Фундаментальный принцип экспрессии генов объясняет, что мессенджер РНК (мРНК), транскрибируемая с ДНК, трансформируется в белки, которые выполняют структурные, регуляторные и прочие функции в различных клеточных процессах [1]. Исследование механизмов генетической регуляции, проведенное Jacob and Monod’sв 1961 году, установило решающую роль мРНК в передаче генетической информации [2]. Однако белок-ориентированная теория была поставлена под сомнение, когда выяснилось, что белок-кодирующие гены как у низших, так и у высших организмов сходны, но это сходство не может объяснить сложность, наблюдаемую у высших организмов [3].

Международный консорциум по секвенированию генома человека 2004 года показал, что геном человека содержит всего около 20 000 белок-кодирующих генов, что составляет чуть более 2 % от общего числа геномных последовательностей. Всесторонние усилия по аннотированию, такие как инициатива ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements, 2012), расширили наше понимание скрытых аспектов генома. Кроме того, в рамках проекта FANTOM (Functional Annotation of Mouse Genome) было обнаружено около 35 000 не-кодирующих транскриптов из примерно 10 000 различных локусов [4-6].

За последнее десятилетие было тщательно классифицировано несколько коротких не-кодирующих РНК, включая микроРНК, малые интерферирующие РНК (siRNA), малые ядерные РНК (snRNA), малые нуклеолярные РНК (snoRNA) и Piwi-взаимодействующие РНК (piRNAs). Однако длинные не-кодирующие РНК (lncRNA) остаются относительно мало изученными из-за их различной длины - от 200 нуклеотидов до более 100 килобаз - и сравнительно низкой клеточной распространенности [7,8]. С появлением высокопроизводительных технологий было показано, что большая часть генома человека транскрибируется, что превосходит современные обозначения генов.

Революционные достижения в области секвенирования следующего поколения (NGS) и его приложений, таких как RNA-seq, позволили решить некоторые из этих проблем, получив данные о транскриптоме в целом, включая lncRNA [8]. Эти открытия значительно расширили наше понимание функциональных свойств того, что раньше считалось нежелательной ДНК, раскрыв важнейшую роль не-кодирующих РНК (нкРНК) [9,10].

LncRNA - это не-кодирующие транскрипты длиной более 200 п.н., сходные по структуре с белок-кодирующими генами, которые имеют множество сигнатур мРНК. LncRNA, как и мРНК, транскрибируются РНК-полимеразой II и могут подвергаться процессам сплайсинга, полиаденилирования и 5' кэпирования (capping) [11]. Как и белок-кодирующие гены, lncRNA обладают гистоновыми метками активных промоторов и активно транскрибируемых генных тел, но при этом практически не имеют открытых рамок считывания (ORF). Важно отметить, что основная масса lncRNA находится в ядре [12]. Однако, в отличие от мРНК, lncRNA могут сворачиваться в сложные вторичные и третичные структуры, что позволяет им выступать в роли губки для миРНК или служить каркасом для белковых регуляторных комплексов [13]. Интересно отметить, что lncRNA контролируют ряд клеточных функций, включая дифференциацию, пролиферацию и апоптоз. Они выполняют несколько биологических функций, включая модуляцию белков или мультибелковых комплексов, связывание ДНК/РНК-ассоциированных белков для регуляции транскрипционной экспрессии, регулирование стабильности ДНК через образование r-петли и тройных спиралей, взаимодействие с хроматиновыми комплексами для регуляции эпигенетической экспрессии генов и, в конечном счете, формирование структуры хроматина более высокого порядка [14].

Геном человека состоит из не-кодирующих областей, расположенных среди кодирующих последовательностей, которые классифицируются на несколько подтипов [13,15,16]. LncRNA транскрибируются из различных геномных локусов и могут иметь различные модификации поли(А), что приводит к их локализации в различных клеточных регионах [17]. LncRNA классифицируются в зависимости от геномного расположения и контекста белок-кодирующих генов. LncRNA, транскрибируемые с межгенных областей (областей между двумя белок-кодирующими генами), называются длинными межгенными не-кодирующими РНК (lincRNA) [18]. LncRNA, транскрибируемые с интронов белок-кодирующих генов, называются интронными lncRNA. Аналогично, смысловые lncRNA транскрибируются со смысловой нити белок-кодирующих генов и могут содержать экзоны, частично или полностью перекрывающиеся с последовательностью кодирующего гена. В отличие от них, антисмысловые lncRNA транскрибируются с антисмысловой нити белок-кодирующих генов [19].

Исследования показывают, что lncRNA преимущественно локализованы в ядре и связаны с хроматином, что позволяет предположить, что они могут оказывать значительное влияние на последовательности ДНК [19]. LncRNA регулируют структуру хроматина в трех функциональных фазах: ремоделирование хроматина, метилирование ДНК и модификации гистонов. Несмотря на отсутствие консервации базовых последовательностей, lncRNA выполняют эти функции в широком эволюционном спектре [13,20]. Исследование показало, что около 42 % из 182 исследованных lncRNA участвуют в регуляции транскрипции [18]. Кроме того, lncRNA можно разделить на транс-lncRNA, которые регулируют экспрессию удаленных генов, и цис-lncRNA, которые влияют на экспрессию генов, находящихся в непосредственной близости от генома [18].

Данный обзор посвящен lincRNAs, которые транскрибируются полностью с участков между двумя белок-кодирующими генами. 4. LincRNAs, как правило, имеют собственные промоторы и довольно консервативны. Большинство lincRNA транскрибируются РНК-полимеразой II и подвергаются пост-транскрипционным модификациям, включая 5' capping и 3' полиаденилирование [21]. Они также демонстрируют рибосомную загрузку, подобно 5'UTR белок-кодирующим генам, и имеют сходные промоторные и транскрипционные характеристики [13,22].

Впервые предположение о существовании lincRNA было высказано на основании новых последовательностей, идентифицированных с помощью tiling массивов, которые выявили широко распространенные транскрипции из не-кодирующих областей, не перекрывающихся с белково-кодирующими генами [5,16,23-25]. Поскольку они транскрибируются из отдельных локусов, их профили экспрессии и эффекты их сверхэкспрессии или пониженной регуляции относительно легко интерпретировать [26,27].

Многочисленные человеческие lincRNA были обнаружены в геномных областях за пределами хорошо изученных белок-кодирующих регионов. Эти lincRNA проявляют интригующие свойства, включая ассоциации с различными заболеваниями, тканеспецифическую экспрессию и изменения в ходе развития. Понимание роли lincRNA в регуляции сложных биологических процессов является захватывающей областью исследований [8]. По данным Lncipedia, всеобъемлющей базы данных lncRNA, высокопроизводительные транскриптомные исследования каталогизировали более 111 000 транскриптов lncRNA, причем около 50 % из них являются lincRNA, происходящими из межгенных областей [28].

Примечательной особенностью lncRNA является их высокий уровень сохранения среди млекопитающих [29-31]. В то время как многие lncRNA считаются транскрипционным шумом из-за их плохой сохранности, многие lncRNA классифицируются как ультра-консервативные или высоко-консервативные элементы у млекопитающих. Высокий уровень сохранности предполагает, что удаление этих ультра-консервативных элементов in vivo может иметь существенные фенотипические эффекты из-за функциональных ограничений [32,33]. Однако предыдущее исследование показало, что удаление четырех различных сверхсохранных элементов у мышей не повлияло на их жизнеспособность и не привело к появлению аномальных фенотипов [34]. Для полного понимания роли этой высоко-консервативной группы lincRNA необходимы дальнейшие исследования.

Сходство между мышиными и человеческими lincRNA может варьировать в зависимости от используемого метода аннотации. Приблизительно половина не-кодирующих транскриптов из библиотек кДНК мыши совпадает с геномом человека [35]. Удивительно, но только около 14 % обнаруживают метки экспрессируемой последовательности или кДНК, указывающие на ортологичный транскрипт человека [11]. Это несоответствие вызывает вопросы о том, действительно ли функции lincRNA являются консервативными, и привело к разработке альтернативных методов аннотации [21,36].

Используя ChIP-seq сигнатуры триметилирования лизина 4 гистона H3 (H3K4me3) и триметилирования лизина 36 гистона H3 (H3K36me3), известные как кластеры «K4-K36», Guttman и др. выявили около 1700 транскрипционных единиц размером более 5 кб в четырех клеточных линиях мыши. Эти данные были подтверждены с помощью tiling микрочипов, PCR и северных блотов. LincRNAs могут регулировать экспрессию своих генов-мишеней или модулировать эпигенетический ландшафт хроматина. Транскрипционно активные lincRNA характеризуются наличием домена «K4-K36», триметилированием гистона H3K4 на их 5' конце и триметилированием гистона H3K36 в теле гена, что свидетельствует об активной транскрипции [29-31,37]. Примечательно, что около 70% lincRNA с доменом «K4-K36» проявляют транскрипционную активность РНК, что сопоставимо с таковой для белок-кодирующих генов (~72%). Наиболее значимым результатом является то, что ортологичные регионы у мышей сохраняют около 70% транскрипционно активных доменов (домен K4-K36), обнаруженных в человеческих lincRNA, что аналогично доле белок-кодирующих генов (80%) [29]. Позднее эта хроматиновая сигнатура была применена к клеточным линиям человека и показала, что наряду с HOTAIR 20% lincRNA связаны с Polycomb repressive complex 2 (PRC2) [29].

В широком спектре организмов lincRNA играют важнейшую функциональную роль. Дифференциальная экспрессия lincRNA наблюдается в различных тканях, заболеваниях и клеточных реакциях, что подчеркивает их значительную тканевую специфичность и потенциал для точной настройки экспрессии целевых генов в тканеспецифическом режиме [38]. Кроме того, lincRNA демонстрируют специфические для каждого заболевания паттерны экспрессии [39]. У Saccharomyces cerevisiae (почкующихся дрожжей) lincRNA участвуют в стрессовых реакциях, включая питательное голодание [40]. У Arabidopsis thaliana, хотя lincRNA экспрессируются на более низком уровне по сравнению с белок-кодирующими генами, некоторые их подмножества демонстрируют тканеспецифические и стресс-реактивные паттерны экспрессии, что позволяет предположить их роль в метаболических и тканеспецифических процессах у беспозвоночных [41,42]. Эти характеристики lincRNA послужили стимулом для использования их в трансляционных и клинических приложениях, например, в качестве биомаркеров заболеваний [8].

Недавние данные РНК-секвенирования (RNA-seq) 30 тканей, предоставленные консорциумом Genotype-Tissue Expression (GTEx), показали, что медианный показатель tau для тканевой специфичности lincRNA составляет 0,90, что значительно выше, чем 0,77 для мРНК [29]. Важно отметить, что анализ кластеризации без контроля показал, что 78 % lincRNA являются тканеспецифичными, в отличие от всего 19 % мРНК. Эта тенденция сохраняется независимо от уровня экспрессии, при этом более высокие показатели специфичности наблюдаются у более высоко экспрессированных lincRNA. Такая сильная тканевая специфичность предполагает, что экспрессия lincRNA жестко регулируется, что подтверждает идею о том, что lincRNA играют решающую роль в определении состояния клетки [29]. Первые исследования экспрессии lincRNA в мозге мышей также выявили точные паттерны их экспрессии в определенных тканях, типах клеток и субклеточных компартментах [43]. Нокаутные модели мышиных lincRNA выявили lincRNA, ассоциированные с перинатальной или постнатальной летальностью, а также с дефектами роста и орган-специфического развития, которые, возможно, не могут быть напрямую перенесены на человека [44]. Однако определение функций lincRNA на основе нокаутных фенотипов является сложной задачей, поскольку наблюдаемые фенотипы могут быть результатом нарушения регуляторных элементов генов в локусах lincRNA. Хотя генетические исследования на мышах позволяют получить ценные сведения о биологии человеческих lincRNA, они ограничены эволюционными различиями и сложностью исключения РНК-независимых эффектов [35]. Существующие данные свидетельствуют о том, что lincRNA играют важнейшую роль в различных биологических процессах, в частности в регуляции экспрессии генов во время эмбрионального развития. Многие lincRNA специфически экспрессируются в эмбриональных стволовых клетках, нейрональных клетках предшественниках и тканях во время развития, что указывает на их потенциальное участие в дифференцировке и спецификации линий [45,46]. Кроме того, lincRNA были вовлечены в регуляцию кластеров генов Hox, которые необходимы для формирования передне-задней оси в процессе эмбриогенеза. Например, lincRNA HOTAIR участвует в эпигенетическом замалчивании локуса HOXD, тем самым способствуя правильному формированию плана тела [46]. Кроме того, lincRNA Xist необходима для инициации и поддержания инактивации Х-хромосомы, что является критическим процессом для компенсации дозы у самок млекопитающих [47].

В целом, открытие обширного транскрипционного ландшафта в геноме в основном включает в себя lincRNA, которые вовлечены в различные биологические процессы [1,21,48,49]. Эти недавние открытия значительно расширили наши представления о регуляции генов. 4. LincRNAs оказались важнейшим регуляторным слоем, играющим важную роль в различных биологических процессах, включая развитие плода.

Появление технологий секвенирования РНК нового поколения позволило проводить высокопроизводительные анализы экспрессии lincRNA в различных типах клеток и тканей [50,51]. Эти исследования показали, что lincRNA часто группируются рядом с транскрипционными факторами и генами развития [52-54]. Несмотря на эти открытия, многие мышиные модели с участием lincRNA демонстрировали лишь незначительные дефекты или не имели заметных фенотипических особенностей [55-59]. Ранние исследования нокаутных штаммов Xist и Tsix продемонстрировали существенную роль lincRNA в инактивации и жизнеспособности X. Последующие исследования в 2000-х годах выявили HOTAIR как ключевой регулятор, репрессирующий транскрипцию генов семейства HOX [60]. Эти новаторские исследования подстегнули интерес к изучению функций lincRNA в конкретных клеточных контекстах, на этапах развития и при заболеваниях [61].

Yan et al. выявили экспрессию 3405 lncRNA, включая 2733 вероятные lincRNA, с помощью анализа РНК-секвенирования единичных клеток из предимплантационных эмбрионов и эмбриональных стволовых клеток человека [62]. Хотя некоторые из этих lincRNA демонстрировали различные паттерны экспрессии в зависимости от стадии развития, конкретные профили lincRNA во время эмбрионального развития детально не анализировались. Однако они предоставили данные РНК-секвенирования по стадиям развития для предимплантационных эмбрионов человека [63,64].

У бычьих эмбрионов нокдаун специфических lincRNA влиял на рост эмбрионов, приводя к увеличению скорости развития и увеличению размеров бластоцист [65]. Также преимущественно указывались ранние стадии сплайсинга lincRNA. Напротив, у мышей, siRNA-опосредованное глушение промотор-ассоциированной lincRNA, специфически экспрессируемой в эмбрионах двухклеточной стадии, приводило к эмбриональной летальности. Этот фенотип был восстановлен путем избыточной экспрессии взаимодействующего белка [66].

Масштабные исследования по секвенированию РНК и геномике в сочетании с комплексной системой отбора кандидатов позволили успешно идентифицировать физиологически важные lincRNA. Первоначальная характеристика 18 нокаутных штаммов lincRNA у мышей выявила перинатальные или постнатальные летальные фенотипы, а также дефекты роста и ограниченного развития органов, которые нелегко воспроизвести у человека. Например, мутантные штаммы Fendrr, Peril и Mdgt демонстрировали перинатальную или постнатальную летальность, причем у мутантов Fendrr наблюдались дефекты легких, сердца и желудочно-кишечного тракта. Примечательно, что lincRNA, такие как Fendrr, транскрибирующиеся дивергентно от транскрипционного фактора Foxf1, имеют решающее значение для развития органов в эмбриогенезе [44]. Дополнительные мутанты, такие как linc-Brn1b и linc-Pint, демонстрировали дефекты роста, а мутанты linc-Brn1b-/- показали аномалии в генерации нейронов верхнего слоя II-IV в неокортексе. Эти результаты подчеркивают критическую роль lincRNA в развитии плода и создают предпосылки для будущих крупномасштабных функциональных исследований [44].

В исследовании 20 нокаутных линий мышей [67] мыши, гомозиготные по делеции гена Fendrr, выжили при рождении, но вскоре умерли из-за серьезных проблем с дыханием. На эмбриональной стадии E13.5 развивающиеся легкие этих нокаутных эмбрионов были заметно меньше, с дезорганизованными, шаровидными долями. Перинатальный летальный фенотип мутантов Fendrr наблюдался на двух различных генетических фонах: гибриде C57BL6/129 и мышах, скрещенных с C57BL/6. Исследование также выявило целый ряд фенотипов, от перинатальной летальности до дефектов, напоминающих преждевременное старение, включая аномалии в легких, скелете и мышцах [67].

Помимо своей роли на ранних эмбриональных стадиях, lincRNA имеют решающее значение для тканеспецифического развития на стадии зародыша.

Исследования с использованием секвенирования РНК и геномных данных раскрыли ранее неизвестные роли lincRNA в развитии мозга. Исследования показывают, что регуляция специфических для мозга lincRNA существенно влияет на способность к дифференцировке нейронных предшественников. К ключевым lincRNA, участвующим в развитии нейронов, относятся Peril, Evf2 (Dlx6os1) и linc-Brn1b [44,68]. Например, Evf2 действует как транскрипционный коактиватор через Dlx2, усиливая транскрипционную активность Dlx5/6 и глутаматдекарбоксилазы 1 (Gad1), которая необходима для преобразования глутамата в GABA. Эта регуляция имеет решающее значение для развития GABA-ергических интернейронов в мозге мыши [69]. Выключение Evf2 приводит к аномальной синаптической активности из-за нарушения формирования GABA-ергических цепей в гиппокампе и зубчатой извилине [68].

Примечательно, что гомеодоменный транскрипционный фактор Emx2, экспрессирующийся в дорсальном телеэнцефалическом нейроэпителии (область, дающая начало нейронам коры), окружен скоплениями lincRNA, что подчеркивает необходимость дальнейших исследований в тканях мозга [70,71]. Сложные регуляторные механизмы lincRNA, вероятно, возникли для того, чтобы облегчить многоуровневый контроль экспрессии генов, необходимый для разнообразия клеток и сложных функций мозга. Например, Linc-Brn1b - это lincRNA, влияющая на развитие коры головного мозга. Многие другие lincRNA, помимо Linc-Brn1b, демонстрируют ограниченные паттерны экспрессии в предшественниках в желудочковой зоне (VZ) и субвентрикулярной зоне (SVZ) телеэнцефалона, что указывает на их роль в нейрогенезе. Кроме того, некоторые lincRNA демонстрируют динамические и клеточно-специфические паттерны экспрессии в различных областях мозга [43].

LincRNAs также играют ключевую роль в регуляции структуры сердечного хроматина во время развития сердца. Они участвуют в управлении развитием сердца, оркестрируют транскрипционные программы и реагируют на стресс, представляя собой потенциальные биомаркеры и терапевтические мишени для сердечно-сосудистых заболеваний [72-74].

Одним из ярких примеров является специфическая для мышей lincRNA Braveheart (Bvht). Bvht контролирует дифференцировку мезодермальных предшественников в кардиомиоциты, регулируя экспрессию мезодермального фактора транскрипции 1 (MesP1), находящегося в задней части основной спирали-петли-спирали. Для этого он взаимодействует с гистоновым модификатором PRC2, отсекая Polycomb белок Suz12 от промоторов генов, определяющих линию развития сердца, таких как Hand1, Hand2, Mesp1, Nkx2-5 и Tbx20 [73]. Функция Bvht имеет решающее значение для развития кардиомиоцитов, поскольку его истощение нарушает экспрессию кардиоспецифических генов и препятствует созреванию кардиомиоцитов [75].

Несмотря на эти данные, всесторонняя аннотация lincRNA все еще ограничена, и лишь некоторые из них были изучены в контексте развития сердца и сердечно-сосудистых заболеваний [76]. Для углубления нашего понимания сердечных lincRNA, экспрессирующихся во время развития сердца, необходимо провести их геномную идентификацию и характеристику. Wang et al. провели геномное секвенирование РНК в сердцах эмбрионов рыбок данио, сердцах взрослых особей и мышцах взрослых особей, в результате чего был получен высоко-достоверный набор из 813 транскриптов сердечных lincRNA, из которых 423 оказались новыми. Из них 564 экспрессируются в эмбриональном сердце и 730 - во взрослом, включая две новые lincRNA, TCONS_00000891 и TCONS_00028686, которые демонстрируют высокий кардиологический паттерн экспрессии. Они также идентифицировали 51 lincRNA с дифференциальной экспрессией между эмбриональным и взрослым сердцем, включая TCONS_00009015, которая реагирует на доксорубицин-индуцированный сердечный стресс. Эта систематическая идентификация и характеристика сердечных lincRNA закладывает основу для будущих исследований их роли в развитии сердца и сердечно-сосудистых заболеваний [77].