Kristen L. Pierce, Richard T. Premont, Robert J. Lefkowitz (Lefko001@receptor-biol.duke.edu) Nature Reviews Molecular Cell Biology Vol 3 No 9 639-650 (2002)
(Рис.1.) | Classical examples of seven-transmembrane (7TM)-receptor signalling.
G-protein signalling pathways are remarkably conserved
among diverse species. The budding yeast Saccharomyces
cerevisiae has been a particularly informative model system for
delineating signalling pathways by genetic means (for a recent
review, see Ref. ).
In each of the two haploid yeast mating strains, α
and a, 7TM receptors recognize the mating pheromone that is secreted
by the other strain, and initiate signalling cascades that lead to
cell fusion to form diploid cells, followed by sporulation. The
pheromone receptors couple to a heterotrimeric G protein, GPA1,
which leads to activation of mitogen-activated protein kinases
(MAPKs) through a conserved kinase cascade (see ).
Remarkably, MAPK activation in yeast was shown to proceed through
the G-protein βγ-dimer rather than the GTP-bound α
subunit, and this demonstration was a crucial hint that mammalian
G-protein pathways might use b;γ as well as α
as signal transducers. Curiously, activation of adenylyl cyclase in
yeast proceeds through activation of the small GTP-binding protein
Ras, instead of being mediated by the G-protein α
subunit as in higher organisms, whereas MAPK activation in yeast is
directly activated through βγ-subunit
activation of the complex between Ste5 (a scaffold protein) and Ste20 (the yeast homologue of p21-activated kinase,
PAK), instead of through activation of Ras–Raf. So, these two
pathway connections are reversed in yeast compared to the equivalent
mammalian pathways.
Yeast pheromone signalling does show a desensitization
phenomenon, but yeast do not possess G-protein-coupled receptor
kinases or arrestin proteins to mediate phosphorylation-dependent
homologous desensitization through receptor uncoupling from the G
protein. Instead, yeast dampen signalling by directly regulating the
G protein. The yeast Sst2 gene was identified from a mutant strain
that was supersensitive to pheromones, and the Sst2 protein is the
founding member of the regulator of G-protein signalling (RGS)
family. RGS proteins dampen signalling by acting as
GTPase-activating proteins for heterotrimeric G-protein α
subunits in both yeast and mammalian systems. Yeast pheromone
receptors internalize after activation, as do mammalian 7TM
receptors. Agonist-activated yeast mating-factor receptors require
both phosphorylation and ubiquitylation for internalization. Recent
reports,
indicate that mammalian 7TM receptors also undergo agonist-dependent
ubiquitylation, although this is not required for internalization
but rather for downregulation through degradation in lysosomes.
Yeast will certainly continue to be a useful system for defining
signalling models.
Необычайное семейство состоящее из более чем 800 генов, кодирующих рецепторные белки, которые характеризуются seven-transmembrane (7TM) конфигурацией. Члены этого семейства включают рецепторы для многох гормонов, нейротрансмиттеров, хемокинов и ионов кальция, а также сенсорные рецепторы для разнообразных , ощущения горького и сладкого и даже для фотонов света. Одно только подсемейство рецепторов запахов (odorant)содержит несколько сотен членов. 7TM рецепторы регулируют не только множество физиологических процессов, но лекарства, которые находят эти рецепторы — прямо или косвенно. 7TM рецепторы общепринято обозначать как G-protein-coupled receptors (GPCRs), т.к. большинство из них передает сигналы путем активации . Однако, увеличивается количество альтернативных сигнальных механизмов, которые приложимы к этим рецепторам.
В 1980s была выявлена функциональная аналогия между передачей зрительных сигналов в сетчатке и гормональных сигналов в др. тканях. Было предположено что оба процесса используют получатель 'рецептора' или импульса, трансдуктор 'G protein' (transducin в сетчатке или Gs в случае adenylyl cyclase), и эффекторный энзим (напр., cyclic GMP phosphodiesterase в сетчатке или adenylyl cyclase; Рис. 1). Несмотря на это, только после клонирования гена и комплементарной ДНК (β2-AR) для catecholamines млекопитающих в 1986 и определения, что он обладает гомологичными последовательностями и предполагаемой структурой 7TM как и зрительный рецептор , эта идея большого семейства генов стала прорисовываться. Идея быстро подтверждалась клонированием др. членов семейства adrenergic-рецепторов, muscarinic cholinergic рецепторов и некоторых серотониновых рецепторов.
Предпринимались многочисленные попытки идентифицировать первичные последовательности рецепторных белков, распознающих гормоны, нейромодуляторы и факторы. Эта цель в основном достигнута и нес колько сотен отдельных 7TM рецепторов человека и субтипов рецепторов было идентифицировано.
Three families of 7TM receptors
Эти многочисленные последовательности м.б. сгруппированы в три отдельных семейства A, B и C на базе сходства последовательностей. Последовательности внутри каждого семейства в целом обнаруживают 25% идентичных последовательностей в трансмембранной стержневой области и четкими наборами высоко законверсированных остатков и мотивов. Между тремя семействами сходство небольшое, связанное с их 7TM архитектурой.
Семейство A это самая большая группа оно включает рецепторы для света (rhodopsin) и адреналина (adrenergic receptors) и большинство др. типов 7TM рецепторов, включая обонятельную подгруппу. Обонятельные рецепторы составляют большую часть этих последовательностей, но и почти 200 необонятельных 7TM рецепторов, которые распознают свыше 80 определенных лигандов, также функционально охарактеризованы.
Семейство B содержит только ~25 членов, включая рецепторы для семейства gastrointestinal peptide hormone (, , (VIP) и ), corticotropin-releasing гормона, calcitonin и parathyroid гормона. Все рецепторы семейства B, по-видимому, связаны в основном с активацией эффекторов adenylyl cyclase посредством G protein Gs.
Семейство C также относительно небольшое и содержит семейство metabotropic
glutamate рецепторов, GABAB рецептор и calcium-sensing рецептор, а также некоторые вкусовые рецепторы. Все члены семейства С имеют очень большой внеклеточный N-конец, который, по-видимоу, важен для связывания и активации лиганда.
Лишь для родопсина известна кристаллическая структура, которая соответсвует неактивному рецептору, подтверждая присутствие против часовой стрелки пучка 7TM α спиралей (видимой или со стороны intradiscal или extracellular), которые соединены петлями варьирующей длины.
Classical examples of receptor signalling
В 1971 Martin Rodbell высказал идею, что guanine-nucleotide регуляторный белок функционально соединяет рецепторы в контексте гормональной (glucagon) стимуляции системы adenylyl cyclase, генерирующей вторичные мессенджеры циклический АМФ. Предполагаемый белок, Gs (первоначально был назван Ns), был очищен и было установлено, что он гетеротримерный, состоящий из α,β и γ субъединиц. α субъединица ответственна за связывание ГТФ и ГДФ и за гидролиз ГТФ, тогда как β и γ субъединицы ассоциированы в тесно связанный βγ комплекс. Каждая из этиз субъединиц теперь известна как член семейства генов; к стати, клонировано 16 α, 5 β и 12 γ белков.
G белки обычно обозначаются по их α субъединицам. Так, Gs гетеротримерный комплекс, содержащий ; Gq содержит ; Gi содержит Gαi; и т.д. Распознано 4 различных подсемейств α-субъединиц: Gs белки связаны со стимуляцией adenylyl cyclase; Gi связаны с ингибированием adenylyl cyclase, а также с активацией G-protein-coupled inwardly rectifying potassium (GIRK) каналов; Gq белки связаны с активацией фосфолипазы Cβ; а G12 белки связаны с активацией Rho (GEFs). Однако, комбинационная сложность αβγ гетеротримеров м.б. еще сложнее из-за специфического состава субъединиц G белков, которые функционируют в специфических путях.
Receptor activation and downstream signalling.
Как α субъединица, так и βγ димер пердают сигналы с помощью активации или ингибирования целого списка эффекторов (Табл. 1).Агонист активации рецепторов индуцирует конформационные изменения, которые еще слабо изучены, но которые вовлекаются, как минимум, в перестройки мембранных спиралей 6 и 3. Такой 'activated receptor' м. взаимодействовать с гетеротримерным G белком и служит как GEF, способствуя диссоциации ГДФ и связыванию и активации ГТФ. Рецепторы варьируют по степени своей агонист-независимой или конституитивной активности по связыванию G белков, a мутации рецепторов обусловливают усиление этой активности, что обнаруживается при многочисленных заболеваниях. Итак, активированный гетеротиример диссоциирует на α субъединицу и βγ димер, обладающие независимой способностью регулировать разные эффекторы (Рис. 1). Гидролиз ГТФ до ГДФ — процесс, как известно, регулируемый с помощью RGS (regulator of G-protein signalling) белков — ведет к реассоциации гетеротримера и окончанию цикла активации. Но происходит ли физическая диссоциация α от βγ димера действительно во время активации G-белка, остается неизвестным.
Classical examples of receptor
desensitization
Множество механизмов вовлечено в тонкую настройку и регуляцию передачи сигналов через рецепторы. Среди них наиболее изучены те, которые быстро ослабляют ('dampen') передачу сигналов, даже в присутствии агониста, продолжающего стимуляцию — феномен, который обозначается как 'desensitization'. Такие механизмы оперируют какна уровне рецепторов, так и на ниже стоящих уровнях, напр., на уровне G белков.
Быстрое уменьшение функции рецепторов обычно контролируется фосфорилированием рецепторов, которое обеспечивается second-messenger kinases (напр., protein kinase A (PKA) и protein kinase C (PKC)), или отдельным семейством G-protein-coupled receptor kinases (GRKs).
Second-messenger kinase regulation.
PKA- и PKC-обеспечиваемое фосфорилирование рецепторов непосредственно отсоединяет рецепторы от их соотв. G белков и тем самым служит классической негативной регуляторной петлей обратной связи. Однако, они м. также обеспечивать и 'heterologous' формы десенсибилизации (desensitization), при которой активация киназы осуществляется с помощью одного типа рецепторов и это ведет к фосфорилированию и денсесибиолизированию др. рецепторов. PKA-обусловленное фосфорилирование рецептора продемонстрировано в случае β2-AR, при 'переключении' связи рецептора с Gs (что ведет к десенсибилизации) на усиленную связь с Gi. Это облегчает активацию связанных с Gi путей, таких как стимуляция внеклеточных сигналов, регулируемого киназой пути (ERK)/mitogen-activated protein kinase (MAPK). Некоторые др. рецепторы, такие как , также, по-видимому, подвергаются подобному PKA-обеспечиваемому 'переключению' ихr G-protein-coupling специфичности.
GRK-mediated regulation.
Наиболее распространенным механизмом регуляции активности 7TM-рецепторов является GRK–β-arrestin система. Она обеспечивает 'гомологичную' или агонист-специфическую денсенсибилизацию, т.к. активированная или агонистом-оккупированная конформация рецепторов фосфорилируется с помощью GRKs. GRK фосфорилирование способствует связыванию молекул arrestin с рецептором, это стерически ингибирует дальнейшие взаимодействия между рецептором и G белком. GRKs кодируются небольшим семейством из 7 генов. известна также как rhodopsin kinase, a известна как β-adrenergic receptor kinase. Др. отличающиеся от и двух retinal enzymes, GRK1 и , GRKs широко распространены и, по-видимому, регулируют большие, перекрывающиеся наборы (portfolios) рецепторов, хотя они и обнаруживают некоторую специфичность в выборе рецепторов.
Несколько факторов контролируют активность киназ в отношении рецепторов. Прежде всего это активированные конформации самих рецепторов, которые аллостерически активируют энзимы. Важны также различные механизмы, с помощью которых киназы ассоциируют с плазматическими мембранами. Сюда входит взаимодействие prenylated Gβγ субъединиц с GRK2 и ; farnesylation of GRK1; и palmitoylation of GRK4 и . Еще один уровень регуляторной сложности добавляется тем фактом, что PKA и PKC м. фосфорилировать и активировать GRK2, возможно за счет обеспечения ее Gβγ-опосредованной ассоциации с мембраной.
Имеется 4 arrestin гена. 2 (visual arrestin и cone arrestin) экспрессируются исключительно в сетчатке и 2 — обозначаемые как (arrestin-2) и (arrestin-3) — экспрессируются повсеместно в др. тканях. β-arrestin-1/arrestin-2 и β-arrestin-2/arrestin-3 обнаруживают определенные предпочтения к разным рецепторам. Фосфорилирование рецепторов устранется с помощью phosphatases. которые локализуются во внутриклеточных пузырьках, к которым переносятся рецепторы после стимуляции и десенсибилизации. Во многих случаях β-arrestins играют центральную роль в координации процессов, которые связаны с интернализацией рецепторов.
Получены нокаутные животные, у которых различные GRK и arrestin гены инактивированы с помощью . В соответствии с физиологической важностью этих регуляторных систем, все такие животные обнаруживали сверхчувствительность к различным 7TM-рецепторами-обеспечиваемым процессам (Табл. 2).
Further mechanisms of desensitization.
Различные др. механизмы также вносят вклад в подваление передачи сигналов рецепторами перед лицом продолжающейся стимуляции. На уровне рецепторов, это деградация рецепторов, которая часто осуществляется в лизосомах, или динамическая регуляция транскрипции и трансляции рецепторных генов. Эти процессы в целом опрерируют в течение продолжительных периодов времени (часов) по сравнению с более быстрыми регуляторынми событиями, которые связаны с фосфорилированием рецепторов (от секунд до минут).
Передача сигналов от рецепторов м. также регулироваться на пост-рецепторных уровнях. Установлено, что семейство RGS белков, которые служат в качестве (GAPs) для гетеротримерных G белков. Семейство состоит из примерно 25 членов, каждый из которых содержит характерный RGS-homology домен примерно в 130 аминокислотных остатков. Разные члены семейства обнаруживают избирательность к разным G белкам и ,в некоторых случаях, даже к определенным рецепторам, хотя механизмы подобной избирательности неизвестны. RGS белки увеличивают скорость гидролиза ГТФ, так что они м. ускорять деактивацию системы, как только стимуляция затухает или подавлять передачу сигналов при сохранении стимуляции. Физиологическая роль таких белков в регуляции передачи сигналов от рецепторов, однако, слабо охарактеризована. Нокаут , который кодирует белок зрительной системы, четко ослабляет деактивацию светом-активированного родопсина, а нокаут в основном сказывается на активации Т-клеток, беспокойстве и агрессивности самцов. Возможно, что функциональное перекрывание (redundancy) RGS белков (напр., имеется, по крайней мере 10 форм, в сердце) будет осложнять попытки выяснить их физиологическую роль.
Orphan receptors
Клонирование 7TM рецепторов нуждается или в очищении рецепторов или в использовании прямых expression-cloning подходов. Однако, большинство рецепторных кДНК клонов обнаружено по их сходству с др. известными рецепторами. Многие рецептор-подобные последовательности, которые спариваются со своими эндогенными лигандами, обнаруживаются при таких поисках. Так было выявлено почти 200 'orphan' рецепторынх последовательностей у человека, осталось относительно немного эндогенных лигандов, чьи рецепторные партнеры еще неидентифицированы. Т. наз. 'reverse pharmacology' подходы используются для идентификации новых пептидов и низкомолекулярных лигандов для орфановых рецепторов, это иногда проливат свет на физиологию, которая регулируется такими рецепторами.
Самый первый orphan 7TM рецептор, названный , был среди первых клонированных 7TM-рецептор-подобных последовательностей и был идентифицирован благодаря его высокому сходству с β2-AR. Далее было установлено, что G21 не является β1-AR, а является скорее 5-hydroxytryptamine (serotonin) рецептором, 5HT1A рецептором. Достигнуты определенные успехи в понимании биологии 'true' orphan рецепторов — это рецепторы, для которых неизвестен функциональный лиганд скорее, чем рецепторы, которые по каким-либо причинам неспособны быстро соединяться со своими уже известными лигандами.
Orphan рецепторы м.б. рассортированы на группы. Имеется семейство orphan, а также extreme orphans, которые отличны от любых др. рецепторов. 'De-orphanizing' orphan рецепторы (Box 1>) приобрели важное значение благодаря их терапевтическому потенциалу. Успехи orphan 'adoptions' в последние годы связаны и с идентификацией orexins/hypocretins, ghrelin (growth hormone releasing peptide) и в качестве эндогенных лигандов orphan
7TM рецепторов; идентификацией т. наз. (таких как β-phenylethylamine, tyramine и octopamine) в качестве агонистов подсемейства adrenergic/serotonergic-подобных orphan рецепторов; с неожиданной идентификацией insulin-подобного гормона relaxin в качестве активатора gonadotropin-подобного orphan 7TM рецептора; и недавнее подтверждение Bam22 пептида гена как активного нейропептида, который стимулирует орфановый 7TM рецептор. Доказательство, что эти эндогенные субстанции действуют как активаторы 7TM рецепторов, быстро накапливаются. Идентификация лигнадов для остальных орфановых рецептров будет также осуществлена.
Receptor internalization
Вместе с открытием, что воздествие агонистов на 7TM рецепторы ведет к активации передачи сигналов рецепторами и денсенсибилизации рецепторов, было установлено, что такое действие агонистов ведет и перераспределению рецепторов с клеточной поверхности в результате эндоцитоза — известного также как интернализация или секвестрация (Рис. 2). Было цустановлено, что интернализация способствует resensitization рецепторов и позитивно регулирует передачу сигналов рецепторами. Несколько отличающихся путей описано для интернализации рецепторов. Это и интернализация посредством -покрытых ямок, или даже непокрытых пузырьков.
Caveolae-mediated receptor internalization.
Кавеолы являются флаконо-образными инвагинациями мембран, которые богаты кавероиновыми белками и холестеролом. Механизмы, с помощью которых 7TM рецепторы направляются в кавеолы, еще неизвестен, но агенты, которые разрушают кавеолы предупреждают и интернализацию ETB endothelin рецепторов и VIP рецепторов.
Интересным свойством кавеол является то, что многие важные компоненты передачи сигналов 7TM-рецепторов — включая и некоторые G белки и adenylyl cyclases — локализуются в кавеолах, это указывает на то, что кавеолы м. функционировать как липидные платформы (rafts), которые компартментализуют передачу сигналов, сводя вместе разные компоненты сигнального каскада.
Internalization, clathrin-coated pits and β-arrestin.
Хорошо охарактеризован механизм интернализации 7TM-рецепторов для β-arrestin-зависимой интернализации рецепторов. который осуществляется посредстом clathrin-покрытых пузырьков. β-arrestins обеспечивают этот процесс путем непосредственного взаимодействия не только с agonist-occupied, фосфорилированными рецепторами, но и с двумя компонентами clathrin-coated-pit кухни (machinery) — с тяжелой цепью самого клатрина и с β>2-adaptin субъединицей клатрина, . Это скоординированное взаимодействие β-arrestin с обоими clathrin и AP-2, а также с phosphoinositides (компонентами внутреннего листка клеточной мембраны), мишенями для 7TM рецепторов, необходимо чтобы найти покрытые клатрином ямки на клеточной поверхности. Эти ямки затем стягивают клеточную поверхность в результате действия большой GTPase , и рецепторы или подвергаются быстрому рециклингу, направляемые в большие где медленно recycled, или деградируются лизосомами (Рис. 2). Первоначально полагали, что β-arrestin участвует в de novo формировании покрытых клатрином ямок. Но теперь очевидно, что β-arrestins просто направляет рецепторы в пре-формированные мки на клеточной поверхности.
Стало очевидным, что β-arrestins также дифференциально регулируют перенос 7TM рецепторов. Некоторые рецепторы подвергаются быстрому рециклингу (восстановлению), др. восстанавливаются более медленно, а некоторые не восстанавливаются совсем. β2-AR один из примеров быстро рециклирующего рецептора. β-arrestin-2 транслоцируется с большей готовностью на эти рецепторы, чем β-arrestin-1, и ассоциация β-arrestin с рецептором более преходяща, заканчивается сразу же после того как рецептор интернализируется на или рядом с клеточной поверхностью. В случае медленно восстанавливающихся рецепторов, таких как , и β-arrestin-1 и β-arrestin-2 транслоцируются на рецепторы и β-arrestins остаются ассоциированными значительно дольше (до 4 ч) в больших эндо сомах, прежде чем рецепторы, наконец, подвергнутся рециклингу.
Очевидно, что β-arrestins выполняют и дополнительные роли в регуляции интернализации 7TM-рецепторов посредством своих взамиодейстуий с дополнительными компонентами machinery эндоцитоза. Напр., β-arrestin функционирует в качестве adaptor/scaffold, который связывает белки, такие как нерецепторная тирозин киназа c-Src. Взаимодействие β-arrestin c c-Src регулирует интернализацию рецепторов, путем обеспечения фосфорилирования тирозина в dynamin. Мутантный c-Src не м. взаимодействовать с β-arrestin, также как и мутантный dynamin не м.б. фосфорилирован по тирозину с помощью c-Src, функционируя как доминантно-негативный ингибитор клатрином-обеспечиваемой интернализации.
β-arrestin and ubiquitylation.
Важно, что β-arrestin регулирует интернализацию и деградацию 7TM-рецепторов посредством нового механизма, связанного с ubiquitylation. Ubiquitylation это посттрансляционная модификация, при которой добавляется — один или несколько — к лизиновым остаткам в белке-мишени. in the target protein. Считалось, что ubiquitylation в основном направляет белки в 26S для деградации. Теперь известно, что она важна для регуляции интернализации некоторых мембранных белков. Ubiquitylation нуждается в системе из трех энзимов: a ubiquitin-activating enzyme (); a ubiquitin-carrying enzyme ();и в ubiquitin ligase (). β-arrestin-2 непосредственно взаимодействует с ubiquitin ligase mouse double minute 2 () и др., еще не установленной лигазой. Эти взаимодействия ведут к ubiquitylation и β2-AR и самого β-arrestin. Ubiquitylation β-arrestin регулирует интернализацию β2-AR, n/r/ блокирование этого процесса предупреждает интернализацию β2-AR/
β-arrestins and vesicle budding.
β-arrestins кроме того модулируют интернализацию рецепторов посредством взаимодействий с белками, которые важны для отпочковывания пузырьков.Сюда входит N-ethylmaleimide-чувствительный фактор ()и семейство малых GTP-связывающих белков, которые регулируют отпочковывание пузырьков за счет рекрутирования покрывающих пузырек белков, включая COP coatomers. β-arrestin взимодействуют с ARF6, а также с его nucleotide-exchange белком, (ARNO), агонист-зависимфым способом. Интересно, что GRK2 взаимодействует с GRK interactor (GIT), который является ARF GAP. Затем, возможно, локализация GRK2 и β-arrestin на рецепторах будет приводить в тесную близость все компоненты, необходимые для nucleotide cycling of ARF6, который необходим собственно для переноса рецепторов.
Также как рекрутирование β-arrestins для интернализации и рециклинга так и сами рецепторы м. взаимодействовать с белками. важными для интернализации и рециклинга. Два примера этого β2-AR который, посредством остатков на своем С-хвосте, взаимодействует непосредственно с NSF, и взаимодействие с небольшим GTP-связывающим белком .
Избыточная экспресссия NSF в клетках, экспрессирующих β2-AR, ведет к увеличению фракции рецепторов, которые интернализируются, и способствует быстрому возвращению рецептров на клеточную поверхность сразу после удаления агонистов. Интересно, что экспрессия доминантно-негативной формы Rab5 не блокирует интернализации рецептора, но блокирует перенос рецепторов в большие эндосомы.
Во многих случаях β-arrestin-зависимая интернализация является необходимой для последующего подавления рецепторов — агонистом-индуцированной потери общего количества экспрессирующихся рецептров. В клетках, в которых отсутствуют и β-arrestin-1 и β-arrestin-2, как интернализация, так и подавление β2-AR блокированы. Кроме того для подавления β2-AR необходима ubiquitylation рецепторов. β2-AR, у которых отсутствуют все потенциальные сайты для ubiquitylation, хотя и интернализуются нормально,но не подавляются, возможно. из-за того, что рецепторы не попадают в лизосомы. Скорее всего, для хемокинового рецептора, clathrin-обеспечиваемый эндоцитоз является пререквизитом для ubiquitin-зависимой лизосомной сортировки. Предложена модель, в которой β-arrestin, путем взаимодействия с эндоцитотическими белками, а также с убиквитин лигазой, orchestrates receptor fate, управляет интернализацией, а также или рециклингом или деградацией.
Scaffolding and compartmentalization
За пределами классических примеров передачи сигналов 7TM-рецепторами, которая осуществляется через G-protein-засисимую активацию эффкторов, передача сигналов 7TM-рецепторов во многих случаях использует взаимодействия с адапторными и . Эти адапторные/поддерживающие белки облегчают взаимодействие рецепторов с их эффекторами, гарантируя специфичность в активации нижестоящих сигнальных каскадов, и обеспечивая соответствующую субклеточную локализацию этих сигнальных комплексов.
Некоторые из этих адапторных/поддерживающих белков облегчают взаимодействие 7TM рецепторов с компонентами классических каскадов вторичных мессенджеров. Напр., некоторые A-kinase anchoring proteins (AKAPs) — которых свыше 50 — связывают 7TM рецепторы с нижестоящими эффекторами, включая PKA и G белок Gα12. Два из этих AKAPs — и AKAP250 — взаимодействуют непосредственно с β2-AR. Взаимодействие AKAP79 с β2-AR усиливает фосфорилирование рецепторов и способствует передаче сигналов ERK/MAPK с помощью этих рецепторов, тогда как AKAP250 усиливает десенсибмлизацию рецепторов. Вновь открытый AKAP, , связывает Gα12 семейство гетеротримерных G белков непосредственно с малым GTP-связывающим белком RhoA. Этот AKAP избирательно взаимодействует с Gα12 и RhoA, и является сам RhoA-селективным GEF. Стимуляция клеток с помощью (LPA) активирует Gα12, который в свою очередь активирует AKAP-Lbc, и это ведет к обмену ГДФ на ГТФ на RhoA и последующему образованию . Пока неизвестно, может ли AKAP, подобно AKAP79 и AKAP250 взаимодействовать непосредственно с LPA рецепторами (, или ).
Имеется несколько др. примеров адапторных/поддерживающих белков, которые связываются с 7TM рецепторами на классическом пути вторичных мессенджеров. У Drosophila melanogaster, напр., , большой поддерживающий белок с несколькими , взаимодействет с родопсином, G белком, phospholipase C, PKC и кальциевыми каналами .
Итак, все белки в классических Gq-coupled каскадах вторичных мессенджеров соединяются вместе и это без сомнения облегчает быструю передачу сигналов, которая необходима для зрения у мух.
Поддерживающий белок млекопитающих, который сводит вместе компоненты классических каскадов вторичных мессенджеров, опосредует свое действие через семейство Homer белков. Взаимодействие с metabotropic glutamate рецептором сводит с ним ряд дополнительных белков, включая и некоторые поддерживающие белки и inositol triphosphate (InsP3) рецепторы. Т.к. metabotropic glutamate рецепторы и являются 7TM реыепторами, связанными с активацией phospholipase C, то это взаимодействие м. усиливать эффективность, с которой сигналы передаются с клеточной поверхности внутрь клетки.
Bridging receptors with other proteins.
Некоторые др. рецептор-белок взаимодействия обеспечивают неклассическую передачу сигналов рецепторами. Сюда входит прямое взаимодействие β3-AR с нерецепторной тирозин киназой c-Src через богатый пролином Src-homology-3 ()-взаимодействующий домен в третьей внутриклеточной петле рецептора.
Это взаимодействие сводит c-Src с рецептором β-arrestin-независимым способом и ведет к передаче сигналов ERK/MAPK. Еще пример прямого взаимодействия рецептора с сигнальным белком - это ассоциация angiotensin 1A рецептора — посредством его С-хвоста — с Janus kinase, JAK2. Это взаимодействие ведет к активации транскрипции фактора signal transducer and activator of transcription, STAT.
Описано множество др. взаимодействий между добавочными белками и 7TM рецепторами. Сюда входят PDZ-опосредованные взаимодействия, такие как взаимодействие β2-AR c sodium–hydrogen exchanger regulatory proteins (NHERF)1 и и взаимодействие β1-AR c PSD-95 (a
post-synaptic-density scaffolding protein). В дополнение к adrenergic рецепторам, некоторые metabotropic glutamate рецепторы взаимодействуют с PDZ-domain-содержащими белками. Напр., взаимодействует с PKC через PDZ-содержащий белок, который взаимодействет с C Kinase (PICK). Биологическое значение этих взаимодействий изучено плохо. Однако, большинство из этих взаимодействий, по-видимому, усиливают специфичность рецепторных сигнальных каскадов. Хотя многие из этих взаимодействий нуждаются в активации агонистом потребность в купировании с G-белком не установлена. yet known. Вообще-то эти взаимодействия вредставляют собой G-белок-iнезависимую передачу сигналов, котора м. помочь объяснить, как достигается специфичность передачи сигналов 7TM-рецепторами — т.е., как стимуляция двух разных рецепторов, которые активируются одним и тем же лигандом и связаны с одним и тем же G белком, м. приводить в разным физиологическим исходам.
b;-arrestin as an adaptor/scaffolding protein.
Имеются также адапторные/поддерживающие белки более общего типа, которые м. взаимодействовать со многими 7TM рецепторами, чтобы обеспечить биологический эффект. Среди наиболее охарактеризованных scaffolds β-arrestin. Помимо их роли в интренализации рецепторов β-arrestin оказывается одним из многих белков, которые служат в качества адапторных/поддерживающих белков для обеспечения 7TM-рецепторной передачи сигналов.
Первым примером расширенной роли β-arrestins послужило открытие, что β-arrestin-1 взаимодействует с c-Src. Взаимодействие β-arrestin–c-Src облегчает β2-AR-зависимую активацию каскада ERK/MAPK. Взаимодействия между β-arrestin и членами семейства c-Src используются для облегчения транспорта глюкозы. обеспечиваемого endothelin-рецепторами за счет стимуляции транслокации glucose transporter GLUT4и облегчения -стимулируемого высвобождения гранул.
Кроме того, β-arrestin функционирует в качестве адапторного/поддерживающего белка, который ведет к активации и субклеточному таргетингу двух разных MAPK каскадов. Известно, что β-arrestin v/ взаимодействовать по крайней мере с тремя киназами в двух разных MAPK каскадах — ERK/MAPK каскаде и c-Jun amino-terminal kinase 3 () каскаде (Box 2; Рис. 3). β-arrestins сводят по крайней мере три киназы и в JNK3 и ERK/MAPK каскадах в тесную близость др. с др. и с рецепторами и это облегчает перенос информации от рецептора его эффекторам. Однако, вместо направления MAPK в ядро β-arrestin-обеспечиваемое scaffolding MAPK каскада ведет к цитозольному сохранению активной киназы. Итак, после активации рецепторов β-arrestin обеспечивает интернализацию рецепторов и ко-локализацию рецепторов, β-аррестина и компонентов MAPK каскада в больших эндоцитотиыеских пузырьках. Эта локализация MAPK в цитозоле усиливает общую активацию MAPK, но ингибирует традиционнцю передачу сигналов в ядро этими киназами. В случае ERK/MAPK каскада, это цитозольное хранение активных ERK/MAPK предупреждает стимулируемую агонистом пролиферацию клеток. Однако, этот β-arrestin-scaffolded путь только один из многих путей, с помощью которых 7TM рецепторы м. активировать MAPK каскады (Рис. 3), а клеточное содержимое является критическим для предопределения, какой из этих путей будет использован.
Будет обнаружено множество 7TM-receptor scaffolds, но пока только β-arrestin MAPK scaffolds прекрасно иллюстрирует характеристики поддерживающих белков. Во-первых, они усиливают общую активацию белков в каскаде. Во-вторых, они гарантируют специфичность, сводя только те белки, которые д.б. активированы рядом др. с др. Напр., JNK3, имеет две дополнительные JNK изоформы, и . β-arrestin-2 облегчает только активацию JNK3, хотя JNK1 и JNK2 м.б. активированы теми же самыми вышестоящими киназами. В-третьих, эти scaffolds компартментализуют сигнальные каскады, регулируя биологические эффекты белков, приводя их в тесную близость к их мишеням. С помощью такой поддержки (scaffolding) этиx MAPKs, β-arrestin приводит активность и субклеточную локализацию активной MAPK под контроль рецепторов.
7TM-receptor dimerization
Считается, что одиночный рецепторный 7TM белок на клеточной поверхности активируется в результтае связывания одного агониста лиганда и такой активированный лигандом рецептор м. затем активировать множество G белков в одно и то же время. Эта модель подтверждается в иследованиях, при которых очищенный рецепторный белок (выявляемый по связыванию лигнада) и очищенный G белок вместе адексатно воспроизводятагонистом стимулируемое высвобождение ГДФ и связывание ГТФ, что является признаком активации G-белка с помощью рецептора.
В др. клеточных сигнальных моделях, функция рецепторов клеточной поверхности осуществляется в качестве димеров и даже высших мультимеров. При передаче сигналов с помощью рецепторной тирозин киназы, напр., димерные рецепторы являются важными для функции, т.к. каждый мономер фосфорилирует др. мономер во время стимуляции лигандом 'autophosphorylation', которая ведет к полностью активному состоянию киназ.
Выявлены примеры, когда 7TM рецепторы абсолютно необходимы для гетеродимерного взаимодействия, хотя их и немного. Затем большинство 7TM рецепторов присутствует в виде гетеродимеров с варьирующими эффектами на функцию рецептров. Эти случаи отличаются тем, что димеризация не является существенной для функции рецептров, хотя и м. ее модулировать. Напр., в случае κ и δ , гетеродимеризация усиливает агонистом индуцировнное подавление adenylyl cyclase,а также изменяет фармакологию рецепторов.
В случае рецепторов γ-aminobutyric acid (GABA)B установлено, что димеризация существенна для функции. В отличие от большинства 7TM рецепторов, GABAB рецепторы являются облигатными гетеродимерами из GABABR-1 и GABABR-2 субъединиц. Каждая субъединица является членом семейства C рецепторов 7TM. Субъединица GABABR-1 имеет лиганд-связывающий сайт, но если этот белок экспрессируется один, то он не достигает клеточной поверхности. Субъединица GABABR-2 делает это возможным, но сама не связывает GABA. Субъединицы B1 и B2 ассоциируют посредством coiled-coil взаимодействия своих цитоплазматических С-терминальных доменов и субъединица B2 помогает субъединице B1 достигать клеточной поверхности (Рис. 4). Аллостерические взаимодействия между B1 и B2 субъединицами необходимы для опитимальной передачи сигналов GABAB рецепторов G-белкам.
Вкусовые рецепторы, распознающие сахара и аминокислоты, также нуждаются в гетеродимеризации рецепторов 7TM семейства С. Ощущение сладкого нуждается в ко-экспрессии вкусового рецептора 1, member 2 () и вкусового рецептора 1, member 3 (), тогда как ощущение umami (аминокислот) нуждается в ко-экспрессии и T1R3 рецепторных белков. Эти рецепторные димеры м.б. ко-иммунопреципитированы, но связана ли эта димеризация с переносом или является первичной структурной, неизвестно.
Сходная ситуация и у (CLRL), семейство B рецепторов. Если экспрессируется в одиночку, то, по-видимому, нефункционален, но если ко-экспрессируется с членом семейства белков receptor-activating-modifying (RAMP), то CLRL становится функциональным рецептором; с , он функционирует как рецептор calcitonin-gene-related-peptide (CGRP), тогда как с или , он становится рецептором adrenomedullin. В отличие от GABAB рецепторов, его ассоциированная субъединица не напоминает сам 7TM рецептор. RAMP белки маленькие, с одиночным трансмембранным доменом. Очевидно, что ассоциация с RAMP белком управляет соотв. транспортом в плазматическую мембрану CLRL рецептора и модифицирует его фармакологию. Не выявлено участия RAMP белков в функционировании или доставе на клеточную поверхность др. 7TM рецепторов и др. RAMP-подобных белков не выявлено.
Higher-order-oligomer formation?
Помимо димеризации описаны случаи ассоцииации многих типов 7TM-рецепторов в структуры высшего порядка. Это установлено с помощью функциональной комплементации двух неактивных мутантных рецепторов по ко-экспрессии, совместному переносу после стимуляции одного из них, по ко-иммунопреципитации по разному нагруженный (tagged) экспрессирующихся рецепторов и по близости рецепторных белков на клеточных мембранах (fluorescence resonance energy transfer). Разработаны структурные модели димеров из двух соседних 7TM рецепторов, которые складываются в отдельные рецепторные пучки, которые примыкают др. к др. или в сцепленные пучки, в которых образуется связывающий карман из трансмембранных спиралей разных рецепторных белков.
Future perspectives and conclusions
Несмотря на многочисленные препятствия в получении кристаллической структуры мембранных белков, структура неактивного родопсина все же установлена, это позволяет надеяться на успехи в этом направлении в отношении др. 7TM рецепторов. Важно определить, какие структурные отличия существуют между активной и неактивной конформациями этих рецепторов, а также структуру рецепторных комплексов с партнерскими белками, такими как гетеротримерны G белки или аррестины. Необходимо получить трансгенных мышей с нокаутом 7TM рецепторов это позволит пролить свет на разнообразие физиологических действий этих рецепторов.
Исследования передачи сигналов 7TM рецепторами ведут нас к пониманию сложных сигнальных сетей, в которых многие пути взаимосвязаны с помощью белковых компонентов, которые общие для некоторых из них. Комбинаторная сложность таких сетей экстраординарна и нужны новые подходы для их изучения.
Исследования адпторных и поддерживающих белков уже показали важную роль таких молекул в оркестровке определенных сигнальных активностей некоторых 7TMрецепторов. Пока неясна стпень, в какой такие механизмы м. действовать как альтернативные классической передаче сигналов, обеспечиваемой G-белками, или они могут просто модулировать или тонко регулировать сигналы, которые передаются непосредственно через гетеротримерные G белки. Растут доказательства в пользу первой гипотезы — напр.,
у слизистой плесни Dictyostelium discoideum, персистируют несколько сигнальных путей, даже когда передача сигналов черех G-белки нарушена. Эти пути включают приток кальция, активацию ERK/MAPK и активацию транскрипционных факторов.
Имеются сотни орфановых рецепторов, для большинсва неизвестны их природные лиганды, не говоря уже о 'non-traditional' 7TM рецепторах, таких как семейство, для которых лиганды (Wnts) идентифицированы, но их связь с G белками все еще под вопросом.
