Семейство ADP-ribosylation factor (ARF) малых ГТФаз
Структура и Функции
ARF proteins: roles in membrane traffic and beyond
Crislyn D'Souza-Schorey1 and Philippe Chavrier Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 347-358 (May 2006) | doi:10.1038/nrm1910
The ADP-ribosylation factor (ARF) small GTPases regulate vesicular traffic and organelle structure by recruiting coat proteins, regulating phospholipid metabolism and modulating the structure of actin at membrane surfaces. Recent advances in our understanding of the signalling pathways that are regulated by ARF1 and ARF6, two of the best characterized ARF proteins, provide a molecular context for ARF protein function in fundamental biological processes, such as secretion, endocytosis, phagocytosis, cytokinesis, cell adhesion and tumour-cell invasion.
Рис.1. | Regulation of COPI-coat assembly and vesicle budding by ARF1
Рис.2. | Regulation of actin assembly by ARF1 during vesicle formation at the Golgi.
Рис.3. | ARF6 regulates clathrin-dependent and clathrin-independent endocytic pathways.
Рис.4. | Multiple roles for ARF6 at the cell periphery.
Рис.5. | ARF6-mediated regulation of Rac1 activation in epithelial cells.
Box 1 | Membrane trafficking in the secretory pathway
Семейство белков ADP-ribosylation factor (ARF) относится к сверхсемейству Ras малых GTPases. Хотя ARF белки были первоначально названы по их способности действовать в качества кофакторов для катализируемого холерным токсином ADP-ribosylation alpha-субъединицы гетеротримерных G белков, Gs, в бесклеточной биохимической среде1, они, ка затем было установлено, регулируют пути мембранного трафика.
Подобно др. Ras-родственным GTP-связывающим белкам, ARF белки совершают циклические изменения между своей активной GTP-связанной и неактивной GDP-связанной конформацией. Гидролиз связи GTP обеспечивается с помощью GTPase-activating proteins (GAPs), тогда как замена GDP на три-фосфатный нуклеод обеспечивается с помощью guanine nucleotide-exchange factors (GEFs). Некоторые ARF-специфические GEFs и GAPs, которые взаимодействуют с одним или более ARF белками, были идентифицированы in vitro, однако, определенные GAPs и GEFs регулируют GTP-GDP цикл индивидуальных ARF белков in vivo (rev. Refs 2,3). Все белки ARF myristoylated по второму остатку Gly на N конце и эта липидная модификация, по-видимому, важна для прикрепления белков ARF к мембранам4.
Базируясь на идентичности аминокислотных последовательностей у млекопитающих можно выделить 6 белков ARF в три класса5. Class I ARF белков (, и ) обладает более чем 96% сходством, регулирует сборку разных типов 'coat' комплексов на отпочковывающихся пузырьках вдоль секреторного пути и активирует энзимы, модифицирующие липиды6. Функция class II ARF белков ( и ) всё ещё неясна, некоторые исследования указывают на то, что ARF5 может играть роль в раннем Golgi транспорте и рекрутировании оболочечных (coat) компонентов на trans-Golgi мембраны7,8. , который является единственным членом class III, как полагают, регулирует поставку эндосомных мембран и структурную организацию клеточной поверхности9,10. Др. белки, которые структурно напоминают упомянутые выше ARF белки человека рассматриваются как ARF-like (ARL) белки11, более удаленно ассоциированные с секрецией, и Ras-related protein-1 (SAR1p)12 и ARF-related protein ARFRP1 (Ref. 13).
Белки ARF экспрессируются повсеместно, а аминокислотные последовательности, по-видимому, хорошо законсервированы у всех эукариот, от дрожжей до человека с удивительной точностью. Интересно, что 6 членов ARF семейства были идентифицированы у Giardia lamblia, протиста из раннего дивергировавшего клона, который лишен представителей семейств Ras и гетеротримерных G-белков14,15. Эта находка указывает на самостоятельное и ранее возникновение у эукариот членов семейства ARF по сравнению с др. GTPases.
Уникальное клеточное распределение индивидуальных ARF белков и молекул, с которыми они взаимодействуют, является жизненно важным для предопределения функции ARF белков. Молекулярная структура ARF1 и ARF6 млекопитающих охарактеризована кристаллографически, которая показала, что хотя switch regions ARF1 и ARF6 принимают довольно самостоятельные конформации в GDP-связанном состоянии, их GTP-связанные структуры очень сходны16. Это ставит вопрос о специфичности в отношении взаимодействий с нижестоящими эффекторами и функцией белков. В самом деле, большинство ARF эффекторных молекул, которые были идентифицированы, могут взаимодействовать, по крайней мере, до некоторой степени с более чем одним ARF белком in vitro17-21. В клетке, однако, по-видимому, ARF белки имеют самостоятельные местоположения и эта компартментализация может быть важным детерминантом в выполнении уникальных функций индивидуальных членов семейства ARF10. Возможно также, что ARF-GTP может устанавливать специфические взаимодействия вне регионов переключения (switch), чтобы сделать возможными дифференциальные взаимодействия с определенными эффекторами22. Несмотря на уникальные субклеточные локализации ARF1 и ARF6, теперь становится очевидным, что роль ARF6 на клеточной поверхности напоминает роль ARF1 на Golgi, где ARF1 регулирует сборку clathrin и не-клатриновых оболочек, также как структуру органеллы.
В обзоре суммированы недавние находки с ARF1 и ARF6 в попытке понять биологический контекст для функции ARF-белков. Описывается роль ARF1 и ARF6 в мембранном трафике и ремоделировании actin вдоль секреторного и эндоцитотического путей, соотв. Суммированы также недавние доказательства, которые показывают, как функция ARF белков может нарушать клеточные процессы, такие как phagocytosis, клеточные деления и инвазию опухолевых клеток. Благодаря этим недавним находкам роли и регуляция ARF GTPases оказывается темой для обсуждения в вопросе понимания основ клеточной биологии, а также клеточных основ болезни.
ARF1 regulates secretory membrane transport
Исследования на Saccharomyces cerevisiae установили важность ARF белков в белковой секреции23. Последующие работы показали, что транспорт по раннему секреторному пути, в первую очередь от Golgi на endoplasmic reticulum (ER) и между цистернами Golgi, обеспечивается за счёт ARF1-зависимого рекрутирования coat protein complex I (COPI) на отпочковывающиеся транспортные пузырьки (reviewed in Refs 6,24). ARF1-GTP также регулирует рекрутирование clathrin в поздние компартменты Golgi и endosome путем доставки гетеротримерных adaptor-protein (AP-1, AP-3 и AP-4) комплексов, а также мономерных GGA (Golgi-localized gamma-ear-containing ARF-binding) белков25,26 (Box 1). Используя липосомы липидного состава, которые напоминают мембраны Golgi дрожжей, было показано, что myristoylated ARF1-GTP и COPI coatomer комплекс представляет минимальную кухню (machinery), чтобы отпочковывать покрытые COPI пузырьки in vitro27. Однако, используя липидную среду, сходную с Golgi мембранами млекопитающих, др. исследование расширило эту минимальную потребность и включило рецепторы цитоплазматических хвостов грузов28. Эта фаза исследований ARF белков подчеркнула важность ARF1 в регуляции транспорта вдоль секреторного пути.
Activation of ARF1 by Sec7-family GEFs. GTP, загруженный на ARF белки, регулируется семейством эволюционно законсервированных GEFs, которые обладают 200 аминокислотным каталитическим Sec7 domain2. Многие ARF GEFs были идентифицированы, включая крупный мультидоменовый GBF1 (Golgi-associated brefeldin A (BFA)-резистентный, см. Table 1) и BIG1 и BIG2 (BFA-ингибируемые) GEFs, которые локализуются в субкомпартментах раннем Golgi и позднем Golgi/endosome, соотв. Они были сгруппированы в соответствии со сходством их последовательностей вне их Sec7 домена29. GBF1 обеспечивает рекрутирование COPI оболочки на cis-Golgi мембраны, в то время как BIG2 регулирует ассоциацию AP-1 и GGAs на trans-Golgi network (TGN)7,30-32. Эти находки указывают на то, что сайт-специфический таргетинг GBF- и BIG-family GEFs на субкомпартменты Golgi может играть важную роль в формировании оболочек в специфических местах.
GBF1 и BIG1 проходят быстрый цикл включения и выхода из мембран33,но обработка BFA залавливает GBF1 и BIG1 на ранних- и поздних-Golgi мембранах, соотв.33-36 (Table 1). Было предположено, что GDP высвобождается из ARF1 и каким-то образом связана с диссоциацией GEF от своего 'рецептора(ов)', процесс, который может быть абортирован добавлением BFA33. Хотя некоторые партнеры по связыванию с BIG- и GBF-family белками были недавно идентифицированы (Table 1), но необходимы дальнейшие исследования, чтобы прояснить, могут ли эти белки и/или возможно липиды, функционировать как специфические рецепторы для ARF1 GEFs на субкомпартментах Golgi.
Важно отметить, что состав мембранных липидов, также как и временные аспекты отпочкования пузырьков существенно покушаются на таргетинг ARF1 на Golgi мембраны. C-терминальная область ARF1-GDP, как было установлено, взаимодействует с цитоплазматическим регионом p23, членом p24 type I трансмембранных Golgi-cargo рецепторов37-40. Вследствие замены нуклеотида, ARF1-GTP диссоциирует из p23 и p24, тем самым предоставляя сайты связывания для coatomer, чтобы инициировать сборку оболочки и упаковку груза28,38 (Fig. 1). ARF1 взаимодействует также с membrin41, ER и Golgi SNARE млекопитающих, который присутствует на покрытых COPI мембранах. Кроме того, ARF1-GTP соединяется с SNAREs, GS15 and YKT6, которые участвуют в ретроградном транспорте40. Хотя всё ещё неясно, как движение вперед-назад ARF1 осуществляется с помощью разных SNAREs, возможно, что это взаимодействие может иметь влияние на ARF1 таргетинг на Golgi субкомпартменты и на отпочковывающиеся от Golgi пузырьки и слияние (discussed in Ref. 42).
GTP hydrolysis on ARF1. GTP гидролиз на ARF1 необходим для диссоциации COPI из транспортных пузырьков43. Этот процесс обеспечивается с помощью семейства ARF GAPs, которое содержит законсервированный zinc-finger мотив каталитического домена. был первым идентифицированным ARF1 GAP в клетках млекопитающих44. В модели, которая была предложена в начале 1990s (Ref. 43), GTP гидролиз необходим для разборки оболочки, а ARFGAP1 функционирует в первую очередь, индуцируя снятие покрытия с пузырьков45,46. Однако, некоторые недавние исследования показали, др. роли ARF1 GAPs. GTP гидролиз на ARF1 необходим для упаковки груза, т.к. покрытые COPI пузырьки, которые сформированы в присутствие неспособного к гидролизу guanosine 5'(gamma-thio)triphosphate (GTP-gamma-S), в основном лишены груза47-50. Имеются также доказательства, что ARFGAP1 может быть компонентом COPI оболочки и может связывать сортировку груза с формированием пузырьков40,51- 54.
Наблюдаемая взаимозависимая динамика ARFGAP1, coatomer и ARF1 на мембранах Golgi в живых клетках указывает на специфическую и аккуратную пространственно-временную регуляцию гидролиза GTP в COPI почках53,54. В этой пересмотренной модели, ARFGAP1 первоначально рекрутируется на Golgi мембраны посредством своего взаимодействия с KDEL рецепторами и цитоплазматическим хвостом p23 и p24 cargo-receptor белков39,55. В этом комплексе GAP активность на ARF1 достаточно низкая, чтобы позволить сборку оболочки и упаковку груза - связывание ARF GAPs с SNARE белками необходимо для этого процесса52,56,57 (Fig. 1). Рекрутирование coatomer и ARF1-GTP на решетку оболочки увеличивает активность GAP40 54 58. Активность ARFGAP1 может также испытывать влияние со стороны изогнутости мембраны, которая является оптимальной в присутствии липидов, котиорый увеличивают изогнутость мембраны46,59. Как таковая, GAP активность д. увеличиваться от края решетки оболочки в направлении кончика почки46,58. ARF1-GDP затем высвобождается из сферической решетки оболочки, которая поддерживается в нестабильном состоянии посредством компенсаторных латеральных взаимодействий между субъединицами coatomer46,60. Кроме того, персистирует кольцо ARF1-GTP на шейке пузырька, т.к. ARFGAP1 исключается из областей с негативным изгибом; это кольцо разбирается когда происходит отщепление пузырька46 (Fig. 1).
Clathrin-coated vesicle budding. ARF1-GTP регулирует формирование clathrin-coated vesicles (CCVs) на TGN и мембранах эндосом путем обеспечения рекрутирования комплексов адапторных белков AP-1, AP-3, AP-4 и GGAs из цитозоля на мембраны26,61-64 (Box 1). Рекрутирование AP-1 на синтетические липосомы и формирование CCVs in vitro нуждается в ARF1-GTP и др. цитозольных факторах65. Однако, потребность в цитозольном факторе для поставки AP-1 может быть обойдена в присутствии липосом, которые выставляют наружу закрепленные на мембране цитоплазматические хвосты AP-1 грузовых белков на свой поверхности66. Напротив, GTP-связанный ARF1 и лишенные белка липосомы, по-видимому, представляют минимальную потребность для формирования содержащих AP-3 CCVs in vitro67. Рекрутирование AP-1 и AP-4 требует непосредственного взаимодействия более чем одной AP субъединицы с GTP-связанным ARF1 (Refs 64,68). Ассоциация AP-1 с мембранами также нуждается в связывании с Golgi, обогащенным phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P)69,70, которое, по-видимому, не зависит от ARF1. Следовательно, PI4P и ARF1 синергично способствуют связыванию AP-1 с мембранами. В этом случае GGAs, кристаллическая структура комплекса между ARF1-GTP и GAT доменом GGA1, показывает, что N-терминальный helix-loop-helix субдомен GGA взаимодействует с switch-I и -II регионами ARF1-GTP71,72.
Факторы, которые контролируют цикл GDP-GTP у ARF1 во время формирования CCVs ещё предстоит определить. Распределение AP-1, AP-3, AP-4 и GGAs зависит от BFA26, это указывает на вовлечение высокого молекулярного веса BFA-чувствительных ARF GEFs. В самом деле, некоторые исследования выявили, что активность BIG2 необходима для локализации на TGN и эндосомах AP-1 и GGAs31,73,74. Находка, что очищенные CCVs содержат мало ARF1, указывает на то, что ARF1 участвует в процессе сборки оболочки и что GTP гидролиз является несущественным для индукции разборки оболочки75, в противоположность к его функции в COPI-обеспечиваемом транспорте. ARFGAP1, который взаимодействует с alpha-придатком AP-1, концентрируется на CCVs76, и его GAP активность стимулируется с помощью AP-1. Это напоминает регуляцию ARFGAP1 с помощью coatomer на COPI пузырьках77. Два др. ARF1 GAPs, AGAP1 и AGAP2, взаимодействуют с и регулируют функцию эндосомных AP-3 и AP-1, соотв.78, 79. Эти находки указывают на то, что взаимодействие специфических ARF GAPs с разными белками оболочки может целенаправленно направлять ARF1 на дискретные места внутри клетки.
ARF1 modulates the structure of the Golgi
Морфология и субклеточное положение комплекса Гольджи зависит как от микротрубочек, так и актинового цитоскелета клеток80. Роль актинового цитоскелета в секреторном пути изучена недостаточно, но имеются примеры ингибирующего эффекта актиновых токсинов на трафик мембран Golgi81. Moreover, several actin-binding and actin-regulatory proteins localize to the Golgi80. Необходимо отметить, что подобные исследования сдерживаются трудностями в детекции высоко динамичного Golgi actin с помощью обычных реагентов, таких как phalloidin82.
ARF1 активация, как было показано, стимулирует сборку spectrin и актинового цитоскелета на мембранах Гольджи83-85 (Fig. 2). первый необходим для обеспечения способности ARF1 контролировать уровни phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) на мембранах Гольджи посредством активации PI4KIII и типа I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase (PIP5K)83,86,87. Точная роль Golgi spectrin всё ещё неопределенна, но включает общее поддержание организации комплекса Гольджи и более динамичное функционирование, связанное с поставкой пузырьков (rev. Ref. 88). Чтобы обеспечивать сборку актина ARF1, как было установлено, облегчает зависимую от комплекса полимеризацию актина в каскаде, который использует CDC42 и его нижестоящий эффектор, N-WASP84,85,89-91 (Fig. 2). GTP-связанный CDC42 ассоциирует с аппаратом Гольджи ARF-зависимым способом путем взаимодействия с gamma-субъединицей COP92. Это взаимодействие прекращается, когда p23 сайт связывания грузовых белков на COPI оккупируется, это указывает на то, что регуляция динамики актина Гольджи с помощью CDC42 может взаимодействовать с процессом почкования85,92,93. Это мнение подтверждается с помощью регуляторной роли CDC42 в ретроградном транспорте от Golgi к ER89,91, и в транспорте от TGN94,95. Недавно было установлено, что , CDC42- и RhoA-GAP белок взаимодействует с GTP-связанным ARF1, это указывает на сочетанный эффект ARF1 и CDC42 в обороте актинового цитоскелета на субкомпартментах Гольджи96 (Fig. 2). Также комплекс из cortactin и dynamin-2 - белков, которые участвуют в ремоделировании актина посредством Arp2/3 комплекса (cortactin) и в отщеплении пузырьков (dynamin-2) - как было показано, регулирует post-Golgi транспорт ниже ARF1 (Ref. 97) (Fig. 2). Всё это указывает на то, что ARF1-регулируемый динамический пул актина облегчает формирование и/или диссоциацию формирующихся пузыртьков от донорских мембран, как это было продемонстрировано для CCVs из TGN97,98.
ARF-based fingerprinting of subcompartment identity. Как эффекторные белки рекрутируются в специфические и отдельные места Golgi путем взаимодействия исключительно с GTP-связанным ARF1? ARF1 в сочетании с др. белком или липидными детерминантами (такими как ассоциации AP-1 с TGN, которые обеспечиваются двойным взаимодействием с GTP-связанным ARF1 и PI4P), является важным механизмом гарантии отличительных особенностей компартмента69. Взаимодействие некоторых ARF GAPs и крупных мультидоменовых ARF GEFs с компартмент-специфическими компонентами, такими как ER-Golgi SNAREs57 и cis-Golgi белок p115 (Ref. 99), соотв., является др. потенциальным механизмом, Также обусловленные small interfering RNA (siRNA) нокдауны специфических изоформ ARF показали, что нокдаун одиночного ARF белка не оказывает эффекта на трафик вдоль секреторного пути, но возможно, что ARF изоформы могут функционировать в специфических парах100. Следовательно, комбинаторные эффекты или взаимное общение между членами классов I и II ARF семейства может обеспечивать др. механизм для специфичности генерации пузырьков.
ARF6 and membrane transport at the cell surface
ARF6 является наименее законсервированным членом семейства белков ARF и обнаруживает 66% идентичных аминокислот с ARF1, но в отличие от ARF1, ARF6 не оказывает влияния на динамику мембран Golgi. Вместо этого он локализуется на плазматической мембране и эндосомных компартментах, где он регулирует трафик эндоцитотических мембран и ремоделирование актина.
Effects of ARF6 on endocytic pathways. Распределения на отдельных периферических мембранах и разнообразие клеточных активностей, которые ассоциируют с ARF6, указывают на то, что активация ARF6 возможно происходит в дискретных местах, в которых он может модулировать некоторые активности, ассоциированные в клеточной поверхностью. В отличие от большинства ARF1 GEFs, все ARF6 GEFs идентифицированы и являются не чувствительными к BFA (Table 1). Возможно также, что некоторые роли ARF6 на клеточной поверхности обеспечиваются его эффектом на метаболизм фосфолипидов. В этом отношении ARF6, как было показано, активирует типа I PIP5K (Refs 101,102) а также phospholipase D (PLD)20,21. Phosphatidic кислота, продукт активности PLD, в свою очередь функционирует как кофактор в активации PIP5K (Ref. 103). Следовательно, возможно, что синергичный эффект ARF6 на PIP5K также как и активность PLD могут приводить к значительному увеличению PI(4,5)P2 на периферии клеток. Установлено, что polyphosphoinositides и PI(4,5)P2 в частности, регулируют clathrin-обусловленный endocytosis104. В самом деле, ARF6 связывается с и активирует PIP5KIgamma, приводя к рекрутированию клатриновых оболочек в препаратах синаптических пузырьков102. ARF6-GTP и PI(4,5)P2 действуют синергично, чтобы рекрутировать AP-2 на липосомы, подчеркивая роль ARF6 в сборке покрытых оболочкой ямок105. Этот эффект ARF6 на клатрин-зависимый эндоцитоз может потенциально регулироваться с помощью ARF6 GAP. В этой связи, SMAP1, недавно идентифицированный ARF6 GAP, как было показано, непосредственно взаимодействует с тяжелой цепью clathrin106.
ARF6-GTP участвует также в clathrin-зависимом эндоцитозе на апикальной 107,108 и базолатеральной109,110 мембранах поляризованного эпителия Madin-Darby canine kidney (MDCK) клеток. На латеральной части мембраны, ARF6 соединяется с и рекрутирует NM23-H1 (Ref. 110), nucleoside diphosphate kinase, которая функционирует как источник GTP для dynamin-зависимого отщепления пузырьков111 (Fig. 3). Устойчивая активация ARF6 ведет к увеличению PI(4,5)P2 на латеральной части мембраны, хотя эндоцитотические пузырьки, которые интернализуются за счет активации ARF6 лишены PI(4,5)P2 мечения109. Это согласуется с мнением, что PI(4,5)P2 облегчает отщепление пузырьков, но также далее метаболизируется на отщепившихся пузырьках. Следовательно, сочетанное действие ARF6 по рекрутированию NM23-H1 и активации PIP5K может служить для облегчения клатрин-зависимого поступления в поляризованные типы клеток, такие как нейроны и эпителиальные клетки.
ARF6-GTP участвует также в интернализации G-protein-coupled рецепторов, beta2-adrenergic рецептора112 и leutinizing hormone рецепторов113. Контакт с обоими типами рецепторов ведет к активации ARF6, которая сопровождается диссоциацией молекул arrestin и интернализацией рецепторов посредством clathrin-обеспечиваемого пути. В некоторых типах клеток ARF6 ассоциирует с caveolae-обогащенными фракциями мембран, а ингибирование активности ARF6 приводит к ингибированию передачи сигналов в ответ на hepatocyte growth factor (HGF)109, vascular endothelial growth factor114 и онкогенный H-Ras115.
ARF6 регулирует также интернализацию лигандов посредством уникального clathrin- и caveolae-независимого пути (rev. Ref. 116) (Fig. 3). Лиганды, которые интернализуются с помощью этого пути, включают major histocompatibility complex class I protein (MHC class I), M2-muscaranic acetylcholine рецепторы, beta1 integrins и peripheral myelin-membrane protein (PMP22)116. Этот clathrin-независимый ARF6-регулируемый путь участвует также в негативной регуляции поверхностного MHC class I с помощью HIV белка Nef117. После интернализации ARF6 и др. компоненты мембран рециклируют обратно на клеточную поверхность, тогда как cargo ligands сливаются с теми, что интернализованы посредством классического эндоцитического пути118. Инактивация ARF6 необходима для трафика посредством этого пути, т.к. экспрессия ARF6 мутанта, который дефектен по GTP гидролизу. ведет к накоплению крупных похожих на вакуоли структур, которые содержат PI(4,5)P2 и F-actin119. Др. уникальная роль, приписываемая ARF6 связана с регуляцией маршрута трафика carboxypeptidase E (CPE) из плазматической мембраны в Golgi120. Блокирование взаимодействия ARF6 с CPE приводит к ингибированию рециклинга CPE из плазматической мембраны в Golgi.
Интригует, что ARF6, по-видимому, играет роль в интернализации лиганда посредством множественных эндоцитотических путей. ARF6-обеспечиваемый нокдаун с использованием siRNAs показывает, что ARF6 регулирует интернализацию большинства G-protein-coupled рецепторов, независимо от пути их поступления121. Итак, рецепторы, интернализуемые посредством clathrin, caveoale и clathrin- и caveolae-независимых путей нуждаются в активности ARF6.
ARF6 is required for endosome recycling. Некоторые макромолекулы интернализуются с помощью clathrin-зависимого или -независимого эндоцитотического пути и поставляются, чтобы сортировать эндосомы122. Рециклинг плазматической мембраны происходит непосредственно из sorting эндосом или посредством pericentriolar-recycling эндосомного компартмента122. Recycling эндосомы сами по себе согласуются с гетерогенным субнабором популяций эндосом, сложность которых может варьировать в зависимости от типа клеток.
Потребность в ARF6 для рециклинга эндосом впервые продемонстрирована на клетках Chinese Hamster Ovary (CHO), в которых экспрессия доминантно-негативного мутантного ARF6 блокирует рециклинг эндосомных лигандов9,123. Сходным образом, EFA6, ARF6-специфический GEF, регулирует конституитивный рециклинг эндосом на клеточную поверхность124 посредством пути, который нуждается в активности PLD2125. В CHO клетках sphingosylphosphorycholine, основная масса маркера плазматической мембраны, проходит транзитом эндоцитотическую систему способом, который кинетически и морфологически идентичен тому, который связан с рециклингом рецепторов122,126. Следовательно, в клетках такого типа, как CHO, ARF6 может также регулировать выход основной массы плазматической мембраны. В клетках HeLa активность ARF6 затрагивает рециклинг интегральных белков плазматической мембраны, которая лишена цитоплазматического AP-2 и clathrin-сортирующих последовательностей, включая IL2 рецепторную alpha-субъединицу, MHC class I и glycosylphosphatidylinositol (GPI)-закрепленные белки118,127. ARF6-меченные recycling трубочки в этих клетках обнаруживают минимальное перекрывание с ранними эндосомами и радиально мигрируют от околоядерной области клетки на периферию клетки. Рециклинг посредством этой тубулярной системы также использует EPS15 homology domain содержащий белок EHD1 (Ref. 128), Rab22 (Ref. 129), PLD130 и TBC (TRE2/BUB2/CDC16) доменовый белок, TRE17 (Ref. 131). Трафик белков плазматической мембраны, которые лишены или clathrin-зависимых сортирующих сигналов или который обеспечивается с помощью классического clathrin-обесечиваемым пути, д., по-видимому, в конечном итоге конвергировать в общие recycling эндосомы, в самом деле, интернализованный beta1 integrin в клетках HeLa, который рециклирует на поверхность ARF6-зависимым способом, ко-локализуется с интернализованным transferrin, малым GTP-связывающим белком Rab11 и с MHC class I молекулами в recycling эндосомах132. Интересно, что ARF6 и Rab11 обладают общими эффекторными молекулами, которые регулируют события рециклинга мембран во время cytokinesis (see below). Сходным образом в PC12 клетках, ARF6 обладает частично перекрывающимся распределением с transferrin рецепторами и Rab11 (Ref. 133).
Имеются противоречивые доказательства ARF6-регулироемой доставки и инсерции recycling эндосомной мембраны на клеточную поверхность, нуждающейся в активности PLD125,130 и поддерживаемой с помощью vesicle-tethering exocyst комплекса134. ARF6-GTP взаимодействует с Sec10, с субъединицей exocyst комплекса, который локализуется на TGN , а также на recycling эндосомах и перераспределяется, на клеточной поверхности после активации ARF6 (Fig. 3). ACAP1, ARF6 GAP, который ассоциирует с ARF6-позитивными тубулярными структурами и выпячиваниями135, также участвует в эндосомном рециклинге transferrin рецепторов136 и beta1 integrin рецепторов, хотя рециклинг beta1 integrin зависит от его фосфорилирования с помощью AKT/protein kinase B (PKB)137.
Что же лежит в основе функции ARF6-обусловленного рециклинга мембран в разных типах клеток? Ответ на этот вопрос всё ещё неясен, но удивительно, что ARF6-обусловленный рециклинг влияет на клеточные функции, такие как клеточная миграция, инвазия клеток и фагоцитоз, которые нуждаются во временной поляризации плазматической мембраны клеток. Следовательно, возможно, что ARF6 регулирует инсерцию белков плазматических мембран, рецепторов и основной массы мембран в определенных местах клеточной периферии посредством его GDP-GTP цикла (Figs 3,4).
ARF6, как полагают, также играет роль в регулируемой секреции в специализированных типах клеток, таких как хромаффинные клетки надпочечников и PC12 клетки133,138-140. Во многих отношениях регулируемый экзоцитоз сходен с ARF6-индуцируемым рециклингом эндосомных мембран. Ни один из процессов не является чувствительным к воздействию BFA, но оба стимулируются с помощью GTP-gamma-S, неспособного к гидролизу аналога GTP141. Отсутствие потребности в гидролизе GTP во время ARF6-обеспечиваемого эндосомного рециклинга и регулируемой секреции отличают эти процессы от конституитивного экзоцитоза с TGN на клеточную поверхность, процесс, который ингибируется с помощью GTP-gamma-S.
ARF6 regulates actin and membrane remodelling
Помимо своей роли трафике эндосомных мембран ARF6 участвует также в ремоделировании актина на периферии клетки, а также в событиях, которые необходимы для быстрых изменений морфологии клеточной поверхности.
Effects of ARF6 on actin remodelling. ARF6-регулируемое ремоделирование актина, как полагают, необходимо для образования псевдоподий и мембранных оборок (ruffles)142,143, comet-tails на эндосомах144, выростов нейритов, распространения клеток145,146, миграции клеток109,147,148 и фагоцитоза149-152. Эти эффекты ARF6 на актиновый цитоскелет, как полагают, происходит посредством активации Rac1 GTPase и/или липидного метаболизма. Как же ARF6 модулирует активность Rac1? В клетках HeLa и CHO ARF6 облегчает перераспределение локализованного на эндосомах Rac1 на клеточную посерхность153,154. В мигрирующем эпителии ARF6 GEF ARNO способствует активации Rac1 путем рекрутирования состоящего из двух частей Rac1 GEF, комплекса DOCK180-ELMO155. В клетках CHO индуцированное ARF6 увеличение Rac1 сопровождается снижением уровней Rho-GTP, это ведет к редукции стрессовых волокон посредством ещё не известного механизма154. ARF6,как было показано, способствует ремоделированию актина посредством его взаимодействия с POR1 (partner of Rac1) и Arfaptin-2 (Refs 17,143). Arfaptin-2, как известно, ингибирует функцию 26S proteasome, и таким образом модулирует некоторые клеточные проценссы, которые зависят от функции протеосом156,157. Неясно, может ли эффект Arfaptin-2 на протеосомы связать с его ролью по ремоделированию поверхности, но недавние находки, которые показали, что активность Rho family GTPases может модулироваться протеосомами158,159, делают эту связь интригующей.
В поляризованных MDCK клетках, которые индуцированы к рассеиванию, эффект ARF6 на активацию Rac1 двухфазный160. Инициальная стадия рассеивания клеток сопровождается снижением активности Rac1-GTP, что коррелирует с потерей полимеризованного актина в местах межклеточных контактов. Это сопровождается восстановлением высокой активности Rac1-GTP, когда клетки становятся способными к миграции (Fig. 5). Первоначальное снижение активации Rac1 обусловлено также, по-видимому, по крайней мере, частично ARF6-зависимым рекрутированием NM23-H1 (Refs 110,160). NM23-H1 подавляет клеточные уровни Rac1-GTP, возможно путем связывания и секвестрирования TIAM1, Rac1 GEF161. Следовательно, путем модулирования активации Rac1 цикл ARF6-GTPase способствует приобретению миграторного фенотипа.
ARF6 может также модулировать актиновый цитоскелет посредством своего эффекта на липидный метаболизм. ARF6 активирует PLD и PIP5K, a активация обоих этих энзимов может непосредственно или косвенно приводить к накоплению PI(4,5)P2. PI(4,5)P2, как известно, регулирует capping актина и активирует некоторые актин-связывающие белки162. В самом деле, распределение ARF6-GTP перекрывается с PIP5K101,119 на клеточной поверхности, а ARF6-индуцированная активность PLD действует сочетанно с активацией Rac1, чтобы способствовать миграции клеток147.
Remodelling of the plasma membrane. Учитывая эффекты активации ARF6 на структурную организацию мембран и актина на периферии клеток, неудивительно, что его GTPase цикл может влиять на некоторые клеточные, которые необходимы для быстрых изменений в морфологии клеточной поверхности (Fig. 4). Во время фагоцитоза мембраны из внутренних хранилищ поставляются к местам интернализации частиц на плазматической мембране, чтобы приспособиться к выпячиваниям псевдоподий163. Ингибирование активности ARF6 в макрофагах приводи к ранней блокаде выпячиваний псевдоподий и предупреждает переваривание частиц149,150,164. Фактически ARF6 подвергается временной активации в начале фагоцитоза и контролирует высвобождение vesicle-associated membrane protein-3 (VAMP3, известного также как cellubrevin) мембран из recycling эндосом в выпячивающиеся псевдоподии150. Активация ARF6 вовлекается также в сигнальные события, которые участвуют в межклеточном слиянии, обусловленном плазматической мембраной, миобластов, что указывает на роль ARF6 в развитии мышц165.
В эпителиальных клетках ARF6 является важным регулятором межклеточной адгезии166. ARF6-GTP способствует интернализации E-cadherin из мест межклеточных контактов на ранние эндосомы, это ведет к разборке adherens junctions. Напротив, экспрессия доминантно-негативной мутации ARF6 стабилизирует эпителиальный фенотип и ингибирует HGF-индуцированную интернализацию E-cadherin. ARF6 может также регулировать клеточную адгезию с extracellular matrix (ECM) посредством своего влияния на распределение рецепторов beta1 integrin, хотя это еще не доказано. Однако, недавнее исследование показало, что ARF6 регулирует рециклинг syndecan, heparan sulfate proteoglycan ECM белка, посредством процесса, который нуждается во взаимодействии PDZ-домен-содержащего адаптора, syntenin, с PI(4,5)P2 на recycling эндосомах167.
Инвази я опухолевых клеток через внеклеточный матрикс сопровождается образованием invadopodia, богатых актином выпячиваний на слипчивой поверхности клеток в местах деградации ECM168. In vitro в инвазивных клетках меланомы и линиях клеток рака груди было показано, что ARF6-GTPase цикл может влиять на инвазивный потенциал опухолевых клеток169,170, т.к. истощение клеточных уровней ARF6 или эксперссия доминантно-негативной мутации ARF6 блокирует инвазию клеток.
ARF6 and cytokinesis. Динамические изменения в структуре актина и мембран в борозде деления обеспечивают процесс цитокинеза во время клеточных делений. Анализ активации эндогенного ARF6 во время течения митоза показал временный пик уровней ARF6-GTP во время цитокинеза171 и локализовал ARF6-GTP в формирующейся борозде деления, а затем в середине тела перед разделением дочерних клеток171. Кроме того, истощение ARF6 с использованием siRNAs показало, что ARF6 необходим для финальных стадий цитокинеза172. Хотя механизм, с помощью которого ARF6 регулирует процесс цитогенеза, еще предстоит выяснить, он возможно связан с его эффектом на трафик эндосом во время цитокинеза173. Эффекты ARF6 на борозду деления, как недавно было показано, обеспечиваются посредством arfophilin белков и комплекса exocyst174. Arfophilin-1 и -2 являются структурно родственными белками, которые формируют тройные комплексы с Rab11 и ARF6 и, следовательно, они могут связывать recycling эндосомы с бороздой деления посредством взаимодействий с exocyst docking комплексом174. Всё это подчеркивает важность пространственной и временной регуляции этой GTPase во время процессов, которые участвуют в изменениях формы клеток и в ремоделировании плазматической мембраны.
Concluding remarks
In light of rapidly evolving findings, the initial view that ARF1 and ARF6 had unique non-overlapping roles in cells requires some reconsideration. Although these two ARF proteins have distinct subcellular locations, parallels in their biological roles are becoming evident. ARF1, besides its well-recognized function in vesicle formation, also influences actin assembly at the Golgi to facilitate vesicle fission. Similarly, ARF6 facilitates membrane invaginations at the cell surface during endocytic processes through its effect on membrane lipids and the recruitment of effector molecules, in addition to promoting peripheral actin rearrangements. The multiple roles of individual ARF proteins, irrespective of their subcellular distribution, reflects the complete precision that is required for the recognition of multiple regulators and effector molecules.
An important challenge for the future is to understand how the interactions of ARF proteins with their many GEFs, GAPs and effectors are spatially and temporally regulated. Also, what generates localized determinants for effector recruitment? It is becoming increasingly clear that ARF proteins must converse with other types of small GTP-binding proteins, particularly those of the Rho and Rab families. Identification of interacting proteins, as well as the development of techniques that allow analyses of GTPases with their effectors in cells, will shed light on the interactions between signalling pathways that are mediated by multiple GTPases. A more complete description of such signalling networks is another challenge for the years to come. Finally, all small GTP-binding proteins use the classic GTP–GDP conformational switch to serve as 'cellular regulators', but these proteins have evolved such that they can be readily grouped into distinct families. Delineating the unique biochemical characteristics that dictate the specific functions of each of these protein families will bolster our understanding of cellular regulation by small GTPases.
