Phyllis I. Hanson, Sidney W. Whiteheart Nature Reviews Molecular Cell Biology6, No. 7, 519-529 (2005); doi:10.1038/nrm1684
Семейство AAA+ (ATPases associated with various cellular activities) является крупной и функционально разнородной группой энзимов, которые способны вызывать конформационные изменения у широкой группы субстратных белков. Характерным для семейства признаком является структурно законсервированный АТФазный домен, которые образуют ансамбль в виде олигомерного кольца, и подвергаются конформационным изменениям во время циклов связывания и гидролиза нуклеотида. Here, we review the structural organization of AAA+ proteins, the conformational changes they undergo, the range of different reactions they catalyse, and the diseases associated with their dysfunction.
Характерным признаком AAA (ATPases associated with various cellular activities) семейства белков является в 200-250 аминокислот ATФ-связывающий домен (AAA домен). Этот домен содержит , а также несколько др. мотивов, которые отличают его от классических NTPases. AAA домены прикрепляются к различным др. доменам и в некоторых случаях взаимодействуют с адапторными белками, чтобы генерировать структурное и функциональное разнообразие внутри семейства. Мотивы, которые используются для определения оригинального AAA семейства недавно были рассмотрены в комбинации со структурной информацией и это привело к тому, что были добавлены дальнейшие члены, которые сегодня обозначаются как AAA+ семейство1,2.
В обзоре впервые описаны структурные сходства и различия среди AAA+ белков, чтобы подчеркнуть области и остатки, которые являются критическими для всех членов семейства. Мутации этих остатков представляют механистическое проникновение в суть и продуцируют пригодные реагенты, которыми может тестироваться функция AAA+-белка. Во-вторых, мы обсудим примеры конформационных изменений этих энзимов в результате связывания нуклеотидов и гидролиза - изменений, которые в конечном счете ответственны за их функцию. В-третьих, мы рассмотрим типы реакций, которые осуществляются AAA+ белками. Мы надеялись подчеркнуть функциональное разнообразие семейства и упростить это разнообразие, сфокусировавшись на унифицирующей концепции, что большинство, если не все, AAA+-катализируемые реакции ассоциированы со значительным конформационным ремоделированием субстратных белков. Наконец, мы обсуждаем растущий список генетических болезней, которые ассоциированы с дисфункцией AAA+-белков (др. rev. AAA+ белков, Refs 3-5).
Structural elements of the AAA+ domain
Сканирование геномных баз данных с использованием консенсусных последовательностей показало, что AAA+ белки присутствуют во всех царствах. Arabidopsis thaliana имеет наибольшее разнообразие с ~140 AAA+ белками. Большинство др. эукариот имеет в семействе 50-80 членов. Недавние исследования организовали семейство в несколько подгрупп на базе сходства последовательностей1,6,7 и структур2. Законсервированные признаки AAA+ домена показаны на Рис. 1, со спиралями и нитями, обозначенными Iyer and colleagues2. На базе кристаллических структур (известно >15), the AAA+ состоит из двух субдоменов - N-терминальной α/β и C-terminal α-спирального субдомена (Рис. 2). N-терминальный субдомен клинообразной формы и имеет β-покрытие из параллельных нитей, которые расположены в β5-β1-β4-β3-β2 последовательности на этом стержне (core) (Рис. 1). Инсерция β4 между β1 и β3 отличает AAA+ домены от др. нуклеотид-связывающих доменов, а отсутствие др. нитей, соседствующих с β2 также является уникальным2.
Разнообразие в AAA+ доменах обусловлено частично количеством и положением пяти или более α-спиралей, которые соединяют нити этого центрального β-покрытия. Добавочное разнообразие исходит от инсерций между нитями (напр., helical I домен в, который связывает субстраты8,9). С-терминальный субдомен состоит из нескольких α-cgbhfktq (α5-α8)2 и является важным отличительным признаком AAA+ семейства по сравнению с др. нуклеотид-связывающими белками. Этот субдомен располагается выше широкого конца N-терминального клина и формирует частичное покрытие поверх нуклеотид-связывающего сайта (Рис. 2). Двухдоменовая архитектура AAA+ доменов лучше законсервирована, чем подлежащие последовательности10.
N конец домена AAA+ формируется с помощью остатков, которые располжены непосредственно от N-конца до спирали 0 (Refs 2,10). Мотив консервативных последовательностей в этой области называется N-linker identifies AAA+ белков и позволяют подразделить их на два подсемейства10 (Рис. 1,2). Одно подсемейство имеет последовательность glycine-glycine в своём N-linker, тогда как др. имеет гидрофобный остаток, сопровождаемый glycine. Эта область вносит вклад в adenine-ring-связывающий карман и является частью linker, который соединяет AAA+ домены с другими (не-AAA+) доменами. Анализ молекулярной динамики показал, что N-linker гибким и может, следовательно, распространять нуклеотид-зависимые изменения на др. части AAA+ белка10.
Walker-A b -B мотивы являются интегральными частями AAA+ ATФ-связывающего сайта1 (Рис. 1,2). P-петля Walker-A мотива (между β1 и α1) непосредственно взаимодействует с фосфатами из ATФ. Один изспецифических остатков P-петли - остаток лизина в консенсусной последовательности GXXXXGK[T/S] (где X любая аминокислота) - является критическим. Его мутации обычно элиминируют связывание нуклеотида и инактивируют AAA+ белок (Table 1). Мотив Walker-B (от β3 до начала α3) также формирует контакты с нуклеотидом, а кислые остатки его последовательности hhhhDE (h представляет гидрофобную аминокислоту) являются критическими для ATФase активности. Остаток aspartate может координировать Mg2+, который необходим для гидролиза ATФ, а остаток glutamate, как полагают, активирует воду для реакции гидролиза2. Мутации этого glutamate блокируют гидролиз нуклеотида, но не связывание (Table 1). Т.к. ATФ (скорее, чем AДФ) необходим для связывания субстрата большинством, если не всеми AAA+ белками, то мутации в Walker-B мотиве использовались для создания 'substrate traps' , которые бы связывали, но не могли бы высвобождать субстраты. Такие мутации явились эффективным инструментом для проверки функции AAA+ белков11-13.
По своей наиболее узкой базирующейся на последовательностях классификации4,14, классические AAA белки содержат консервативную область, которая распространяется на C-терминальную часть из Walker-B мотива и называется second region of homology (SRH; Рис. 1,2). SRH состоит из части β4, всей α4 и петли к β5. Последовательность SRH законсервирована не очень сильнро у всех AAA+ белков, но присутствуют одинаковые структурные характеристики2. SRH содержит два специфических структурных элемента, на его концах (sensor 1 и arginine пальчики (Рис. 1); см. ниже), которые, как предполагают, координируют гидролиз нуклеотида и конформационные изменения между субъединицами15. SRH ответственен за некоторые уникальные свойства семейства AAA+.
Sensor 1, который присутствует во всех AAA+ белках, обнаруживается на N конце SRH в петле. соединяющей β4 c α4 (Рис. 1,2). Благодаря конформации стержневого β-sheet, остатки sensor-1 - в частности, наблюдаемые полярные остатки - физически располагаются между мотивами Walker-A и -B и взаимодействуют с важными Walker-B элементами и с γ-phosphate связанного ATФ (Рис. 2). Мутации полярных аминокислот в sensor 1 (такие как T394 у дрожжей ) нарушают гидролиз нуклеотида16 (Table 1). На др. конце SRH (в петле между α4 и β5; Рис. 1) имеются arginine пальчики, названные так из-за своего сходства с расположением аргининов в GTPase-activator белках, которые вставлены в GTP-связывающие сайты, чтобы способствовать гидролизу нуклеотида17. В известных структурах из AAA+ олигомеров, аргининовые пальчики из одной субъединицы составляют часть нуклеотид-связывающего сайта соседней субъединицы. Два аргининовых остатка присутствуют в качестве аргининовых пальчиков в классических AAA белках, но только один законсервирован во всех AAA+ белках. Мутации остатков аргининового пальчика, как было показано, затрагивают гидролиз нуклеотида и/или распространение зависимых от гидролиза конформационных изменений AAA+ гексамеров15 (Table 1).
Вблизи C-терминального конца домена AAA+ domain, в α-спиральном субдомене, имеется sensor 2 (Рис. 1,2). Его остатки также участвуют в связывании нуклеотида. Законсервированный sensor-2 arginine, вблизи начала α7, взаимодействует непосредственно с γ-phosphate из ATФ. Мутировав этот остаток негативно влияет на связывание и/или гидролиз нуклеотида15 (Table 1). Классические AAA белки обычно имеют alanine га местеэтого arginine, но др. заряженные остатки соседствуют с α7 (которая обозначается как спираль sensor-2). В AAA+ гексамере остатки от этой спирали находятся очень близко к заострённому концу Rossman складки в соседней субъединице (особенно к петле между α0 и β1; Рис. 3) и м. , следовательно, - как и SRH - играть роль в координации конформационных изменений между субъединицами. Мутации в sensor 2/α7 подтверждают роль этой области и в гидролизе АТФ, и в освобождении субстрата от складок18 (Table 1).
AAA+ энзимы собираются в олигомеры - обычно гексамеры - которые, по-видимому, являются биологически активной формой (Рис. 3). Гексамерная конфигурация обеспечивает AAA+ белкам уникальные свойства. Одно из них - это позиционирование АТФ-связывающих сайтов на сторонах между субъединицами голоэнзима. Это делает возможной прямую (SRH) и косвенную (sensor 2/α7) связи между нуклеотид-связывающими сайтами соседних субъединиц. Все гексамерные AAA+ белки имеют кроме того центральную полость или пору, которая выстлана остатками от каждой из субъединиц. Петля между β2 и α2 занимает большую часть поверхности поры19 (Рис. 1-3), a три законсервированных аминокислоты в этой петле (aromatic-hydrophobic-glycine) обеспечивают функционирование некоторых AAA+ белков. В частности, мутации в этих остатках влияют на связывание субстрата и его процессинг, не нарушая олигомеризации или, в большинстве случаев, активность ATФase20-24 (Table 1). Пора интересна, т.к. ряд AAA+ белков протаскивает свой субстрат через неё.
ATP-driven conformational changes
Ясно, что большинство AAA+ белков подвергается конформационным изменениям, которые сцеплены с связыванием и/или гидролизом АТФ, и что эти конформационные изменения передаются на субстратные белки. Хотя степень этих управляемых нуклеотидом конформационных изменений в целом определена недостаточно, всё-таки некоторые снимки энзимов в разных состояниях были получены. Одним из примеров является HslU, для которого Wang и др. изучили 8 доступных рентгеновских структур8,9,19,25 и описали 4 конформации AAA+ домена. Они отличаются в основном относительным положением N- и C-терминальных субдоменов. В холостом, не связанном с нуклеотидом состоянии, два субдомена наиболее удалены др. от др., тогда как в АДФ-связанном состоянии они находятся ближе всего. Эти различия, по-видимому, частично обусловлены нуклеотид-зависимыми перемещениями P-петли и соседних β-нитей (β1) и α-спирали α1). Связывание нуклеотида также затрагивается в зависимости от того, закрыта или открыта центральная пора гексамера HslU. Хотя мы не можем ещё обобщить, как происходят управляемые нуклеотидом конформационные изменения в др. AAA+ белках, но на базе консервации последовательностей в семействе, возможно допустить вероятность общего механизма конверсии связывания и/или гидролиза нуклеотида в физическую работу26.
Зависымые от нуклеотида структурные изменения также, по-видимому, распространяются на домены, которые сцеплены с AAA+ доменами. Одним из хорошо изученных примеров является . Каждый p97/VCP промотор состоит из двух тандемных AAA+ доменов и N-терминального домена (N-domain), который участвует в связывании субстрата и/или кофактора и эти промоторы собираются в гексамеры. p97 N-домен, как было показано, меняет свое положение в разных нуклеотид-связанных состояниях, используя несколько техник27-29. В ATФ- and АДФ-связанном состоянии N-домены оказываютс слишком мобильными, чтобы быть зафиксированными с помощью cryo-electron-microscopy анализа27. Однако, в присутствии переходного состояния, аналогичного ADP-AlFx, N-домены видны как дискретные уплотнения, которые расположены на верхушке гексамерного кольца, которое формируется с помощью AAA+ доменов. Недавняя проверка рентгеновской кристаллической структуры p97/VCP в 4-х разных нуклеотид-связанных состояниях подтвердила, что имеются существенные различия в относительном положении N-домена и AAA+ доменов28,30, и показала, что нуклеотид-зависимые изменения во взаимодействиях между N-доменом и α-спиральным субдоменом первого AAA+ домена контролируют эти движения28. Small-angle X-ray scattering измерения p97 в растворе также показали достоверные нуклеотид-зависимые изменения в положении N-доменов относительно гексамерных AAA+ колец p97/VCP29.
Functions of AAA+ proteins
AAA+ белки участвуют в ряде клеточных процессов, от деградации белков и репликации ДНК у всех организмов до эволюционно специфической активности, такой как у бактерий, глибов и растений и сли яния мембран, а также движения микротубулярных моторов у эукариот. По функциональным причинам существует мало доказательств, подтверждающих отделение классической AAA ветви семейства от огромного сверхсемейства AAA+, это приводит нас к тому, чтобы рассматривать AAA+ сверхсемейство как целое. Упрощенная идея, вытекающая из недавних механистических исследований, заключается в том, что все AAA+ белки оперируют за счёт конформационных изменений или ремоделирования в белках мишенях. Во многих случаях такое ремоделирование существенно нарушает структуру белка, чтобы обеспечить расправление (unfolding). Ниже мы рассмотрим основные категории AAA+-белками-обусловленные реакции - расправление складок для протеолиза, разборку белковых агрегатов и разборку белковых комплексов - и приведем примеры, которые предоставляют механистическую информацию о том, как субстраты распознаются и изменяются. Др. реакции, которые не рассматриваются здесь детельно, включают использование циклических конформационных изменений, чтобы генерировать однонаправленные движения (как в случае молекулярного мотора динеина, перемещающегося вдоль микротрубочек31), и реакции clamp загрузочного комплекса во время репликации ДНК32.
Protein unfolding and degradation
AAA+ белки являются критическими для протеолиза, в котором их роль заключается в разворачивании субстрата и подготовки его для дегративной камеры (degradative chamber) т.наз.33. Существует пять AAA+-содержащих протеолитических систем у бактерий (, , HslUV, и ) и эквивалентных систем у эукариот ( и сходных с бактериальными систем в органелах). Chambered proteases ответственны за большую часть деградации внутриклеточных белков. В большинстве систем AAA+ домен и протеаза кодируются разными полипептидами (ClpXP, ClpAP, HslUV и 26S proteasome); в др. обе активности придставлены одним полипептидом (, и mitochondrial AAA+ proteases). Детальные исследования ClpXP и ClpAP показали, как AAA+ белки осуществляют разворачивание (unfolding) белков (Рис. 4a).
ClpXP and ClpAP: chambered proteases in bacteria. является бочонком (barrel) с 1-2-nm порами на каждом из концов и состоит из двух соединенных колец, каждое из которых содержит семь протеолитических субъединиц 34. Проникновение в (через аксиальные поры) контролируется с помощью кольцеобразных гомогексамеров из AAA+ белков или , которые связаны с одним или обоими концами бочонка ClpP35,36. Законсервированные трипептидные последовательности (IGF) в петле, которая расположена в C-терминальном sensor 1 домена AAA+, являются критическими для связывания с ClpP37. Сродство этого взаимодействия модулируется также в зависимости от того, связана или нет ATФase с субстратом38. Каждая субъединица ClpX имеет оди AAA+ домен, тогда как ClpA имеет два. Функциональное значение наличия одного или двух AAA+ доменов для высвобождаемых субстратов в ClpP неизвестно. И ClpX и ClpA имеют ещё домен N-терминальнее своих AAA+ домена(ов). Он обозначается как N-домен его роль состоит в распознавании субстрата.
Substrate recognition by ClpX and ClpA. Тема, возникшая в результате исследований ClpX и ClpA, состоит в том, что короткие последовательности мотивов предопределяют субстраты для этих ассоциированных с protease энзимов. Эти последовательности мотивов распознаются непосредственно с помощью AAA+ белка и также (иногда преимущественно) адапторными белками, которые помогают высвобождать субстрат для AAA+ белка.
Лучше всего охарактеризован мотив для поставки субстрата для ClpX - это в 11 аминокислот тэг (AANDENYALAA), который кодируется с помощью small stable 10S RNA (ssrA) и добавляется к полипептидам, когда рибосомы остановлены39. Нагруженные ssrA полипептиды отсоединяются от рибосом и деградируются с помощью ClpXP (или ClpAP или FtsH). Деградация ssrA-меченных полипептидов с помощью ClpXP может быть усилена с помощью адапторного белка SspB, который соединяется как с меткой, так и N-доменом ClpX. Это позиционирует меченный субстрат вблизи ClpX поры5. Др. мотивы, которые направляют белки на деградацию с помощью ClpXP, были идентифицированы у Escherichia coli при проверке последовательностей белков, которые накапливаются в протеолитически неактивной ловушке ClpXP субстрата40. В ~60 заловленных белках (которые включают транскрипционные факторы, метаболические энзимы и реагирующие на стресс белки) идентифицировано пять общих ClpXP-targeting мотива. Все они локализуются на концах заловленных белков и богаты гидрофобными и основными аминокислотами. Дальнейшие уровни разнообразия среди ClpXP субстратов связаны с деградационными мотивами, которые экспонируются только при определенных условиях. Интересным примером этого являются два ClpX-распознающих мотива, которые внедрены в средине LexA транскрипционного репрессора и экспонируются только после повреждений ДНК41.
Чтобы понять, как AAA+ белки действуют на свои субстраты, д.б. идентифицированы расположения субстрат-связывающих элементов. N-домены ClpX и ClpA гибко присоединены к своим соответствующим AAA+ доменам42, и как предполагается, они оперируют как привязь для поставляемых субстратов с AAA+ доменами5. Однако, элементы в AAA+ доменах д. также выполнять фундаментальную роль в связывании субстрата, т.к. ClpA и ClpX, которые лишены своих N-доменов. продолжают обеспечивать деградацию субстратов43. Показано, что гидрофобные остатки в законсервированных поровых петлях (YVG) (Рис. 1-3) выполняют роль в ангажировании субстрата22 (Table 1). Др. элементы в AAA+ доменах также участвуют в связывании субстрата. Сюда входят C-терминальный α-спиральный субдомен - который обозначется в этой связи как домен 'sensor and substrate discrimination' (SSD)44 - и N-терминальные ~65 остатка AAA+ домена45.
Substrate processing by ClpXP and ClpAP. Что же делают ClpX и ClpA с субстратами? Расправление считается необходимым для перемещения полипептида субстрата через узкий вход в протеолитическую камеру ClpP. Эта активность приписывается AAA+ белкам, когда было установлено, что ClpA (а позднее и ClpX) функционируют независимо от ClpP в качестве хаперонов для ремоделирования белков46. Прямая демонстрация активности по расправлению (unfolding) этих энзимов получена в исследованиях, использовавших потерю флюоресценции, hydrogen/deuterium обмены и , чтобы показать, что ClpA или ClpX и ATA повышают скорость, с которой расправляется ssrA-меченный green fluorescent protein47,48.
В дополнение к расправлению субстратов AAA+ белки транслоцируют их в ClpP бочонки. Этот процесс зависит от АТФ и в случае ClpX, тратит 1-2 молекулы АТФ на остаток субстрата, поставляемого в ClpP49. Перемещение субстрата с наружной поверхности ATФase внутрь ClpP непосредственно наблюдалось с помощью электронного микроскопа35, и было показано в кинетических исследованиях, отслеживающих переход от tagged к untagged концам субстрата50.
Элегантные исследования взаимоотношений между термодинамической стабильностью белков и скоростью, с которой ClpXP деградирует их, пролили свет на то, как AAA+ белки меняют структуру белков. Неожиданно, не выявлено вообще корреляции между глобальной стабильностью белка, измеряемой in vitro с помощью чувствительности к денатурации, вызываемой теплом или расстворителем, и лёгкостью ClpX-катализируемого расправления и ClpXP-обусловленной деградацией49,51-53. Чтобы понять, почему это может быть, Matouscheck и др. изучали деградацию циркулярно permuted вариантов dihydrofolate reductase с ssrA тэгами, прикрепленными к разным структурным элементам. Они установили, что тип вторичной структуры, непосредственно соседствующей с деграционными тегами, коррелирует с эффективностью AAA+-катализируемого расправления белков52. В частности, dihydrofolate reductase с большей готовностью деградировала, когда ssrA tag был связан с экспонированной на поверхности петлёй или α-спиралью, чем когда он был соединен с β-нитью. Комплементарное исследование titin I27 иммуноглобулин-подобного домена показало, что дестабилизирующие мутации вблизи деградационного тэга увеличивают скорость деградации, тогда как сравнимые мутации где-либо ещё не увеличивают49. Всё это указывает на то, что ClpX активно расправляет свои субстраты путём дестабилизации структурных элементов, соседствующих с деградационными тэгами на субстрате.
Какие изменения в ассоциированных с протеазой AAA+ белках ответственны за расправление субстрата и и транслокацию? В целом это изучено плохо. Как упоминалось выше имеются управляемые нуклеотидом конформационные изменения в AAA+ доменах, а также в прикрепленных N-доменах. Наиболее детальные предположения о том, как эти конформационные изменения приводят к расправлению субстрата получены в структурных исследованиях HslU, которые были описаны выше. В частности, зависимые от нуклеотида различия в размере центральной поры и положении GYVG-содержащей β2-α2 петли поры, привели к предположению, что изменения в этой петле могут обеспечивать расправление и транслокацию19. Крупные изменения в относительном позиционировании N- и C-терминальных субдоменов также предположительно вносят вклад в расправление 25.Менее детализированные модели расправления с помощью ClpX предсказывают, что АТФ-управляемое протягивание субстрата через центральную пору ведет к его расправлению5,53. Недавние исследования гидролиза АТФ и денатурации субстрата с помощью ClpX показали, что имеются существенные вариации того, насколько ATA необходим для денатурации разных субстратных белков49. Это привело к идее, что ClpX работает с помощью повторного приложения постоянной ATФ-генерируемой силы к субстрату и только иногда эта сила приводит к распрямлению складок 5,49.
Extending the paradigm: the 26S proteasome. Принципы того, как ClpXP и ClpAP расправляют свои субстраты для деградации, возможно приложимы в целом к эукариотическим 26S proteasome, с менее разработанными уровнями регуляции и сложности (rev. Ref. 33). Сама protease (20S) образуется из 4-х колец вместо двух. Привратниковый (gatekeeper) комплекс (19S) состоит из одного кольца AAA+ белков (6 субъединиц, каждая кодируемая разным геном) которое обозначается как основание, и др. кольца из неродственных субъединиц, которое обозначено как крышка (lid). Основное отличие в деградации белка между эукариотами и прокариотами заключается в том, что белки, деградируемые у эукариот маркируются с помощью polyubiquitin меток33. Это переносит задачу по идентификации аномальных белков на систему клеточных ubiquitin-ligase. Ubiquitin-помеченные субстраты распознаются с помощью элементов 19S комплекса (или с помощью адапторных белков), deubiquitylated и затем направляются в камеру 20S protease для деградации. Успешная деградация субстратов с помощью proteasome также нуждается в присутствии неструктуированной области полипептида, которая функуионирует как иниационный сайт для деградации54. Как и с ClpA и ClpX, 19S крышка может оперировать независимо как хаперон, который распознаёт неправильно уложенные модельные белки, хотя физиологическая роль этой активности ещё предстоит установить55,56.
Membrane-protein unfolding and degradation. Деградируемые белки, которые внедрены в мембраны представляют собой специальный набор проблем, т.к. полипептид внутри мембраны д.б. экстрагирован, чтобы быть деградированным с помощью растворимых протеаз. AAA+ белки часто вовлечены в этот процесс экстракции. Напр., белки endoplasmic reticulum (ER) обратно транслоцируются в цитозоль и проникают в протеосомы для деградации в процессе, известного как ER-associated degradation (ERAD). Цитоплазматический AAA+ белок p97/VCP является существенным для удаления многочисленных ERAD белковых субстратов из мембран57, а недавно было показано, что он ассоциирует с трансмембранным белком Derlin, кандидатом на роль retrotranslocation канала58,59. В точности, как p97/VCP способствует обратной, неясно, а для некоторых ERAD субстратов p97/VCP вообще не используется. В этих случаях AAA+ белки в 19S протеосомных крышечках могут непосредственно способствовать ретротранслокации60.
У бактерий, в митохондриях и хлоропластах AAA+ и protease домены непосредственно сцеплены др. с др. и с мембраной. Субстраты, экстрагируемые из мембран с помощью AAA+ компонента этих AAA+ proteases, затем деградируются с помощью гидрофильного протеазного домена. FtsH, прототип этой группы, играет существенную роль в обмене бактериальных мембранных белков, а также некоторых цитозольных белков3. Митохондрии содержат две закрепленные в мембране AAA+ proteases, каталитические сайты которых ориентированы в противоположные стороны внутренней мембраны. Эти два энзима экстрагируют белки из соответствующих им сторон мембраны для протеолиза и являются существенными для нормальной функции митохондрий61.
Summary. Although each of the protease-associated AAA+ proteins discussed here handle different substrates, the common mechanistic theme is that they all unwind or unfold their target proteins in a vectorial manner for delivery to their associated protease (Рис. 4a). The intimate physical connection between the AAA+ proteins and the proteolytic chamber into which they deliver substrates provides an efficient mechanism for coupling unfolding with degradation. As we discuss further below, many of the same ATPases can also engage and unfold substrates in the absence of their associated protease, which leads to the remodelling of the substrate protein and/or disassembly of a protein complex.
Fighting protein aggregation
Вторым типом реакции, выполняемой членами семейства AAA+ является разборка белковых агрегатов (Рис. 4b). Белки, которые неспособны укладываться, но избегли протеолиза (вообще-то из-за того, что клеточная протеолитическая кухня перегружена из-за средовых стрессов или мутантных белков) , часто сливаются, образуя агрегаты. Уже давно предполагалось, что если такие агрегаты достигают пороговых размеров, они становятся необратимыми и потенциально токсичными. Однако, открытие, что термотолерантность у дрожжей обеспечивается с помощью 104-kDa хитшокового белка ()62, показало, что Hsp104 у грибов - и его ортологи у растений (Hsp101) и бактерий() - могут повышать жизнеспособность путём элиминации индуцированных стрессами белковых агрегатов63,64. В параллельных исследованиях Hsp104 было показано, что он играет важную роль в разделывании различного типа агрегатов, а именно упорядоченных β-покрытий или амилоидных, которые формируются с помощью у Saccharomyces cerevisiae65. Примером этого является prion, который формируется с помощью богатой глютамином области фактора терминации трансляции Sup35. Клетки, которые не содержат Sup35 амилоида, являются [psi-], тогда как те, что с Sup35 amyloid [PSI+] и имеют пониженную активность Sup35. Hsp104 играет существенную роль в контроле за образованием, распространением и элиминацией этого прионового состояния64,66.
Как Hsp104 распутывает белковые агрегаты оставалось мистикой до тех пор, пока Glover and Lindquist не показали, что он кооперирует с in vitro, чтобы растворить и распутать агрегированные белки67. Сходные исследования в др. системах, расширенные анализом этой bi-chaperone сети68, привели к предположению, что Hsp104 и его ортологи могут разрывать крупные агрегаты на маленькие кусочки, которые Hsp70 система может затем повторно упаковать64. Непосредственный контакт между ClpB и Hsp70, а также недавние доказательства, что Hsp70 необходим для ClpB, чтобы ангажировать определенные субстраты69, показали, что сотрудничество между этими двумя системами хаперонов интимное, но до конца не изученное.
Для Hsp104, чтобы разобрать агрегаты, он д. в первую очередь распознавать их. Определение, что распознает Hsp104 является задачей, т.к. агрегаты по природе гетерогенны и структурно не достаточно охарактеризованы. Недавнее исследование с использованием библиотеки пептидов, которые представлены в последовательностях 6 белков, которые в своей агрегированной форме, взаимодействуют с ClpB. Было установлено, что ClpB - подобно ClpX - соединяется с короткими мотивами, которые богаты основными и ароматическими остатками24. Дальнейшие исследования этих и сходных пептидных субстратов д. пролить свет на то, каковы специфические свойства, которые распознаются Hsp104/ClpB, и облегчат понимание взаимодействий в этих системах.
Как же Hsp104/ClpB диссоциируют агрегаты? Hsp104/ClpB содержат два тандемных AAA+ домена, а также уникальный и важный 'middle' или M-домен, который располагается вблизи конца первого AAA+ домена. Оба AAA+ домена, по-видимому, важны для активности и существует общение между ними70. M-домен состоит из антипараллельных спиралей, которые формируют проплеллер-подобные структуры вокруг периметра собранного гексамера71. Существуют две модели действия Hsp10464. В первой, которая упоминалась выше, Hsp104/ClpB может быть, как полагают, ломом ('crowbar') который разрывает крупные агрегаты на мелкие кусочки, которые становятся субстратами для повторной упаковки с помощью системы Hsp70 (которая может обрабатывать мелкие, но не крупные белковые агрегаты). Пропеллер-подобные M-домены, как полагают, действуют как ломы благодаря своей форме, а эксперименты показали, что иммобилизация их с помощью поперечных связей между цистеиновыми остатками, инактивирует энзимы71. Однако, прямой контакт между M-доменами и субстратными белками показан. Альтернативно, Hsp104/ClpB может оперировать как храповик ('ratchet'), который расправляет агрегаты путем вытаскивания индивидуальных компонентов из агрегата и через его центральную пору64. Эксперименты показали, что законсервированная β2-α2 поровая петля важна для дисагрегации в этой модели23,24. Собранные доказательства в пользу этой модели получены в недавнем исследовании, показавшем, что ClpB может поставлять субстарт в ClpP, когда он содержит ClpP-взаимодействующую петлю из ClpA/ClpX69. Это указывает на сходство между AAA+-обеспечиваемой дисагрегацией и расправлением, которое предшествует протеолизу. Насколько близко это сходство, сколько АТФ необходимо чтобы дисагрегировать субстрат и насколько производительна реакция, предстоит ещё выяснить.
Promoting protein-complex disassembly
Третьим типом реакции, катализируемой AAA+ белками, является разборка довольно стабильных белковых комплексов, которые образуются при разных процессах по всей клетке (Рис. 4c). Хотя, на первый взгляд, эта функция выглядит не связанной с расправлением белков и дисагрегацией активностей, рассмотренных выше, но более внимательное рассмотрение показывает, что участвующие механизмы д.б. сходными. Используются те же самые силы, которые необходимы для расправления складок белков, д. временно или частично распутывать и компоненты стабильных белковых комплексов и приводить к их разборке. Подтверждением служит тот факт, что те же самые белки AAA+, которые поставляют субстраты для ClpP, оперируют сами в качестве disassemblers белковых комплексов.
Disassembly of MuA strand-transfer complex by ClpX. Бактериальный вирус Mu реплицирует свой геном во время литического развития с помощью . Сердцевина является , которая оперирует путём соединения с и сведения вместе концов Mu генома, способствуя тем самым расщеплению ДНК и реакциям соединения, которые необходимы для транспозиции72. Transpososome становятся всё более и более стабильными по ходу транспозиции и в фазе кульминации они наиболее стабильны в виде пост-транскрипционного strand-transfer complex (STC), который связан с ДНК. Стержнем STC являются четыре MuA субъединицы и он является устойчивым к высоким уровням солей, концентрациям 6M мочевины и температурам свыше 75°C (Ref. 73). Когда он соединен с ДНК, то STC ингибирует репликацию ДНК.
ClpX, как было установлено, является фактором, ответственным за дестабилизацию STC и запуск репликации ДНК74. ClpX оперирует независимо от ClpP в этой реакции и использует гидролиз АТФ, чтобы дестабилизировать MuA тетрамеры. ClpX соединяется с C-терминальными десятью остатками MuA75 и расправляет индивидуальные субъединицы MuA76. Это расправление совпадет в высвобождением мономеров MuA из STC77. Интересно, что эксперименты со смесями полной длины и укороченными MuA показали, что только MuA, которые содержат C-терминальный связывающий ClpX мотив, высвобождаются из ДНК и что удаление только одной из четырёх субъединиц достаточно для дестабилизации всего STC76. Эти наблюдения привели к более обобщенным предположениям, что белковые комплексы могут быть разобраны путём ремоделирования (и вообще расправления) субнабора из их компонентов.
Disassembly of SNARE complexes by NSF. Слияние внутриклеточных мембран нуждается в ассоциированных с мембранами спиральными белками, известными как , которые собираются в комплексы, которые сводят мембраны вместе и способствуют слиянию мембран78,79. Несмотря на ограниченную консервацию последовательностей, все комплексы SNARE, которые были изучены, являлись палочковидными пучками из 4-х спиралей, которые были очень стабильными и во многих случаях противостояли диссоциации с помощью высоких температур и денатурирующего детергента SDS. После слияния мембран комплексы SNARE распадаются, чтобы регенерировать свободны SNAREs для использования в последующих реакциях слияния. Спонтанная разборка SNARE-комплексов очень медленная и поэтому клетки зависят от AAA+ белка NSF и его адапторного белка чтобы завершить эту реакцию80 (см Box 1 о деталях этой реакции и о др. ролях AAA+ белков с динамике клеточных мембран).
Точно также, как и др. белки, которые содержат тандемные AAA+ домены, NSF формирует гексамерный цилиндр, в котором два AAA+ кольца уложены поверх один другого80. Первый домен AAA+ в NSF гидролизует АТФ, чтобы обеспечить разборку SNARE комплексов. Согласно сегодняшней модели этой реакции, α-SNAP, как полагают, покрывает комплекс SNARE (с тремя α-SNAPs, окружающими пучок SNARE) и рекрутирует гексамер NSF. Будучи связанным,α-SNAP стимулирует активность ATФase этого гексамера и запускает разборку белкового комплекса81 (Рис. 4c).
По аналогии с ситуациями с ClpX и MuA, разумно представить себе картину, что NSF д. расправлять один или несколько компонентов комплекса SNARE, чтобы дестабилизировать и разложить его. однако, как NSF осуществляет это пока неясно. Во-первых, нет доказательств прямого контакта между NSF и SNAREs; вместо этого α-SNAP, по-видимому, является необходимой связью между ними. Достаточно ли вытягивания с помощью NSF на C-конце α-SNAP, чтобы расправить SNAREs и разобрать комплекс, пока неясно. Во-вторых, данные показывают, что первичные α-SNAP-связывающие сайты на NSF благодаря своей гибкости прикрепляются к N-доменам82. Могут ли контролируемые нуклеотидом движения в этих гибких доменах способствовать разборке SNARE путём вытягивания α-SNAP, или вместо этого облегчается контакт α-SNAP и/или комплекса SNARE с более ригидными сайтами внутри AAA+ кольца (такими как остатки центральной поры, упомянутые выше) ещё предстоит установить. Наконец, даже если в разборке участвет реакция расправления складок, которая фундаментально сходна с таковой. катализируемой с помощью ClpX, ClpA и ClpB, то мало вероятно, что NSF протаскивает свой субстрат целиком через центральную пору из-за геометрических препятствий мембраны. Это позволяет предполагать, что разборка SNAREs д. осуществляться с помощью NSF через ту же самую 'дверь', через которую они входили. Понимание того, как происходит эта реакция разборки, д. помочь расширить и обобщить модель, которая была разработана при изучении ClpX и MuA разборки белковых комплексов с помощью AAA+ белков77.
Other protein-complex disassembly reactions. Становится всвсё ещё яснее, что AAA+-обусловленная разборка белковых комплексов использует различные клеточные процессы. ClpA, подобно ClpX, участвует в хорошо известной реакции разборки белковых комплексов - напр., в конвертировании белка, инициирующего репликацию плазмид, RepA из неактивного димера в активный мономер. Это происходит в результате только одного раунда гидролиза АТФ, и это указывает на то, что он разделяет димер без расправления всего белка RepA83. ClpB (снова работающий вместе с системой Hsp70) играет роль вне дисагрегации, которая включает активацию белка инициирующего репликацю плазмид TrfA, превращая тем самым его из неактивного димера в активный мономер84. Др. примеры реакций разборки, включают обслуживание микротрубочек с помощью AAA+ белков katanin85 и spastin86, и активность AAA+ белка Vps4 (vacuolar protein sorting-4) в модулировании взаимодействий между ESCRT (endosomal sorting complex required for transport) белками, которые существенны для белка биогенеза 87. Некоторые реакции ремоделирования белковых комплексов, которые необходимы для репликации ДНК, также нуждаются в AAA+ белках32. Несмотря на общуюю потребность в AAA+ белках во всех этих реакциях разборки, кажется вполне возможным, что механистические детали будут различны и что степень конформационных изменений или 'pulling', которые необходимы для разборки каждого из этих разнообразных комплексов, будут разные.
Diseases caused by mutations in AAA+ proteins
Белки семейства AAA+ вовлекаются непосредственно или опосредованно во всё увеличивающееся количество болезней у человека (см (table)). Среди самых ранних белков AAA+ идентифицирован и связан с болезнью человеческий ортолог дрожжевого Pex1 (человеческий PEX1 назвается также PAS1)88, который играет существенную роль в импорте пероксисомных матричных белков и мутантен при >70% нарушений биогенеза пероксисом Zellweger's типа88. В последнюю декаду мутации и др. AAA+ белков были связаны с различными клиническими синдромами, что подчеркивает важность этих энзимов во многих аспектах нормальной физиологии. Др. недавние исследования в этой области включают находки, что синдром миозита (воспаление мышечной ткани), frontotemporal dementia и болезнь Paget's, затрагивающая кости, вызываются мутациями в p97/VCP89, что ER-lumenal AAA+ белок torsinA, который ответственен за торсионную дистонию с ранним началом, может оперировать в ядерной оболочке90,91, и что белок, который ответственен за наследственную спастическую параплегию является энзимом, обслуживающим микротрубочки86.
Многие AAA+-ассоциированные заболевания наследуются по аутономно доминантному типу. Возможным объяснением этого является то, что функция олигомерного AAA+ голоэнзима зависит от коммуникаций между субъединицами, с полной активностью, необходимой для того, чтобы большинство или все субъединицы были функциональными. В дополнение к специфическим мутациям, которые вызывают болезни, выявлены некоторые корреляции между уровнями экспрессии AAA+ белков и боезнями. Сюда входит ассоциация между повышенными уровнями p97/VCP и плохим прогнозом при карциномах92, и между пониженными уровнями NSF и шизофренией и эпилепсией93,94. AAA+ белки вовлекаются также в заболевания, при которых клетки имеют дело с неправильной уладкой и/или агрегацией белков. Как показано выше, протеолиз и дисагрегация зависят от активности AAA+-энзимов, так что эта функция является критической частью клеточных реакций на то, что часто обозначают как болезни конформации белков.
Summary
The AAA+ family of proteins is defined by the sequence and structure of the AAA+ ATP-binding domain. Members of the family have been well delineated in recent genome-wide surveys, and an increasing number of high-resolution structural studies have provided a detailed picture of the conserved structure of the AAA+ platform. How AAA+ domains assemble into functional oligomers and change their conformation during ATP hydrolysis has been studied less extensively. Future high-resolution structures of oligomeric AAA+ proteins in different nucleotide-bound states, and eventually bound to substrates and/or cofactors, will be essential to better define the mechanisms for members of this family. Many reactions have yet to be reconstituted in vitro with purified components, and this remains an essential step to show that a particular ATPase mediates a proposed reaction and to enable the study of its mechanism. Advances in this area will result in a more complete understanding of the relationship between ATP hydrolysis and protein remodelling by different types of AAA+ protein. The important advances that have been made over the last couple of years in understanding how protease-associated ATPases, such as ClpX and ClpA, engage and unfold their substrates provide a model for the type of work that will move our understanding of AAA+-protein function forward over the forthcoming years.
Box
Box 1 | AAA+ proteins and cellular membrane dynamics
AAA+ (ATPases associated with various cellular activities) proteins have unique and essential roles in regulating proteins and protein complexes that define the function and organization of cellular membranes and organelles. One of the best-studied members of the family in eukaryotes is NSF, which, together with its adaptor protein α-SNAP, is responsible for disassembling highly stable SNARE complexes after they form to promote membrane fusion80 (Hbc. 4c). SNARE-complex disassembly is essential for maintaining the elaborate network of intracellular membranes that define a eukaryotic cell; without NSF, membrane trafficking ceases as assembled SNARE complexes accumulate95,96. NSF is present in all tissues, but is most highly expressed in the nervous system where it enables the rapid membrane trafficking that is needed to maintain synaptic function. Its activity has been shown to be modulated by nitric oxide97 and phosphorylation98,99.
Other membrane-fusion events — notably, nuclear-envelope and Golgi-apparatus assembly following mitosis, assembly of transitional endoplasmic reticulum (ER), and fusion between ER membranes — seem to be regulated by the AAA+ protein p97/VCP100-102. How p97 and its ubiquitin-binding cofactors participate in these reactions has not yet been established. A loosely analogous machinery operates to control the biogenesis of multivesicular bodies (MVBs) in the endosomal pathway, regulating the formation of lumenal vesicles from the limiting membrane of the endosome87. In this case, the AAA+ protein Vps4 (vacuolar protein sorting-4, also called SKD1 in mammals) operates on one or more components of the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) machinery to regulate their association with membranes and the invagination of membrane into the MVB87. The details of this reaction and its precise relationship to membrane invagination into the MVB remain unknown. Knowledge of other members of the AAA+ family and the application of novel assays both in vitro and in vivo are sure to give insights into how AAA+ proteins carry out these membrane-based remodelling reactions.
