне регуляторных элементов генов.

Исторически сложилось так, что регуляторные элементы описывались как новые в различных контекстах. К ним относятся элементы, которые были либо недавно обнаружены, либо отвечали за экспрессию в клетках или тканях, не имевших предкового паттерна экспрессии. Хотя этот возникший паттерн экспрессии может быть обусловлен новым функциональным регуляторным элементом, он также может быть вызван мутациями в существующем регуляторном элементе или коопсией существующих регуляторных последовательностей, таких как транспозируемые элементы. Новизну в экспрессионной активности часто объединяли с потенциальной новизной регуляторного элемента. То есть, если изменение регуляторного элемента приводит к появлению новой функции, то регуляторный элемент иногда описывался как новый. Это свидетельствует об отсутствии четких и последовательных критериев для определения новизны генного регуляторного элемента, что затрудняет понимание относительного вклада новых регуляторных элементов в уникальные человеческие черты.

В поисках понимания того, что представляет собой биологическая новизна, в предыдущих работах утверждалось, что необходимо проводить различие между новыми структурами и новыми функциями [68]. В масштабах генных регуляторных элементов в эволюционной и функциональной геномике мы понимаем под «структурой» последовательность ДНК элемента, а под «функцией» - регуляторную активность элемента. Хотя они часто тесно связаны между собой, новые функции могут возникать без наличия новых структур, и наоборот ^{68, 70}. Здесь мы сосредоточимся на масштабах структуры регуляторных элементов, используя термин «новизна» для регуляторных элементов, полученных из ДНК без предковой активности, и «инновация» для регуляторных элементов, полученных из ДНК с предковой активностью. Предковые и производные состояния будут определяться в контексте анализируемой ветви.

Для дальнейшего решения неоднозначной проблемы новизны в идентификации генных регуляторных элементов мы представляем схему классификации новизны и инноваций для генных регуляторных элементов (рис. 1, рис. 2). Формулировка классификационной схемы с набором определений позволит в будущем решить несколько задач: (1) создать специальные экраны для непосредственного обнаружения и проверки новых регуляторных элементов, (2) оценить существующие исследования эволюции регуляторных элементов в рамках классификационной схемы определений (рис. 1 и 2) и (3) облегчить понимание различий в регуляторной эволюции между человеком и другими видами на древе жизни. В целом, последовательная система классификации эволюции регуляторных элементов генов улучшит наше понимание эволюции видоспецифических признаков.



Figure 1. Classification of regulatory element novelties. (a) Novel regulatory elements. These regulatory elements are forged from DNA not functioning in a regulatory capacity in the ancestral state. (b) Examples of mutational mechanisms that can lead to the emergence of novel regulatory elements are point mutations (left) and short indel mutations (right).

Figure 2 Classification of regulatory element innovations. (a) (left to right) There are three other ways that gene regulation can be innovative without the forging of novel regulatory elements: expression domain innovation (left), regulatory association innovation (middle), and duplication-associated innovation (right). (b) Regulatory domain innovation can occur through gain or change in the expression domain from that of the ancestral regulatory element. This can be brought about by mutations, leading to a change in expression levels, expression timing, or spatial location (top panel). Regulatory association innovation can occur from structural variations, leading to a change in regulatory element-target connection (middle panel). Innovation via duplication can occur from the duplication of an ancestral regulatory element through tandem, segmental, or transposon duplications.

Мы используем термин «новизна» для обозначения новых структур в регуляции генов, при этом мы связываем структуры с самой последовательностью регуляторного элемента. Мы классифицируем регуляторный элемент как «новый» в данной линии, если он полностью образован из оснований, которые у предков не функционировали как часть регуляторного элемента, причем такое образование произошло в анализируемой линии (рис. 1а). Новые элементы могут возникать de novo в результате мутаций во фрагменте ДНК (рис. 1b) или изменений в трансрегуляторном окружении. Мы считаем, что это единственный способ возникновения новых генных регуляторных элементов, однако существует несколько других механизмов, которые могут приводить к важным генным регуляторным инновациям.

Мы используем термин «инновация» для обозначения регуляторных элементов с активностью, отличной от их предков, которую мы связываем с изменением предкового домена экспрессии регулируемого гена. Мы описываем три категории, иллюстрирующие, как эти изменения приводят к инновационным результатам в экспрессии генов: (а) инновации домена экспрессии, (б) инновации регуляторных ассоциаций и (в) инновации, связанные с дупликацией (рис. 2а). Хотя мы представляем регуляторную новизну и инновации как отдельные категории, они не являются взаимоисключающими и часто встречаются в сложных комбинациях.

(a) Инновации в области экспрессии возникают, когда существующий регуляторный элемент приобретает область экспрессии, которая не была частью его предковой функции (рис. 2b, верхняя панель). Это включает изменения во времени или месте активности, которые приводят к тому, что элемент становится активным в клетках, где он ранее не был активен. Также инновационным является изменение уровня экспрессии в клетках, где элемент уже был активен. В качестве примера можно привести энхансер, активный в развивающейся сердечной ткани, в результате мутаций которого он становится активным и в развивающейся ткани конечностей. Такое расширение экспрессионных доменов, вероятно, происходит часто и зачастую путем добавления дополнительных оснований к регуляторному элементу. Такое расширение может привести к появлению в сохранившихся геномах больших и сложных регуляторных элементов, которые управляют экспрессией в нескольких доменах ^{25, 15, 17, 18-}.

(b) Регуляторные инновации через изменение ассоциации возникают, когда регуляторный элемент теряет или приобретает способность индуцировать экспрессию мишени. Примером может служить «захват энхансера», когда регуляторный элемент берет на себя контроль над экспрессией нового целевого гена [33]. Это может происходить за счет структурных вариаций, таких как транслокации, инверсии и инделы, которые могут воздействовать на предковый элемент, изменяя его геномные координаты напрямую или через изменения в соседних последовательностях ДНК (рис. 2b, в середине).

(c) Инновации в результате дупликации последовательностей возникают за счет увеличения числа копий существующих регуляторных элементов или кооптации повторяющихся элементов с известной функциональной способностью (рис. 2b, внизу). Примером может служить регуляторный элемент, подвергшийся тандемной дупликации [62], или дополнительные регуляторные модули, возникающие в результате крупных сегментных дупликаций. Многие вставки транспозируемых элементов, приводящие к регуляторным изменениям генов, будут включены в эту категорию, поскольку они представляют собой сложный класс повторяющихся последовательностей ДНК с продемонстрированными регуляторными способностями и историей кооптации для регуляции генов [20].

Несмотря на то, что основное внимание в этой области уделяется изменениям предковых функциональных элементов у человека, существуют статистические методы, которые, вероятно, могут обогатить обнаружение новых элементов в вычислительных экранах. Эти методы были доступны с момента первоначальной публикации HARs ^{59, 45, 55, 2}, но не получили такого же внимания, в отношении функциональных исследований или фенотипических анализов. Здесь мы обсуждаем концептуальные и технические ограничения, которые могут объяснить, почему эволюционная генетика человека исторически не фокусировала эксперименты на новых генных регуляторных элементах, и почему этот тип эволюционных изменений может быть недооценен.

Преобладает точка зрения, что эволюция нового регуляторного элемента с нуля затруднена и, следовательно, не является предпочтительным путем для адаптивных изменений регуляции генов [50]. Создание нового регуляторного элемента из не-функциональной ДНК потребовало бы большого числа мутаций для сборки различных сайтов связывания вблизи друг от друга. Кроме того, не было найдено эффективного метода воздействия отбора на промежуточные этапы, при котором генетические изменения оказывались бы выгодными только тогда, когда они собраны воедино. Настройка существующих регуляторных элементов путем усиления или ослабления сайтов связывания, добавления или потери сайтов связывания потребовала бы меньшего количества изменений и позволила бы отбору благоприятствовать промежуточным этапам [50]. Напротив, превращение последовательности ДНК без регуляторной функции в регуляторный элемент было бы значительным скачком, поскольку из геномного хлама пришлось бы собирать нечто сложное.

Недавние работы заставили нас пересмотреть эту точку зрения, и, похоже, становится все более возможным быстро создавать новые регуляторные элементы генов. Недавнее исследование выявило набор быстро эволюционирующих областей предков человека (HAQERs), которые представляют собой сильно расходящиеся области генома человека и в основном находятся за пределами консервативных регионов. Когда последовательности HAQER из предполагаемого предка человека - шимпанзе сравнивали с расходящимися человеческими последовательностями на предмет регуляторной активности генов в развивающихся нервных типах клеток, многие из предковых последовательностей показали активность в пределах отрицательного контроля, в то время как ортологичная последовательность HAQER действовала как сильный транскрипционный энхансер [42]. Кроме того, в недавних статьях было показано, что многие случайно сгенерированные последовательности ДНК обладают заметной генной регуляторной активностью у дрожжей [65], рыбок данио [60] и дрозофил [22]. Этот вывод о том, что некоторые случайные последовательности ДНК регулируют транскрипцию на низком уровне, был обобщен на клетки человека с помощью подхода машинного обучения [41]. Анализ фрагментов отрицательного контроля в массовых параллельных репортерных анализах (MPRA) теперь включает идею о том, что подмножество случайно перетасованных последовательностей будет иметь низкий уровень регуляторной активности генов [6]. Исходя из этого низкого уровня активности, в данной области существует консенсус, что оптимизация существующего регуляторного элемента путем подбора мутационных вариантов является эффективной. Переход от одного мышления к другому заключается в том, что достаточно большой фрагмент нейтрально эволюционирующей ДНК, вероятно, будет постоянно формировать слабые регуляторные элементы, обеспечивая субстрат, который можно оптимизировать. Формирование нового регуляторного элемента - это уже не задача каким-то образом собрать несколько частей, необходимых для функционирования целого, а скорее гладкая фитнес-поверхность, которую можно эффективно оптимизировать с помощью мутаций и отбора на промежуточных состояниях, начиная с исходного состояния с низкой активностью.

Недавняя эмпирическая работа, показывающая возможность создания новых регуляторных элементов, согласуется с прошлыми теориями и наблюдениями. Среди них - раннее открытие того, что множественные сайты связывания могут легко эволюционировать в ходе моделирования нейтрально эволюционирующей ДНК [63]. Кроме того, многие группы начали использовать термин «прото-энхансер» для описания промежуточного состояния между не-функциональной ДНК и тем, что обычно считается генным регуляторным элементом ^{15, 39, 17}.

Теоретическая легкость, с которой можно подделать новые регуляторные элементы, предсказывает, что в эпигенетических состояниях будет много видоспецифических различий. Это предсказание согласуется со сравнительными исследованиями, обнаруживающими многочисленные видоспецифические эпигенетические регуляторные состояния в данной ткани или типе клеток. Эти исследования включают эпигенетические сигналы в конечностях, мозге и печени человека, которые не наблюдаются в аналогичных образцах обезьян Старого Света или более отдаленно родственных видов ^{12, 53, 67, 37}. Эпигенетические различия также были проанализированы между лимфобластоидными клеточными линиями человека и шимпанзе и органоидами мозга, где есть много областей открытого хроматина, характерных для образцов человека или шимпанзе ^{56, 30, 23}. В совокупности теория, наблюдения и эксперименты в модельных системах и все чаще на людях свидетельствуют о том, что формирование новых регуляторных элементов генов более распространено в эволюции, чем считалось ранее.

Несмотря на наличие статистических механизмов для выявления новых элементов-кандидатов, изучение полученных в результате этого предполагаемых генных регуляторных элементов сопряжено с определенными трудностями. С другой стороны, изучение функциональных последствий изменений в строго консервативных регионах дает преимущества для экспериментальной работы, которые сохраняются и по сей день. В сочетании с ограниченным пониманием не-кодирующей и регуляторной ДНК это объясняет постоянное внимание к этим элементам для функциональных исследований на протяжении многих лет. Экспериментальные исследования часто преследуют две цели: выявление дивергированных геномных регионов с потенциальными функциональными последствиями и определение функциональных изменений, привносимых этими регионами в человеческую линию. Обе эти цели могут быть легче достигнуты в модифицированных консервативных регионах.

(a) Сложно определить функциональную значимость изменений в предковых не-функциональных или неограниченных регионах генома, которые могут привести или не привести к появлению новых регуляторных элементов. Многие вычислительные скрининги, способные обнаружить новые элементы, возможно, не смогли четко разграничить функционально важные и неважные изменения, что затрудняет оценку их влияния на признаки человека без возможности дальнейшей фильтрации результатов с помощью высокопроизводительных экспериментов [42]. Напротив, геномные изменения, выявленные в тесно консервативных регионах, скорее всего, будут иметь значительные функциональные последствия. Эти регионы, исконно сохранившиеся у млекопитающих, дают убедительные доказательства того, что генетические изменения в них способствуют появлению уникальных человеческих фенотипов.

(b) Экспериментально определить функции предков потенциально новых элементов довольно сложно. Не стоит ожидать, что дожившие до наших дней животные будут содержать последовательность ДНК предка человека-шимпанзе или повторять его функции. Однако для регионов, ограниченных в пределах млекопитающих, образцы ДНК и тканей вымерших млекопитающих с большей вероятностью будут точно представлять последовательность и функцию предка человека-шимпанзе ^{7, 4, 24}

Несмотря на сложности в изучении новых регуляторных элементов, несколько недавних технологических достижений подчеркивают потенциал будущего. Главным из них является синтез in vitro больших фрагментов ДНК, позволяющий напрямую изучать функции предполагаемых предковых последовательностей ^{35, 42-, 21}. Хотя проведение экспериментов в точной транс-регуляторной среде предка остается сложным, недавние сравнительные геномные исследования между человеком и близкородственными приматами начали количественно оценивать регуляторную активность генов в развивающемся транс-регуляторном фоне ^{69, 27}-. Этот прогресс, наряду с другими будущими исследованиями, может в конечном итоге позволить изучать новые регуляторные элементы в их предковом транс-регуляторном фоне. Кроме того, недавние исследования подчеркнули перспективность методологий машинного обучения для предсказания тканеспецифического открытого хроматина, а также сложных фенотипов на основе различий в последовательности ^{32, 31}. С ростом числа геномов человека и приматов и развитием высокопроизводительных параллельных функциональных экспериментов [48] растет потенциал для разработки методов и скрининга, позволяющих понять относительный вклад новых генных регуляторных элементов в развитие специфических для человека признаков.

Еще одна причина, которая могла привести к недостатку внимания к новым регуляторным элементам в эволюции человека, заключается в том, что многие из первых примеров не-кодирующих генетических изменений, лежащих в основе фенотипических различий, были изменениями предковых регуляторных элементов, а не формированием новых ^{51, 52, 36}. Многие из этих исследований, в которых на основе интересующего фенотипа выявлялись генетические изменения, проводились на дрозофиле, которая является мощной модельной системой, позволяющей задавать вопросы о молекулярной основе эволюционных изменений. Вклад исследований дрозофилы в понимание регуляторных основ эволюции был беспрецедентным. Однако в том, как эволюционируют мухи и человек, могут быть небольшие различия.

У человека и мухи может быть разный относительный вклад в регуляторные изменения генов за счет модификации существующих элементов или создания новых. Это связано с тем, что соотношение не-регуляторных и регуляторных оснований у разных видов может быть разным, что потенциально приводит к тому, что относительный вклад создания новых регуляторных элементов и модификации существующих регуляторных элементов может быть разным. У мух и других организмов, таких как дрожжи, геном гораздо компактнее, чем у человека, и его потенциально в 10 раз больше, чем у человека, эволюционирует под действием селективных ограничений [58]. Наличие у человека и других животных, например мышей, большего количества неограниченных последовательностей может привести к тому, что наши виды будут создавать новые регуляторные элементы с большей частотой, чем виды с более компактными геномами. Это захватывающее направление исследований, поскольку мы узнаем больше о вкладе новых элементов в эволюцию человека.

Важной целью изучения генетических основ уникальности человека является более глубокое понимание специфических для человека заболеваний или заболеваний, к которым люди имеют уникальную восприимчивость. Если новые регуляторные элементы встречаются чаще, чем считалось ранее, это может существенно изменить наше понимание эволюционных механизмов в геноме и, следовательно, наше понимание болезней человека.

Если бы формирование новых регуляторных элементов происходило редко, то большинство клинически значимых мутаций возникало бы в консервативных генах или регуляторных регионах. Однако если новые регуляторные элементы являются обычным явлением в эволюции человека, то многие важные регуляторные элементы могли быть выкованы достаточно недавно, чтобы отключающие мутации в этих регионах не были обнаружены в консервативных областях. Не исключено, что отключающие мутации в специфических для человека регуляторных элементах могут быть связаны с уменьшением числа признаков, которые мы обычно считаем специфическими для человека. Регуляторные элементы генов, не демонстрирующие межвидовой консервации, могут быть особенно важны для заболеваний человека, поскольку, согласно нашей недавней работе, регуляторные элементы могут предпочтительно формироваться в геномных регионах с высокой частотой мутаций [42]. Это создает эволюционный конфликт: регионы с высоким уровнем мутаций могут генерировать адаптивные аллели, но также могут производить многочисленные пагубные мутации в новых выкованных регуляторных элементах [42].

Если формирование новых регуляторных элементов происходит очень часто, то многие заболевания у человека могут быть вызваны не только нарушением функциональных элементов, но и созданием новых элементов, которые являются пагубными. Такой пример есть у свиней, где небольшие мутации в неконсервативной ДНК перед геном транскрипционного фактора, ассоциированного с микрофтальмией, вероятно, возник сайленсер, что привело к спонтанной глухоте и депигментации [10]. Потенциальным примером этого у человека может служить исследование врожденных пороков сердца, в ходе которого было обнаружено, что мутации, специфичные для конкретного пациента, часто вызывают обнаруживаемую активность регуляторных элементов в регионах, которые в противном случае не проявляют никакой активности [72]. Более глубокое понимание того, как происходит эволюция регуляторных элементов, включая относительный вклад модификаций существующих элементов в создание новых, улучшит нашу способность понимать и лечить человеческие заболевания в будущем.

В первую очередь мы подумаем о том, как установить отсутствие функции в предковом состоянии, что необходимо, исходя из нашего определения новизны. Строго выполнить эту часть определения будет сложно, поскольку для этого необходимо установить отсутствие регуляторной функции во всех типах клеток, на всех стадиях развития и во всех средах. Хотя прогресс в протоколах дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) делает редкие и переходные типы клеток более доступными, мы все еще далеки от того, чтобы экспериментально доказать отсутствие функции во всех возможных типах клеток и условиях. Эта сложность усугубляется тем, что эксперименты в идеале проводятся не в клетке человека или шимпанзе, а в клетке с транс-окружением предка человека-шимпанзе. Стоит также отметить, что многие функциональные анализы в этой области представляют собой высокопроизводительные репортерные анализы, которые проверяют функцию регуляторных элементов вне их родного хромосомного контекста и с одним промотором. Мы с нетерпением ждем будущих достижений в области дифференцировки iPSC и синтеза ДНК, которые в один прекрасный день позволят проводить функциональные тесты в широком диапазоне предковых типов клеток и в их истинном предковом геномном контексте.

Второй вопрос - существует ли не-функциональное состояние, или все фрагменты ДНК могут обладать определенным уровнем регуляторной активности. Отрицательные контрольные последовательности ДНК часто дают распределение активности в анализах регуляции генов, а не плотную кластеризацию вокруг одного значения. Континуум регуляторной активности ДНК во всех последовательностях может сделать процесс создания сильных регуляторных элементов еще более эффективным, но также потребует пересмотра нашего определения новизны, которое в настоящее время требует не-функционального состояния.