ADAMS: KEY COMPONENTS IN EGFR SIGNALLING AND DEVELOPMENT
Carl P. Blobel Nature Reviews Molecular Cell Biology6, No 1, 32-43 (2005); doi:10.1038/nrm1548
ADAM (a disintegrin and metalloprotease) proteins are membrane-anchored metalloproteases that process and shed the ectodomains of membrane-anchored growth factors, cytokines and receptors. ADAMs also have essential roles in fertilization, angiogenesis, neurogenesis, heart development and cancer. Research on ADAMs and their role in protein ectodomain shedding is emerging as a fertile ground for gathering new insights into the functional regulation of membrane proteins.
Протеолитический процессинг и высволождение мембранных белков м. функционировать как пост-трансляционное переключение, которое регулирует активность расщепленного субстрата. Этот процесс, который обозначен как 'protein ectodomain shedding', м. активировать или инактивировать белок-субстрат или существенно менять его функциональные свойства1-4. Семейство закрепленных в мембранах , которые известны как 'a disintegrin and metalloprotease' (ADAM) белки, являются ключевыми компонентами удаления белковых эктодоменов3-9. Основное внимание будет уделено тому, как ADAMs м. регулировать передачу сигналов посредством epidermal growth factor receptor () - тирозин киназного рецептора с важной ролью в развитии и болезнях, таких как рак10,11. Будет рассмотрена центральная роль, которую ADAMs, по-видимому, играют в удалении членов семейства мембран-связанных факторов роста, лигандов EGFR. Недавние структурные исследования, которые открыли необычный механизм димеризации EGFR (Refs 12,13) д.б. рассмотрены в контексте ADAM-зависимого удаления EGFR-ligand в попытке объяснить потенциальное значение удаления (shedding) в регуляции активности EGFR лигандов. Наконец, недавние находки участия ADAMs в развитии сердца и также будут обсуждены. Некоторые др. аспекты исследований ADAMs research - такие как их роль в межклеточных взаимодействиях, в активации рецепторов Notch на клеточной поверхности, ведение аксонов, при астме или как α-secretases при болезни Alzheimer's - не включены в обзор, т.к. рассмотрены в14-17.
An overview of ADAMs
Типичный ADAM состоит из серии консервативных и характерных белковых доменов: N-терминальная последовательность сопровождается pro-доменом, metalloprotease доменом, disintegrin доменом, богатой цистеином областью, , трансмембранным доменом и цитоплазматическим доменом (Рис. 1) (Refs 4,7,18). Первые ADAMs были распознаны в виде двух субъединиц гетеродимерного белка спермиев fertilin (ADAM1 и ADAM2)19-21. С момента открытия fertilin были идентифицированы многие др. ADAMs у разных видов, включая Schizosaccharomyces pombe22 (но не у Saccharomyces cerevisiae), Caenorhabditis elegans23, Drosophila melanogaster24 и у позвоночных (идентификационные цифры означают порядок, в котором были открыты др. ADAMs; обновленный список ADAMs у разных видом м. найти на web сайте в online links box). Только половина из ADAMs, которые известны на сегодня, содержит каталитического сайта консенсусный мотив для metalloproteases - HEXXH - в своём metalloprotease домене. Некоторые из них, как было установлено, каталитически активны25-34, это указывает на то, что др. ADAMs, которые содержат последовательности HEXXH также должны обладать каталитической активностью. Более того, каталитическая активность некоторых, но не всех, ADAMs м.б. ингибирована tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMPs)35. Те ADAMs, которые не содержат последовательностей HEXXH в своём во всём остальном законсервированном metalloprotease-подобном домене, по-видимому, не обладают каталитической активностью.
Pro-домен каталитически активных ADAMs, как полагают, функционирует как внутримолекулярный хаперон4,7,29. Будучи соответственно упакован ADAM pro-domain удерживается ферментативно неактивным вплоть до того, пока не будет удален с помощью furin-типа или с помощью аутокаталитического удаления в 29,32,36-39. Disintegrin домен получил свое название по имени высоко сходной последовательности с disintegrins ядовитых улиток40. Этого сорта растворимые белки, многие из которых содержат Arg-Gly-Asp (RGD) integrin-связывающий консенсусный мотив, соединяются с тромбоцитарным интегрином gpIIbIIIa и благодаря этому функционируют как мощные конкурентноспособные ингибиторы агрегации тромбоцитов40,41. За исключением человека (Refs 42,43), ни один из ADAMs, которые как известно на сегодня не содержат соотв. RGD последовательности. Тем не менее, некоторые исследования указывают на участие ADAMs в межклеточных взаимодействиях (Ref. 14). Disintegrin домен и богатая цистеином область также м. играть роль в нахождении субстрата44,45 и м. облегчать удаление pro-домена из каталитического домена37. Последнее указывает на то, что каталитический домен взаимодействует с disintegrin доменом и/или областью, богатой цистеином. Наконец, цитоплазматический домен ADAMs часто содержит сигнальные мотивы, такие как места фосфорилирования или области, богатые пролином, которые соединяются с Src-homology-3 (SH3) доменами7,46.
Некоторые ADAMs были главным образом или исключительно экспрессируемым в репродуктивной системе самцов млекопитающих и , следовательно, функционируют скорее всего преимущественно в сперматогенезе или в оплодотворении (Refs 47-50; см. также White Laboratory web site). Из ADAMs широко или повсеместно экспрессируемых и содержащих консенсусные последовательности каталитического сайта (Box 1) (tumour-necrosis factor (TNF)α-converting enzyme (TACE)) и (Kuzbanian) охарактеризованы лучше всего. ADAM17 играет ключевую роль в активации EGFR. На сегодня мало известно о функции большинства ADAMs, которые лишены каталитического сайта. Однако, исследования ADAM2 и ADAM3, которые существенны для оплодотворения47-49,51, и , который является критическим для развития головного мозга 52, показали, что изучение др. не-каталитических ADAMs м. оказаться столь же полезным, как и изучение ADAM2, ADAM3 и ADAM23 или каталитически активных ADAMs.
Protein ectodomain shedding
Одной из наиболее интересных и лучше всего охарактеризованных функций каталитически активных DAMs является их роль в удалении (shedding) белковых эктодоменов - протеолитическом высвобождении эктодомена из мембранного белка, которое обычно осуществляется с помощью отсечения рядом с плазматической мембраной2,53 (Рис. 2a). Удаление эктодоменов затрагивает многие структурно и функционально отличающиеся молекулы, такие как про-воспалительный цитокин TNFα, все EGFR лиганды, рецепторы, такие как TNF receptor-I и -II, ErbB2, ErbB4 и ряд др. белков, таких как Delta, белок amyloid предшественника и L-selectin3-5,7,8. В самом деле, 2-4% белков на клеточной поверхности становятся предметом удаления эктодоменов54.
The functional consequences of protein ectodomain shedding. Недавние исследования показали, что удаление эктодомена играет существенную роль в регуляции функции некоторых белков-субстратов. В принципе, последствия удаления эктодоменов м. варьировать в зависимости от функции белка-субстрата (Рис. 2b). Наиболее вероятным следствием удаления эктодомена является то, что оно позволяет закрепленному на мембране ростовому фактору или цитокину участвовать в передаче паракринных сигналов - т.е., функционировать на расстоянии от места своего отщепления или вообще поступать в кровоток 1. В отсутствии удаления эктодомена, закрепленный на мембране лиганд (такой TNFα или EGFR лиганд) м. теоретически только ангажировать рецептор на той же самой клетке (аутокринная передача сигналов) или на непосредственно соприкасающейся соседней клетке (juxtacrine передача сигналов)55. Однако, в отношении лигандов EGFR, имеются прекрасные доказательства того, что даже juxtacrine и autocrine передача сигналов м. регулироваться за счёт удаления эктодомена (Refs 56,57).
Эктодомены рецепторов также м. высвобождаться с помощью сброса (shedding), это тем самым м. инактивировать рецепторы. Растворимые unoccupied рецепторы также м. потенциально функционировать в качестве ловушки, которые секвестрируют тем самым растворимые лиганды. Напр., заболевание, которое вызывается дефектом сброса в рецепторах, это TNF-receptor-associated periodic febrile syndrome (TRAPS)58. Пациенты, которые страдают от TRAPS имеют доминантные мутации в сайте расщепления p55 TNF рецептора (), которые предупреждают или снижают отделение эктодоменов и подавление. Поэтому TNFR1 накапливаются на клеточной поверхности, это, в свою очередь, увеличивает чувствительность к TNFα и ведет в результате к повторяющимся лихорадкам благодаря повышенной воспалительной реакции.
C др. стороны отделение эктодомена также м. активировать рецепторы. Прекрасным примером этого является Notch59,60, в данном случае процессинг проксимального к мембране эктодомена ведет ко вторичному presenilin-зависимому отщеплению внутри трансмембранного домена. Этот, т.наз. регулируемый внутримембранный протеолиз (regulated intramembrane proteolysis (RIP))61-63, высвобождает цитоплазматический домен от его мембранного якоря и позволяет ему вступать в ядро и участвовать в регуляции транскрипции специфических генов-мишеней. Недавно рецепторные лиганды, такие как heparin-binding и neuregulin, также оказались предметом RIP и высвобождают свои цитоплазматические домены, что имеет важные функциональные следствия64,65. Закрепленные на мембранах лиганды м. , следовательно, также функционировать как 'counter-receptor' с помощью передачи сигналов обратно в клетку, на которой они располагаются1.
Приведенные выше примеры подчёркивают потенциальное значение отделения эктодоменов в качестве пост-трансляционных регуляторов мембранных белков и предоставляют концептуальную сферу деятельности для рассмотрения потенциальных функциональных последствий отделения эктодоменов для др. мембранных белков. В то же самое время эти примеры помогают также подчеркнуть, что последствия отделения эктодомена м.б. разными для индивидуальных субстратных белков.
ADAMs as molecular signalling switches
Все EGFR лиганды являются закрепленными на мембране предшественники, которые м.б протеолитически высвобождены из клетки (Ref. 66). Протеолитический процессинг для некоторых EGFR лигандов является ключевым регулятором переключения в передаче сигналов EGFR. ADAMs участвуют в отделении эктодоменов 6 из 7 известных EGFR лигандов (transforming growth factor , EGF, HB-EGF, betacellulin, epiregulin и (Ref. 67)).
Proteolysis in the regulation of EGFR signalling. Одно из первых указаний на то, что протеолиз влияет на передачу сигналов EGFR было получено в исследовании, в котором EGF избыточно экспрессировался в клетках как растворимый белок - т.е., без своего закрепления на мембране56. В то время как передача сигналов, которая вызывается избыточной экспрессией EGF, закрепленных на мембране, м.б. блокирована с помощью анти-EGFR антител, симуляция EGFR с помощью избыточной экспрессии растворимых EGF не ингибировалась этими антителами. Авт. пришли к выводу, что закрепление на мембране EGF каким-то образом препятствует 'intracrine' стимуляции EGFR во время биосинтеза на секреторном пути в EGF-экспрессирующих клетках. Установлено, что EGFR-зависимая миграция и пролиферация клеточной линии рака груди м.б. блокирована с помощью ингибитора metalloprotease68 и что это м.б. обратимо с помощью экзогенного растворимого EGF. Наконец. в некоторых исследованиях было показано, что взаимодействия (crosstalk) между (GPCRs) и EGFR нуждаются в активации EGFR лигандов с помощью metalloproteases, включая ADAM10, ADAM12 и ADAM17 (Ref. 69; Box 2).
Изучение -/- мышей70 показало. что эти животные напоминают мышей с отсутствием TGFα (или EGFR), т.к. они имеют дефекты в созревании и морфогенезе эпителиальных структур, включая неспособность подвергаться слиянию век70. Более того, Adam17-/- клетки дефицитны по TGFα shedding70. Хотя pro-TGFα и EGFR и присутствуют у Adam17-/- мышей, но эта лиганд-рецептор пара собственно не функционирует в отсутствие ADAM17. Выявлены и дополнительные дефекты у Adam17-/- мышей, которые также м.б. результатом отсутствия EGFR-лиганд процессинга. Сюда входят дефекты морфогенеза ветвления в лёгких71, утолщенные и уродливые сердечные клапаны, напоминающие таковые у мышей с отсутствием HB-EGF67,72-74, и дефекты морфогенеза ветвления во время развития молочных желез (Z. Werb, personal communication), которые сходны с таковыми у мышей, лишенных amphiregulin75. Всё это говорит о критической роли отделения эктодоменов в регуляции функции EGFR и, по крайней мере, трёх его лигандов, TGFα, HB-EGF и amphiregulin, во время развития.
A central role for ADAM17 in paracrine EGFR signalling? В случае паракринной стимуляции EGFR (Рис. 2b), причина ключевой роли ADAM17 ясна - закрепленный на мембране ростовой фактор просто не м. активировать EGFR из-за расстояния. Роль HB-EGF в развитии сердца м.б. использована как пример паркринной передачи сигналов EGFR in vivo. В развивающемся сердце HB-EGF высоко экспрессируется в монослое эндокардиальных клеток, которые лежат поверх 72, 73. Однако, Hb-egf-/- мыши имеют тяжелые дефекты в морфогенезе эндокардиальных подушек, это и обусловливает образование увеличенных и уродливых клапанов сердца72,73. Мыши Adam17-/- имеют сходные дефекты в развитии сердца, что и Hb-egf-/- мыши72. ADAM17 участвует в расщеплении HB-EGF в клетках67,76,77, это указывает на то, что дефекты сердца у Adam17-/- мышей наиболее вероятно обусловлены дефектами высвобождения HB-EGF из эндокардиальных клеток. Мнение, что дефекты сердца у мышей Adam17-/- обусловлены отсутствием процессинга HB-EGF подтверждено находкой, что knock-in мыши с нерасщепляемой формой HB-EGF также имеют дефекты сердца, которые напоминают таковые у Adam17-/- или Hb-egf-/- мышей78. Следовательно, протеолиз является общим - и тот что в частности обусловливается ADAM17 - важным для паракринной передачи сигналов HB-EGF во время развития сердца. В этом контексте, необходимо отметить, что не наблюдается утолщения клапанов у мышей, которые лишены др. кандидатов на HB-EGF sheddases (ADAM9, ADAM12 и ADAM15), это говорит против важной роли этих ADAMs в активации HB-EGF в эндокарде67.
Возникает вопрос, как отсутствие ростового фактора Hb-egf м. вызывать усиление пролиферации в структурах, происходящих из эндокардиальных подушек. L. Jackson и др. получили доказательства неожиданной ингибирующей роли EGFR на пролиферацию эндокардиальных подушек72. Очевидно, что активация EGFR ингибирует передачу сигналов посредством bone morphogenetic protein (BMP)-Smad1/5/8 пути, которые во всем стимулируют рост эндокардиальных подушек. Следовательно, 'фактор роста' HB-EGF м. действительно блокировать пролиферацию клеток эндокардиальных подушек, если он высвобождается с помощью ADAM17 (72).
A requirement for shedding in juxtacrine EGFR signalling? Хотя интуитивно ясно, почему расщепление (shedding) необходимо для паракринной передачи сигналов EGFR, но происходит или нет расщепление также и при juxtacrine передаче сигналов EGFR является более спорным вопросом. В некоторых исследованиях было показано, что juxtacrine передача сигналов EGFR не нуждается в EGFR-лиганд shedding. Напр., клетки, которые экспрессируют нерасщепляющуюся, мутантную форму TGFα, м. запускать фосфорилирование EGFR в EGFR-экспрессирующих клетках, которые ко-культивируются выше их79,80, и м. индуцировать трансформацию клеток81 и м. даже усиливать передачу сигналов EGFR82. Более того, клетки, которые экспрессируют HB-EGF или TGFα, но которые защищены от расщепления этих лигандов с помощью химической фиксации, м. стимулировать передачу сигналов EGFR в живых клетках, которые культивируются выше их83,84. Исследование M. Borrell-Pages и др. показало, что shedding м.б. существенным и для juxtacrine стимуляции EGFR с помощью TGFα - по крайней мере, в тех условиях, которые были использованы в этом исследовании57. Одним из ключевых экспериментов, показавшим, что juxtacrine передача сигналов EGFR в EGFR-экспрессирующих A431 клетках, которые культивируются поверх TGFα-экспрессирующих клеток, м.б. блокирована с помощью ингибитора metalloprotease batimastat. Важно, что соединение A431 клеток с TGFα-экспрессирующими клетками увеличивается в присутствии batimastat и м.б. ингибировано с помощью блокирующих функцию антител против EGFR, это подтверждает, что нерасщепленные TGFα м. связываться с EGFR. Др. подходы для устранения или ослабления высвобождения растворимого TGFα во всём сходны, они включают его экспрессию в ADAM17-дефицитныхt Chinese hamster ovary (CHO) клетках (которые высвобождают только минимальные количества TGFα), и экспрессию нерасщепляемого TGFα мутанта в дикого типа CHO клетках. Когда TGFα-экспрессирующие дикого типа CHO клетки были инъецированы мышам nude, то возникающие в результате опухоли росли быстрее, чем те, что происходили из TGFα-экспрессирующих ADAM17-дефицитных CHO клеток, или из клеток CHO, которые экспрессировали нарасщепляемую форму TGFα. Всё это показало, что протеолитический процессинг TGFα м. существенно усиливать передачу сигналов EGFR, даже в juxtacrine условиях.
Эти противоречащие результаты тому, что juxtacrine передача сигналов EGFR не нуждается в shedding его лигандов, возможно связаны с очень необычным способом димеризации EGFR в контексте отделения эктодомена лиганда. Установлены кристаллические структуры растворимых эктодоменов EGFR с или без связанного растворимого лиганда (TGFα или EGF)12,13,85-87. Эти структуры показали, что EGFR димеризуется посредством пептидной петли, которая спрятана в незанятом рецепторе, но которая выходи наружу в результате драматических конформационных изменений при связывании лиганда (Рис. 3a). Интересно, что эта экспозированная димеризационная петля выступает из стороны, противоположной той, что соединяется с лигандом. Такой способ димеризации, который отличает EGFR от др. тирозин киназных рецепторов, которые димеризуются или олигомеризуются путём связывания своих лигандов12,13,85,>86 (Рис. 4). Эти структурные исследования показали, что некоторые ступени необходимы для димеризации и передачи сигналов EGFR. Во-первых, EGFR д. привлечь лиганд, это приводит в результате к экспозиции димерезационной петли в EGFR (Рис. 3a). Затем один оккупированный рецептор д. взаимодействовать с др. оккупированным рецептором, с помощью своей экспозированной димеризационной петли. Два отдельных лиганд-связывющих события д. , следовательно, сопровождаться димеризацией окупированных лигандами рецепторов, чтобы сформировать сигнальный димер (Рис. 3b). М. предположить, что прикрепленные к мембране EGFR лиганды д. препятствовать диффузии пар рецептор-лиганд, а , следовательно, и их димеризации (Рис. 3c). При ограниченных концентрациях лиганда, связанный лиганд м. также диссоциировать от своего рецептора прежде чем встретится второй оккупированный рецептор. Однако, разрезание связи, которая удерживает лиганд на мембране, д. удалять это препятствие диффузии рецептора и тем самым увеличивать шансы димеризации (Рис. 3d,e). С др. стороны, избыточная экспрессия нерасщепляемых лигандов также будет вызывать увеличение плотности лигандов, которая, в свою очередь, будет облегчать димеризацию двух оккупированных рецепторов и тем самым вызывать передачу сигналов EGFR (Рис. 3f). В самом деле, избыточная экспрессия нерасщепляемых форм TGFα или HB-EGF м. даже усиливать juxtacrine передачу сигналов79,80,83,84 потому что нерасщепленные лиганды м. препятствовать эндоцитозу и подавлению рецепторов 82. Эта модель делает гипотезу проверяемой и в отношении того, как м. происходить juxtacrine передача сигналов или даже усиливаться с помощью избыточной экспрессии нерасщепленных лигандов и почему отщепление эктодомена м. играть уникальную роль в облегчении juxtacrine передачи сигналов EGFR при низких и вообще более физиологических концентрациях лиганда. Др. факторы. такие как , также, как известно, усиливают juxtacrine передачу сигналов EGFR83,84. CD9,как установлено, взаимодействует с HB-EGF, amphiregulin и TGFα, a его избыточная экспрессиия м. , следовательно, приводить к кластрированию этих EGFR лигандов в tetraspanin 'webs'. Возникающее в результате локальное увеличение плотности EGFR лигандов также м. облегчать juxtacrine передачу сигналов EGFR. Хотя точный механизм, лежащий в основе эффектов CD9 на передачу сигналов EGFR неизвестен, но CD9 - или др. tetraspanins, или др. еще не идентифицированные факторы - также м. , следовательно, участвовать в предопределении, как расщепление лиганда будет влиять на передачу сигналов EGFR в разных линиях клеток. Наконец, способ димеризации EGFR также м. объяснить, почему отщепление эктодомена важно для autocrine передачи сигналов56. В противоположность расстворимым лигандам связанные с мембранами лиганды не м. быть, напр., способны связывать рецепторы таким способом, который экспозирует димеризационные петли или, напротив, если связывание происходит, то оно м. неправильно ориеннтировать петлю и тем препятствовать её взаимодействию с петлей др. рецептора.
Shedding of other EGFR ligands. Заслуживает внимания то, что аминокислотные остатки в TGFα и EGF, которые взаимодействуют с EGFR в двух отдельно установленных кристаллических структурах консервативны у всех 7 EGFR лигандов, также как и по расстоянию от С-терминального рецептор-связывающего сайта от плазматической мембраны (Рис. 5). Это указывает на то, что shedding м. регулировать juxtacrine передачу сигналов всех EGFR лигандов способом. описанным для TGFα. Т.к. EGFR путь является закономерной мишенью для противоопухолевых лекарств11,88, то стоящие выше активаторы EGFR лигандов - их sheddases - и регуляторы этих sheddases м. выступать как привлекательные мишени для потенциально новых лекарств на EGFR пути57,67. Если специфические аспекты модели, которая описана выше (Рис. 3), будут подтверждены, то это м. иметь важное значение для использования ингибиторов metalloprotease в блокировании передачи сигналов EGFR. В частности, данная модель д. указывать на то, что блокирование передачи сигналов EGFR с помощью ингибиторов metalloprotease м. обнаруживать преимущества, когда лиганд экспрессируется на низких уровнях или когда ADAM избыточно экспрессирован, т.к. это д. снижать шансы димеризации рецепторов. Однако, ингибиторы metalloprotease м. оказывать и противоположные эффекты и стимулировать передачу сигналов EGFR при высоких концентрациях лигандов.
Мишени для ингибирования или регуляции передачи сигналов EGFR включают и ADAM17,который является важной sheddase HB-EGF, TGFα, amphiregulin и epiregulin в нескольких различных типах клеток67,70,76,77, и ADAM10, который является главной sheddase EGF и betacellulin в эмбриональных фибробластах мышей67. Остальной EGFR лиганд, epigen, в основном подвергается процессингу с помощью энзимов, которые нечувствительны к metalloprotease ингибиторам в эмбриональных клетках мышей и которые ещё не идентифицированы (U. Sahin and C.P.B., unpublished observations). ADAM9, ADAM10 и ADAM12 участвуют также в shedding HB-EGF, хотя они, по-видимому, регулируются по другому в сравнении с ADAM17 (Refs 89-93). Более того, разные ADAMs, по-видимому, важны для GPCR-EGFR взаимодействий в разных линиях опухолевых клеток94-96. Интересно бы определить, какой из ADAMs или др. энзимов м. высвобождать др. EGFR лиганды из клеток, когда они избыточно экспрессируются или неправильно регулируются, чтобы оценить индивидуальные опухоли в отношении экспрессии кандидатов EGFR-ligand sheddases , также как и EGFR лигандов. Было бы ценным. определить, существуют ли сигнальные комплексы, которые состоят из разных комбинаций ADAMs и EGFR лигандов в разных типах клеток и м. ли они объяснить, почему сходные стимулы активируют разные ADAMs в разных клетках69.
Помимо EGFR, насколько важным м.б. shedding для активации лигандов для др. ErbB рецепторов (ErbB2, ErbB3 and ErbB4)? Структура ErbB2 указывает на то, что гомо- и гетеродимеры, которые содержат этот ErbB рецептор, м.б. менее зависимы от расщепления лигандов, т.к. димеризационные петли постоянно экспозированы у ErbB2 и не нуждаются в связывании лигандов (лиганд для ErbB2 неизвестен)13,87,97. Сходным образом, в ErbB2 гетеродимерах только один из партнеров, такой как ErbB3, нуждается в связывании лигандов, чтобы сформировать сигнальные гетеродимеры98. В этом контексте необходимо подчеркнуть, что некоторые neuregulins - группа ErbB лигандов, которая также играет критическую роль в развитии - образуются в виде прикрепленных к мембране предшественников и сбрасываются с плазматической мембраны99-104. Однако, вполне возможно, что juxtacrine сигнальная активность neuregulins м. и не нуждаться в отщеплении эктодомена в случае, когда активируются гетеродимеры, которые содержат ErbB2. Отсутствие расщепления neuregulin м. даже предупреждать эндоцитоз и подавление гетеродимеров ErbB2 с др. ErbB рецепторами и м. , следовательно, усиливать передачу сигналов. Необходимы дальнейшие исследования. Было бы интересно исследовать и роль shedding в регуляции ErbB2 и ErbB4, они оба высвобождаются из клеток с помощью metalloproteases105-109. Анти-ErbB2 антитела Herceptin, которые используются для лечения рака молочных желез, блокируют shedding ErbB2, это открывает возможность того, что расщепление играет роль в регуляции функции самого ErbB2105.
Наконец, поразительно, что ADAMs ещё не были связаны с активацией EGFR лигандов у Drosophila melanogaster110-112. В самом деле протеазы, пронизывающие 7 раз мембрану, наз. rhomboids, важны для этого процесса у этих организмов. Это м. б. необычным примером важности сигнальных путей, в которых избранные компоненты не обладают общими высоко консервативными функциями у мух и млекопитающих110.
Regulation of ADAMs
Центральная роль ADAMs в передаче сигналов EGFR, а также др. известных функций в развитии и при болезнях26,27,60,101,102,113,114, создаёт сильный импульс для изучения регуляции этих энзимов. Расщепление ADAM17 субстратов, напр., м. стимулироваться такими как TPA (12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate) или PMA (phorbol-12-myristate-13-acetate) и с помощью ингибитора фосфатазы
pervanadate1,54,115,116. Воздействие PMA увеличивает также протеолитический процессинг синтетического TNFα-cleavage-site пептида, который, добавляется к среде культивируемых клеток, которые указывают на то, что активность ADAM17 активируется с помощью этогофорболового эфира117. Однако, механизм, с помощью которого происходит эта активаци, неизвестен118. Интересно, что PMA м. даже активировать мутантную форму ADAM17. которая лишена своего цитоплазматического домена45. Одним из возможных объяснений этого неожиданного результата является то, что активность ADAM17 м. регулироваться с помощью одного или нескольких пронизывающих мембрану белков. Возникает и др. вопрос в этой связи, происходит ли стимуляция ADAM17 форболовыми эфирами, наблюдаемая в тканевой культуре и in vivo. В случае EGFR-ligand shedding, по крайней мере, имеется хорошая корреляция между потребностью ADAM17 в зависимом от форболового эфира shedding TGFα, amphiregulin и HB-EGF в культуре и установленной ролью ADAM17 в активации этих лигандов во время развития in vivo (Refs 67,72 и Z. Werb, personal communication). Это не обязательно д. указывать на то, что активация protein kinase C (PKC) - которая обеспечивается с помощью phorbol esters - является важной для активности ADAM17 in vivo, а указывает на то, что ADAM17 является важным для PMA-стимулируемого EGFR-ligand shedding в культивируемых клетках, также как и для активации этих лигандов in vivo. Как и передача сигналов PKC, некоторые и др. сигнальные пути м. влиять на расщепление ADAM17 субстратов, включая receptor-tyrosine-kinase-activated extracellular signal-regulated kinase (ERK)/mitogen-activated protein kinase (MAPK) путь119, а также стимуляцию of GPCRs94-96. Более того, идентифицировал несколько цитоплазматических партнеров по связыванию ADAM17, хотя большинство их остаётся неизученными в отношении как эти белки влияют на функцию ADAM17 (Refs 120-122). В свете ключевой роли ADAM17 в передаче сигналов EGFR и в TNFα shedding (помимо др. функций), очевидно, что понимание того, как ADAM17 регулируется в клетках и в интактных организмах имеет большое значение.
Пока мало извсестно о том, как ADAMs иные, чем ADAM17, регулируются (Ref. 7). Большинство ADAMs содержат предполагаемыйе сигнальные мотивы в своем цитоплазматическом домене, включая сайт фосфорилирования и областит, богатые пролином, которые м. взаимодействовать с SH3 доменами7. Некоторые взаимодействия между ADAMs и др. цитоплазматическими белкми идентифицированы123-127. Некоторые из этих взаимодействующих белков, таких как (PKC and casein-kinase substrate in neurons-2) и , участвуют в регуляции функции ADAMs123,125, хотя мало известно о лежащих в основе механизмах. Более того, хотя активность ADAM17 сильно стимулируется форболовыми эфирами, по крайней мере, два ADAMs - ADAM10 и - обладают существенной конституитивной активностью в отношении своих субстратов33,67. Конституитивные события shedding, которые зависят от ADAM10 и ADAM19 м. , следовательно, регулироваться , по крайней мере, частично с помощью экспрессии уровней этих протеаз. Также ADAM10, как было показано, отвечает на активацию GPCRs92-94. Наконец, интересно бы определить, почему удаление холестерола м. активировать некоторые sheddases, напр., ADAM10 и ADAM17 (Refs 128-130).
ADAMs in heart development and angiogenesis
Сегодня получены нокаутные мыши по всем, кроме одного из каталитически активных ADAMs, которые экспрессируются в соматических тканях (Box 1). Анализ -/- мышей недавно выявил сходные дефекты в развитии сердца с теми, что обнаруживаются у Adam17-/- мышей - утолщенные, уродливые и неправильно ремоделированные клапаны сердца101,102. Однако, несмотря на фенотипическое сходство дефектов, не существует доказательств роли ADAM19 в HB-EGF shedding102. И так как дефекты сердца у Adam19-/- мышей всё же сходны, то проделаны два исследования в отношении роли в ADAM19 shedding определенных neuregulins с разными результатами. Необходим дальнейший анализ, чтобы понять механизм, который лежит в основе действия ADAM19 на развитие сердца и чтобы определить, м. ли повышенная пролиферация клеток эндокардиальных подушек происходить в отсуствие ADAM19, напр., из-за отсутствия shedding и подавления рецепторов, таких как рецепторы BMP2 или ErbB2, или за счёт ещё неизвестных функций др. доменов ADAM19, таких как передача сигналов через его цитоплазматический домен или с помощью межклеточных взаимодействий, которые поддерживаются с помощью его внеклеточных доменов. Так как и ADAM19 и ADAM17 играют существенные роли в развитии сердца у мышей, то было бы интересно определить будут ли мутации у их человеческих вызывать врожденные пороки сердца.
Два др. интересных процесса, в которых участвуют ADAMs являются ангиогенез и неоваскуляризация. Adam10-/- мышцы погибают на эмбриональный день 9.5 (E9.5) с уродливыми сосудами в их желточных мешках, возможно из-за дефектов в передаче сигналов Notch1 и/или Notch459. Установлено, что ADAM15 играет роль в патологической неоваскуляризации у модельных мышей с до созревания, даже несмотря на то, что он не нужен для онтогенетического ангиогенеза или гомеостаза у взрослых113. Рост имплантированных опухолевых клеток также сильно ингибируется у Adam15-/- мышей, это согласуется с ролью ADAM15 в неоваскуляризации. Т.к. ADAM15 не является существенным для развития или взрослого гомеостаза, то он м. представлять собой прекрасную мишень для создания ингибиторов патологической неоваскуляризации. В свете известной роли отщепления эктодоменов как пост-трансляционных эффекторов мембранных белков, было интересно установить, м. ли ADAM10 или ADAM15, или др. ADAMs участвовать в shedding рецепторов или др. белков, которые играют роль в ангиогенезе и неоваскуляризации, таких как vascular endothelial growth factor (VEGF) рецепторы-1 и -2 и angiopoietin рецепторы TIE1 и TIE2.
Conclusions and perspectives
Over the past few years, functional studies of ADAMs and their roles in protein ectodomain shedding have become an increasingly stimulating and fruitful area of research. Now that the relevance of ectodomain shedding is well established for certain signalling pathways (for example, EGFR signalling, TNF-receptor signalling and Notch signalling), it is tempting to speculate that this process might have a more general role in regulating the function of other membrane proteins that are shed (as noted previously, 2–4% of the proteins on the cell surface are shed54). Indeed, shedding might have evolved in part to fulfil a similar purpose to constitutive and regulated exocytosis, in this case by allowing membrane proteins to be released constitutively or on demand.
It has now become feasible to identify the sheddase(s) for any membrane protein of interest using (for an example, see Ref. 96), cells from various ADAM-knockout mice67,131,132, or by comparing the response of an unknown sheddase to pharmacological activators and inhibitors of shedding with the properties of known sheddases (for an example, see Ref. 131). In addition to loss-of-function experiments that define which sheddase(s) are essential for processing a specific substrate in a given cell type, it will be equally important to perform gain-of-function experiments (for an example, see Ref. 133). These help to establish which enzymes can process a substrate, and might therefore contribute to its shedding in vivo, especially in cells or tissues where the enzyme is highly expressed, or in pathological conditions where it is misregulated. Knowing which enzymes can process a substrate also helps in the design of experiments to address potential compensatory or redundant functions of different ADAMs. With few exceptions, shedding studies have so far been performed in 'garden variety' cell types, such as CHO and , or in mouse embryonic cells. It will now be crucial to extend these studies to more specialized cell types and tissues, particularly those in which a given substrate of interest exerts its function. Furthermore, knock-in mutations of the cleavage site of the substrate can provide invaluable information on the functional consequences of shedding for any given substrate (a caveat is that it must be confirmed that shedding is indeed abolished, as mutations in cleavage sites could create new sites for other proteases; for an example, see Ref. 134).
Given the large number of proteins that are shed, and the comparably small number of sheddases, it is likely that every sheddase will have several substrates, as is the case for ADAM10 and ADAM17 (Refs 4–7). In any given cell or tissue, the function of a particular ADAM might then be equivalent to the combined consequences of the shedding events that it mediates. Nevertheless — despite their potentially pleiotropic nature — key functions for ADAMs have emerged in certain well-defined signalling pathways, such as activation of the EGFR or of Notch. Genetic systems such as knockout mice can therefore establish predominant roles for ADAMs in certain developmental or disease processes, which, in turn, might help to validate a given ADAM as a drug target. Clearly, shedding is essential for any paracrine signalling events of membrane-anchored growth factors and cytokines, including systemic endocrine effects that arise from release into the circulation.
To gain a more comprehensive understanding of the functions of catalytically active ADAMs, it will be necessary to use unbiased approaches to identify substrates — something that is considered to be an important challenge in protease research in general. Progress in proteomics might be particularly useful in achieving this goal. Now that the proteomic analysis of serum samples can clearly distinguish between samples of certain cancer patients and those of normal controls135,136, a similar analysis of serum from ADAM-knockout mice compared with controls might help to identify ADAM substrates. Other methods, such as , might be appropriate for identifying protease substrates in cells or tissue samples137.
Finally, from a medical perspective, an important question is whether either inhibition or stimulation of a given ADAM will be useful for treating a certain disease. The answer to this question will help to decide whether selective inhibitors of ADAMs or selective activators of shedding are called for in each case. As mentioned above, ADAMs might be particularly attractive targets for the treatment of cancer owing to their role in shedding EGFR ligands. Further studies on how to inhibit the release of TNFα and other cytokines might help to facilitate the treatment of rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases, as well as inflammatory conditions. It might also be worth identifying small molecules or antibodies that block shedding of a specific substrate without inhibiting the sheddase, perhaps by obscuring the cleavage site. In light of the many shed proteins, it is likely that our current knowledge of ADAM substrates and functions only corresponds to the tip of the iceberg of this new and rapidly evolving area of research.
