The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death
Richard J. Youle & Andreas Strasse Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 47-59 (January 2008) | doi:10.1038/nrm2308
BCL-2 family proteins, which have either pro- or anti-apoptotic activities, have been studied intensively for the past decade owing to their importance in the regulation of apoptosis, tumorigenesis and cellular responses to anti-cancer therapy. They control the point of no return for clonogenic cell survival and thereby affect tumorigenesis and host–pathogen interactions and regulate animal development. Recent structural, phylogenetic and biological analyses, however, suggest the need for some reconsideration of the accepted organizational principles of the family and how the family members interact with one another during programmed cell death. Although these insights into interactions among BCL-2 family proteins reveal how these proteins are regulated, a unifying hypothesis for the mechanisms they use to activate caspases remains elusive.
Рис.1. | Sequence alignment of core BCL-2 family proteins and BH3-only proteins.
Рис.2. | Scheme depicting intrinsic and extrinsic pathways of apoptosis.
Рис.3. | Space-filling models of the structures of BAX, BCL-W and BCL-XL bound to a BIM BH3-region peptide.
Рис.4. | BH3-only protein binding specificity for BCL-2 homologues.
Рис.5. | Conformational changes in BCL-2 family members during apoptosis.
Box 1 | The mechanism of CED-9, the C. elegans orthologue of BCL-2
(B-cell lymphoma-2) ген был открыт в точке разрыва в t(14;18) хромосомной транслокации в B-cell follicular лимфоме, где его транскрипция становится излишне управляемой с помощью промотора гена тяжелой цепи иммуноглобулина и энхансера на хромосоме 14 (Refs 1-3). Было установлено, что избыточная экспрессия BCL-2 не способствует пролиферации клеток как большинство ранее открытых онкогенов, а скорее избыточная экспрессия BCL-2 ингибирует клеточную гибель4. Апоптоз сегодня принимается всеми как важный механизм опухолевой супрессии. Мутации в определенных онкогенах, которые приводят в результате к активации клеточной пролиферации, такие как нарушенная экспрессия MYC, нуждаются во второй мутации, чтобы ингибировать апоптический аппарат, чтобы прогрессирование опухоли осуществлялось более эффективно5, 6. Т.о., комбинированная избыточная экспрессия BCL-2 и MYC сильно усиливает др. др. при развитии лимфом и и определенных типов раковых опухолей7. Теперь ясно, что помимо своей роли в канцерогенезе BCL-2 и др. члены семейства существенны для ряда программ апоптоза, включая онтогенетически запрограммированную клеточную гибель, оборот ткани и защиту хозяина от патогенов.
У млекопитающих имеется, по крайней мере, 12 стержневых белков семейства BCL-2, включая самого BCL-2 т белки, которые имеют или трехмерное (3D) структурное сходство или предсказуемую вторичную структуру, которая сходна с BCL-2 (Fig. 1). Эти белки обладают рядом биологических активностей от ингибирования до способствования апоптозу. Многочисленные т. наз. BH3-only белки обладают частичной гомологией др. с др. и с остальным BCL-2 семейством белков лишь благодаря короткому 8. Иная, чем у , предсказуемая общая структура BH3-only белков, по-видимому, указывает, что они лишены тесных эволюционных взаимоотношений со стержневыми членами BCL-2 семейства9. Но все BH3-only белки взаимодействуют с и регулируют стержневые белки семейства BCL-2, чтобы способствовать апоптозу. Некоторые члены из этих двух классов были нокаутированы у мышей, чтобы выяснить их физиологическую роль, перекрывание и взаимодействия in vivo (Table 1).
Все пути к апоптозу конвергируют на активации каспаз, которые являются cysteinyl aspartate proteases, которые координируют эффективно разборку и поглощение обреченных клеток (Fig. 2). Различают два пути клеточной гибели по тому, нуждаются ли они в белках семейства BCL-2 и какие каспазы являются критическими для их исполнения. Внутренне присущий путь - также называемый BCL-2-регулируемый или митохондриальный путь (по роли этих органелл) - активируется различными онтогенетическими сигналами или цитотоксическими инсультами, такими как вирусная инфекция, повреждения ДНК и устранение факторов роста, и это четко контролируется с помощью белков семейства BCL-2.Этот путь преимущественно ведет к активации (Ref. 11), но, по крайней мере в определенных типах клеток, этот прирожденный путь может осуществляться в отсутствие caspase-9 или её активатора, apoptotic protease-activating factor-1 ()12.
Внешний или death-рецепторный путь запускается за счет лигандирования (ligation) т. наз. death рецепторов (членов семейства tumour necrosis factor , таких как Fas или TNF receptor-1 (TNFR1)), которые содержат внутриклеточный , который может рекрутировать и активировать посредством адапторного белка Fas-associated death domain (FADD; также известного как MORT1) на клеточной поверхности. Такое рекрутирование вызывает последующую активацию нижестоящих (эффекторных) каспаз, таких как caspase-3, -6 или -7, без участия семейства BCL-2. В некоторых клетках, наиболее четко в гепатоцитах, внешний путь может пересекать внутренний путь посредством caspase-8 обеспечиваемым расщеплением активации про-апоптического BH3-only белка BID13,14. C-терминально укороченная форма BID (tBID) транслоцируется в митохондрии и способствует дальнейшей активации каспаз (caspase-9 и эффекторных каспаз caspase-3, -6 и -7) посредством внутреннего пути. В этой ситуации, потеря BID или избыточная экспрессия ингибирует клеточную гибель13.
BCL-2 family proteins have opposing apoptotic activities. Члены семейства BCL-2 были подразделены на три класса. Один класс ингибирует апоптоз (BCL-2, BCL-XL, , , (известен также как BCL-2L10) и (известен также как BCL-2A1), тогда как второй класс способствует апоптозу (, и (известен также как MTD)). Третьий дивергентный класс BH3-only белков (, (известен также как BLK или NBK), BID, (известен также как death protein-5 (DP5)), (известен также как BOD), , NOXA и (известен также как BBC3)) имеет законсервированный BH3 домен, который может соединяться и регулировать анти-апоптические BCL-2 белки, чтобы способствовать апоптозу (Fig. 1). Очевидно, что члены про-апоптического семейства BAX и BAK являются критическими для индукции проницаемости outer mitochondrial membrane (OMM) и последующего высвобождения апоптических молекул, (таких как cytochrome c и (известного также как SMAC)), которые ведут к активации каспаз. Члены анти-апоптического семейства, таие как BCL-2 и BCL-XL, ингибируют BAX и BAK. Недавние данные показывают, что BH3-only белки дерепрессируют BAX и BAK за счет непосредственной связи и ингибирования BCL-2 и др. анти-апоптических членов семейства15. Напротив. противоположная модель постулирует прямую активацию BAX и BAK с помощью некоторых BH3-only белков (особенно BIM, tBID и PUMA)16 (Fig. 2).
BAX и BAK способствуют активации каспазы за счет своих эффектов на митохондрии. Каждый непосредственно или косвенно из этих двух про-апоптических членов BCL-2 семейства индуцирует высвобождение белков из пространства между внутренней и наружной мембранами митохондрий17. Этот процесс (MOMP) ведет к высвобождению cytochrome c и др. растворимых белков в цитозоль. Обычно считается, что BAX и BAKобразуют поры в мембранах, биохимическая природа таких пор и как анти-апоптические белки семейства BCL-2 могут регулировать их, остается ключевым и дискуссионным вопросом в области клеточной гибели18. В то же самое время. когда высвобождается cytochrome c (или непосредственно перед этим), BAX и BAK индуцируют фрагментацию митохондрий на более многочисленные и более мелкие единицы, это подтверждает связь между процессом деления митохондрий и функциями семейства BCL-219.
Как только OMM оказывается проницаемой, то растворимые белки диффундируют из межмембранного пространства в цитозоль, где они способствуют активации каспаз. Наиболее изученным из этих белков cytochrome c, который соединяется с APAF1 и ведет к сборке гептамерного белкового кольца, наз. , которая может связывать pro-caspase-9 и индуцировать её активацию посредством конформационных изменений20, 21. Cytochrome c-APAF1-зависимая активация caspase-9 абсолютно необходима для процессов клеточной гибели нейронов и фибробластов22. Однако, в дополнение к этому процессу лимфоциты, по-видимому, могут использовать альтернативный APAF1-, caspase-9- и cytochrome c-независимые, но зависимые от про-апоптических членов семейства BCL-2 пути для активации каспаз и гибели клеток12, 22. Интересно. что активация каспаз в лимфоцитах может быть умножена с помощью APAF1, даже если APAF1 не включен в апоптосомы22.
Один APAF1-независимый путь активации каспаз имеет отношение к ингибированию каспаз с помощью (IAPs), таких как , которые соединяются и нейтрализуют определенные каспазы (такие как caspase-9 и caspase-3). Этому ингибирующему действию IAPs может противодействовать связывание DIABLO, который высвобождается из митохондрий после активации BAX и/или BAK. Однако, DIABLO-дефицитные мыши23, также как и XIAP-дефицитные мыши24, не дают достоверных апоптических фенотипов, это указывает на то, что новые процессы активации каспаз ущё предстоит открыть. Некоторые родственные APAF1 белки, наз. , регулируют альтернативные пути активации каспаз, которые возникают в в процессе не-апоптической защиты хозяина, они ассоциируют с врожденным иммунитетом и служат в качестве примеров путей, которые могут также выполнять роль в время апоптоза25. Один из таких NOD-подобных рецепторов, NALP1, может регулироваться с помощью BCL-2 и BCL-XL26 таким способом. который напоминает активацию каспаз у червей (Box 1).
BCL-2 и BCL-XL, по-видимому, контролируют клеточную жизнеспособность вне оси APAF1-caspase-9. Если активация каспазы ингибируется за счет потери APAF1 или caspase-9, или дазе за счет комбинированной потери caspase-9 и caspase-2, то скорость приобретения апоптической морфологии миэлоидными предшественниками и мастоцитами, индуцированной удалением ростовых факторов или повреждениями ДНК, может быть существенно задержана. Однако, хотя начало апоптической морфологии может быть задержано, но клетки всё-таки теряют потенциал образования колоний и в результате эффективно гибнут в отличие от клеток, которые избыточно экспрессируют BCL-2 или BCL-XL27, 28. Т.о., регуляция степени апоптоза, которая контролируется с помощью семейства BCL-2 , по-видимому, является наиболее распространенной ступенью финального предопределения для решения вопроса жизни или гибели клетки. Разрушение митохондрий с помощью BAX и BAK может быть одной из причин возможной клоногенной клеточной гибели в отсутствие активации апоптосом. Обычно активация каспаз быстро и эффективно обеспечивает разрушение и устранение клеток. Когда каспазы блокированы, то некоторые признаки апоптоза могут быть потеряны (или задержаны), это приводит к тому, что клетки погибают более медленно в результате обусловленного семейством BCL-2 разрушения митохондрий или за счет новых путей активации каспаз, которые ещё не охарактеризованы.
Structure and evolution
Стержневые multi-BH domain члены семейства BCL-2 и, неожиданно, BH3-only белок BID (Fig. 1) имеют законсервированные области гомологии последовательностей и сходны с предсказываемой вторичной структурой. Структура 7 таких белков (BCL-XL29, BCL-2 (Ref. 30), BCL-W31, 32, MCL1 (Ref. 33), BAX34, BAK35 and BID36, 37) обнаруживает удивительное сходство, которое является интригующим в свете того, что некоторые являются про-апоптитическими, а др. анти-апоптическими. Ks-BCL-2, вирусный гомолог BCL-2 (Ref. 38), также как и два вирусных белка без видимого сходства последовательностей с белками семейства BCL-2, M11L39, 40 and N1L41, обладают спиральной складкой, которая сходна с таковой у BCL-XL, и они ингибируют апоптоз, это указывает на то, что некоторые вируся используют членов семейства BCL-2 чтобы противодействовать защите хозяина.
Трехмерные структуры 7 стержневых белков семейства BCL-2 , упомянутых выше, обнаруживают некоторые характерные отличия между анти-апоптическими членами (такими как BCL-XL и MCL1) и про-апоптическими членами (такими как BAX и BID). Все 7 белков являются спиральными пучками с гидрофобной helix-turn-helix шпилькой, которая фланкируется с обеих сторон парами amphipathic спиралей. Исключая вирусные анти-апоптические BCL-2-подобные белки, BCL-2 гомологи, по-видимому, обладают С-терминальными мембран-связывающим доменами. Кроме того, про-апоптический BID , по-видимому, myristoylated, чтобы обеспечить прикрепление к мембране42. В трех белках, BAX, BCL-W и MCL1, С-терминальный якорь был изучен при структурном анализе и он сравним с гидрофобным карманом, формируемым с помощью BH1, -2 и -3 регионов. Тот же карман, который секвестрирует С-терминальный мембранный якорь, может также соединяться с пептидами BH3-доменовой последовательности BAK, BAD и BIM43-45, это указывает на то, что он также участвует в димеризации с белками BH3-only и/или с членами multi-BH-домен-содержащего семейства BCL-2 (Fig. 3). Увеличенный BIM BH3 пептид. который состоит из 23 аминокислот в длину, присоединяется вдоль гидрофобной борозды BCL-XL, однако он инвертирован в направлении C- к N-терминальной спирали относительно ориентации у BAX и BCL-W C-терминальных мембранных якорей45 (Fig. 3).
Классически, BH3-only белки были определены. как имеющие гомологию со стрежневыми членами семейства BCL-2 только по BH3 домену. Недавний анализ последовательностей показал, что помимо BID, белки BH3-only имеют предсказуемую вторичную структуру или детерминированные 3D структуры, которые не родственны членам стержневого BCL-2 семейства и за исключением BID, они приобретают BH3 мотивы благодаря конвергентной эволюции9. Характерным примером BH3-мотив содержащего белка, который во всем остальном не родственен стержневому семейству BCL-2, является MULE, , которая, как полагают, нацелена на MCL1 для убиквитилирования и протеосомной деградации. MULE имеет BH3 домен и может в общих чертах рассматриваться, как принадлежащий к классу BH3-only белков, которые взаимодействуют с и регулируют др. членов BCL-2 семейства46, 47 (Fig. 4). Даже белок, регулирующий аутофагию, beclin-1 , как полагают. соединяется с BCL-2 посредством BH3 домена, хотя необходимы дополнительные эксперименты для установления функциональной взаимосвязи48. BAD, BMF и BIM по сути не структуированы49 и вместе с PUMA, эти белки вряд ли являются гомологами core BCL-2 семейства на основании предсказаний вторичной структуры (Fig. 1).
Итак, BH3-only белки включают различные белки, которые обладают общим одиночным мотивом, который позволяет им соединяться и регулировать членов core BCL-2 семейства. BID, напротив, является единственным BH3-only белком с установленной структурой, которая помещает его прямо к членам семейства core BCL-2, это вообще-то объясняет. почему BID обладает определенными общими свойствами с членами мультидоменового BCL-2 семейства. такими как способность олигомеризоваться50 и делать проницаемыми мембраны51. С помощью филогенетического анализа семейства BCL-2 получена важная информация о происхождении членов стержневого семейства BCL-2 (Box 2) и BH3-only белков и подтверждено, что многие из этих белков могут обладать биологическими активностями помимо регуляции клеточной гибели9, 52.
BCL-2 family protein activation
BH3-only белки являются про-апоптическими и действуют как инициальные сенсоры апоптических сигналов, которые испускаются в результате различных клеточных процессов. Экспрессия BH3-only белка может быть индуцирована с помощью транскрипционных факторов. Напр., NOXA и PUMA индуцируются с помощью опухолевого супрессора p53 в ответ на повреждения ДНК53- 55, а BIM индуцируются с помощью класса O forkhead box transcription factor-3A (FOXO3A) в ответ на истощение фактора роста56 и с помощью транскрипционных факторов CEBPalpha (CCAAT-enhancer binding protein-alpha) или CHOP (CEBP homologous protein) в ответ на эндоплазматического ретикулема57. BH3-only белки могут также активироваться пост-трансляционно; напр., BAD активируется за счет потери фосфорилирования >59, 60; BIM активируется за счет высвобождения из 61 или за счет потери extracellular signal-regulated kinase (ERK)-обеспечиваемого фосфорилирования (которое предназначено для убиквитилирования и протеосомной деградации здоровых клеток)62, 63; BMF активируется за счет высвобождения из actin-myosin motor комплексов64; а BIK активируется с помощью неизвестного механизма в ответ на ингибирование синтеза белка65.
Регуляция экспрессии уровней анти-апоптических белков семейства BCL-2 является др. способом, с помощью которого клетки могут регулировать. Напр., BCL-XL может быть транскрипционно индуцирован с помощью факторов роста посредством пути Janus kinase-сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции , чтобы обеспечить жизнеспособность клеток66. MCL1 быстро деградируется с помощью ubiquitin-proteasome пути в ответ на истощение cytokine или др. death стимулы (такие как УФЛ) и может позитивно регулироваться пост-транскрипционно, предупреждая апоптоз путем ингибирования скорости деградации46, 67. Регуляция уровней экспрессии про-апоптических белков BAX и BAK is менее очевидна и белки, по-видимому, постоянно экспрессируется на более или менее постоянном уровне. BAX иd BAK регулируются прежде всего пост-трансляционно с помощью др. членов семейства BCL-2 семейства.
Когда BH3-only белки индуцируются или активируются, то они взаимодействуют с белками стержневого семейства BCL-2, способствуя апоптозу. Соединение BH3-only белков или BH3 пептидов со специфическими членами анти- и про-апоптических BCL-2 семейств было установлено с использованием дрожжевого двугибридного анализа, plasmon resonance binding подхода и с помощью пермеабилизации бесклеточных митохондрий и липосом 68- 73. В результате было показано, что некоторые BH3-only белки, такие как BIM и PUMA, соединяются со всеми членами анти-апоптического BCL-2 семейства, тогда как др., такие как BAD и NOXA, соединяются только с определенными членами анти-апоптического BCL-2 семейства (Fig. 4). Помимо взаимодействия с членами анти-апоптического BCL-2 семейства, некоторые сообщения указывают на синергию BID или BIM с BAX с помощью метода пермеабилизации бесклеточных мембран, которая подтверждает, что некоторые BH3-only белки могут непосредственно соединяться и активировать BAX и BAK70-72. Однако, трудно выявить связывание BID, tBID или BIM полной длины с BAX или BAK15, хотя модифицированные BH3 пептиды могут соединяться с BAX и/или BAK74. Др. модели, при которых BH3-only белки непосредственно активируют BAX и BAK, ставятся под вопрос благодаря результатам от Bim/Bid двойных нокаутных мышей и от их клеточных линий, которые обнаруживают, что подобные предполагаемые прямые активаторы BAX и BAK не нужны для большинства апоптических путей15. Т.о.. известные BH3-only белки. по-видимому, индуцируют апоптоз прежде всего путем ингибирования членов анти-апоптического BCL-2 семейства, высвобождая тем самым BAX и BAK, чтобы вызывать MOMP и активацию каспазного каскада (Fig. 2). Точные биохимические механизмы, которые приводят к активации BAX и BAK остаются неизвестными.
Dynamics of subcellular localization
Анти-апоптический BCL-2 белок внедряется в ER, ядерную оболочкук и OMM с помощью гидрофобного C-терминального пронизывающего мембрану домена с большей частью его аминокислот в цитозоле75, 76. Хотя BCL-2 в любой из этих субклеточных локализаций может блокировать апоптоз, функция BCL-2 в ER и ядерной оболочке менее ясна по сравнению с таковой в митохондриях77, 78.
В противоположность BCL-2, BAX в основном цитозольный и секвестрирует свой гидрофобный С-терминальный мембранный якорь в своем BH3-связывающем кармане (Fig. 3), с минимальной фракцией слегка связанной с OMM79. BAX , по-видимому, существует как мономер в цитозоле клеток скорее, чем связан с каким-либо членом анти-апоптического BCL-2 семейства80. Во время индукции апоптоза BAX специфически транслоцируется в митохондрии (see (movie)), где он внедряется в OMM в качестве интегрального мембранного белка81, используя свой С-терминальный мембранный якорь82, вообще-то проникновение в органеллу специфицируется с помощью определенных областей на N конце83. Эта ступень транслокации BAX, хотя и обратима в определенных ситуациях, обычно тесно коррелирует с необратимой детерминацией клеток к гибели и высвобождению cytochrome c.
BOK также транслоцируется из цитозоля в митохондрии во время апоптоза84, тогда, когда BAK уже расплагается на OMM (see subcellular localization of BCL-2 family members in (table)) в здоровых клетках, где он, как полагают, соединяется с MCL1 (Ref. 67) и с BCL-XL73. Особенно эксперименты по взаимодействию BAK-MCL1 и BAK-BCL-XL, базирующиеся на экстракции детергента из мембранных белков, которые, в некоторых случаях, могут вызывать артефактные взаимодействия среди белков семейства BCL-285. Хотя белок OMM каналов VDAC2 (voltage-dependent anion channel-2) также, по-видимому, соединяется с BAK86 и является важным для импорта BAK в OMM87, Vdac1/Vdac2/Vdac3 тройные нокаутные мыши обладают нормальным апоптозом88, указывая на незначительную или отсутствие роли VDACs в регуляции белка семейства BCL-2 . Локализация в митохондриях BAK может быть следствием помещения MCL1 в BH3 карман BAK и вытеснения С-терминального мембранного якоря, позволяя ему взаимодействовать с мембранами. Хотя домен BH3 очевидный кандидат домена у MCL1 для такого взаимодействия, но он не экспозирован в растворимой структуре MCL133. С-терминальный мембранный якорь BCL-XL, как полагают, опосредует связывание с BAX путем подгонки к его BH3-связывающему карману в транс-положении89, это указывает на др. способ, с помощью которого BCL-XL и MCL1 могут взаимодействовать с BAK. После индукции апоптоза MCL1 деградируется (по крайней мере в определенных типах клеток в ответ на цитотоксические стимулы)67, 90 и/или MCL1-BAK и BCL-XL-BAK взаимодействия прекращаются с помощью BH3-only белков, таких как NOXA, BIM73 или BIK65, которые высвобождают BAK, чтобы способствовать апоптозу.
Т.к. транслокация BAX на митохондрии коррелирует с про-апоптической активностью, то курьёзно, что BCL-2 постоянно связанный с мембраной, но не BCL-XL79, 91, BCL-W92 и MCL1 (Ref. 90), выходит частично в цитозоль и транслоцируется из цитозоля в митохондрии во время апоптоза. Их связывание с BH3-only белками, по-видимому, запускает, вообще-то за счет вытеснения С-терминального мембранного якоря BCL-XL89 и BCL-W92 благодаря оккупации гидрофобных карманов. Внутриклеточная транслокация, по-видимому, коррелирует с конформационными изменениями и глулоким проникновением BCL-XL и BCL-W в OMM. Является ли эта транслокация членов анти-апоптического BCL-2 семейства механизмом ингибирования апоптоза, инактивации с помощью BH3-only белков или даже конверсии в про-апоптические эффекторы, остается неизвестным92, 93. Напр., было постулировано, что связывание белка BH3-only изменяет конформацию способствующего выживанию BCL-2-подобного белка так. что он может затем инициировать образование BAX и/или BAK олигомеров в митохондриальной и др. внутриклеточных мембранах, чтобы вызывать активацию инициатора каспаз94.
Conformational changes during apoptosis
Члены про- и анти-апоптических семейств BCL-2 подвергаются драматическим конформационным изменениям во время апоптоза, расправляясь и глубоко внедряясь в липидный бислой (Fig. 5). Напр., BAX изменяет конформацию, чтобы открыть скрытый эпитоп на своем N конце80, 95, 96, обнаруживая повышенную протеолитическую чувствительность81 и формируя олигомерные комплексы97-99 приблизительно в то время, когда он транслоцируется в митохондрии.
Две ступени активации BAX могут быть вычленены: инициальная транслокация в митохондрии и затем коныормационные изменения N конца, которые скорее всего связаны с инсерцией в мембраны и олигомеризацией. Ступень транслокации, по-видимому, обратима при определенных условиях100. Аминокислоты 14-23 на N конце BAX скрыты, когда белок находится в своей 'healthy cell' конформации, но оказываются экспозированными на ранних стадиях апоптоза. Моноклональные антитела 6A7 соединяются с этими аминокислотами и могут быть использованы для идентификации перестройки этой специфической области BAX80. Этот эпитоп BAX был кристаллизован связанным с 6A7 моноклональными антителами, выявлена значительная степень ремоделирования BAX N конца, которая появляется во время апоптоза101. BAK также меняет конформацию102 и олигомеризуется99 во время апоптоза. Сколько единиц BAX или BAK образуют такие олигомеры, пока неясно. но очевидно. что эти олигомеры распределены в широких пределах молекулярных весов.
BCL-2 также меняет конформацию во время апоптоза благодаря связыванию BH3-only белков. хотя модель этой внедренной в мембрану формы BCL-2 (Ref. 103) напоминает таковую BAX104, белки анти-апоптического семейства BCL-2 не подвергаются процессингу, чтобы сформировать олигомеры, в отличие от членов про-апоптического семейства. Конформация членов анти-апоптического BCL-2 семейства в расстворе (Fig. 3), по-видимому, является конформацией, обнаруживаемой в здоровых клетках, которые не соединяются с про-апоптическим BAX. Однако, BCL-2 и BCL-XL могут соединяться с BAX и BAK после того, как они вставляются в мембраны, возможно, когда они принимают конформации, которые напоминают те, что индуцируются детергентами85, и могут покрывать BAX или BAK олигомеры и ингибировать удлинение цепи105. В одном из исследований приходят к выводу, что единственная форма BCL-2, обнаруживаемая на ранних стадиях апоптоза, может соединяться с BAX и BAK и в дальнейшем ингибировать олигомеризацию BAX или BAK, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток93. Однако, это д. создавать в результате, нелогичную ситуацию, в которой белки BH3-only д. ингибировать апоптоз. способствуя изменению конформации BCL-2 так, что он будет более эффективно ингибировать BAX и BAK. В др. работе установлено, что анти-апоптическая активность BCL-W инактивируется после инсерции BCL-W в мембрану во время апоптоза92.
Altering mitochondria
Члены семейства BCL-2 взаимодействуют с митохондриями или постоянно или при индукции апоптоза и хотя они могут обладать активностью в др. клеточных компартментах, ясно. что они регулируют апоптоз путем их воздействия на OMM.
Про-апоптические BCL-2 белки индуцируют высвобождение cytochrome c. OMM становится проницаемой для растворенных в межмембранном пространстве белков приблизительно в то же самое время, когда BAX транслоцируется, а BAK подвергается конформационным изменениям. Cytochrome c, DIABLO, adenylate kinase, Ser protease OMI, apoptosis-inducing factor (AIF), deafness dystonia protein (DDP), endonuclease G и расщепленная форма OPA1 (a mitochondrial dynamin-like GTPase) все они, как сообщается, высвобождаются из митохондриального межмембранного пространства в цитозоль клетки, подвергающейся апоптозу17,106-108. Высвобождение сytochrome c и DIABLO является важным для активации каспаз.
Первые находки показали, что структура BCL-XL напоминает таковую транслокационного домена дифтирийного токсина, это привело к предположению, что BCL-XL может формировать поры в мембранах29. В попытке понять, как активность по формировани пор связана с биологической активностью, сбивающим с толку фактором стало то, что как про-, так и анти-апоптические члены семейства BCL-2, по-видимому, способны формировать каналы в мембранах in vitro29,109,110. Инкубация BAX с изолированными митохондриями индуцирует высвобождение cytochrome c111, а инкубирование BAX с липосомами делает возможным высвобождение крупных (до106 Da) dextran молекул112, это согласуется с липидными порами, которые были идентифицированы при изучении липидных бислоев113. BCL-XL ингибирует BAX-индуцированное высвобождение cytochrome c из изолированных митохондрий111 и высвобождение dextran из липосом70. Более того, BH3-only белок BID может действовать синергично с BAX, чтобы вызывать высвобождение cytochrome c в бесклеточных системах, или путем активации BAX или за счет предупреждения анти-апоптических членов семейства BCL-2 от ингибирования BAX и BAK. Т.о., одна модель активации BAX и BAK состоит в том, что они образуют крупные поры в OMM, которые делают возможным высвобождение белков в цитозоль, индуцируя активацию каспаз. Однако, биохимическая природа таких предполагаемых BAX-BAK пор, напр, какое количество молекул BAX участвует в образовании поры, остается неизвестным.
Курьезно, но определенные типы клеток (такие как некоторые из популяций нейронов и кардиомиоцитов) могут переживать ступень высвобождения cytochrome c, по крайней мере, в ограниченный период времени114,115. В таких клетках caspases могут строго регулироваться с помощью caspase-ингибирующих IAPs. В этом случае, апоптоз нуждается в высвобождении DIABLO из митохондрий, чтобы уменьшить ингибирование IAP и тем самым сделать возможным активацию caspase. Это может быть специализированной адаптацией обычно долгоживущих пост-митотических клеток (которые существенны для жизнеспособности животных), чтобы снабдить эти клетки дополнительной защитой от активации клеточной гибели и предупредить их внезапную гибель.
Roles in mitochondrial fragmentation and morphology. Конфокальный и электронно-микроскопический анализ транслокации BAX в митохондрии показал, что самая ранняя обнаруживаемая форма 'активированного' BAX вовсе не располагается в OMM, а концентрируется в небольших фокальных регионах на поверхности митохондрий116. BAK перемещается также в эти 'BAX foci' во время индукции апоптоза. Такой фокальный кластер, формируемый BAX, наблюдается микроскопически и обнаруживает измененную конформацию N-конца и возможно отражает состояние in situ BAX и BAK как олигомеров. Эти сайты концентрации BAX часто образуются в сайтах делений митохондрий117, связывая BAX с обеспечением процесса фрагментации митохондрий, который происходит почти одновременно с высвобождением cytochrome c118 (Fig. 2).
Ингибирование деления митохондрий in vitro путем подавления члена митохондриального dynamin семейства DRP1 задерживает высвобождение cytochrome c и может уменьшать активацию каспаз, это указывает на то, что аппарат деления органелл каким-то образом участвует в регуляции апоптоза119. Делеция или мутация Drp1 у D. melanogaster120, 121 и drp-1 у C. elegans122 также ингибирует апоптоз in vivo (Box 1). Напротив, ингибирование слияния митохондрий за счет потери др. члена митохондриального dynamin семейства, OPA1, индуцирует спонтанный апоптоз123.
Неожиданно здоровые клетки, которые лишены BAX и BAK обнаруживают измененную морфологию митохондрий и более низкую сокорость слияния митохондрий, это указывает на то, что BAX и BAK влияют на аппарат морфогенеза митохондрий даже в отсуствие апоптических стимулов124. Недавние исследования показали, что OPA1 контролирует образование митохондриальных гребешков и что соединение гребешков может ингибировать высвобождение cytochrome c во время апоптоза, указывая тем самым, как медиаторы митохондриального деления и слияния могут участвовать в высвобождении cytochrome c и апоптозе125. В противоположность высвобождению cytochrome c и OPA1, высвобождение др. митохондриальных белков межмембранного пространства (таких как DIABLO) не ингибируется с помощью нокдауна DRP1126, это подкрепляет предположение, что роль митохондриального аппарата деления в апоптозе может быть косвенно связана со ступенью высвобождения cytochrome c . Эктопическая экспрессия человеческого BCL-XL и C. elegans ced-9 в клетках млекопитающих, как было установлено, влияет на морфогенез митохондрий, это указывает на то, что это возможно отделяет процесс регуляции слияния органел с помощью членов семейства BCL-2 от регуляции апоптоза127.
Physiological roles of BCL-2 proteins
Члены семейства BCL-2 играют существенную роль в раннем эмбриогенезе мышей и во взрослом тканевом гомеостазе. Нервная система, гематопоэтические ткани и сперматогенез особенно зависимы от регуляции белками семейства BCL-2 (Table 1).
Anti-apoptotic BCL-2 proteins. MCL1 и BCL-XL существенны для нормального эмбриогенеза. Mcl1-/- эмбрионы погибают до ст. имплантации бластоциста128 , а Bcl-x-/- мыши (у которых весь локус Bcl-x (incorporating Bcl-xl and Bcl-xs) был в нокауте) доживали только до плодного дня 13.5, обнаруживая тяжелые дефекты и нейронального развития129. Напротив, хотя BCL-2-дефицитные мыши доживают до рождения, они обнаруживают дефекты иммунной системы, волосяных фолликулов и эпителиальных клеток почек, и все оказываются жертвами поликистозной почечной болезни приблизительно в возрасте 4-8 недель (возраст гибели зависит от генетического фона)130,131. Bcl-w-нокаутные мышиные самцы стерильны из-за дефектов сперматогенеза, но во всем остальном и самки и самцы нормально развиты132. Анализ существенных функций A1 с помощью генного таргетинга осложнен тем фактом, что в отличие от людей мыши имеют четыре a1 гена. Мыши, которые лишены A1A в основном нормальны, но их гранулоциты и мастоциты подвергаются апоптозу аномально быстро в культуре133, 134.
Pro-apoptotic BCL-2 proteins. Bax-нокаутные мыши жизнеспособны, самки фертильны, но самцы и самки обнаруживают умеренный избыточный рост нейронов и умеренную лимфоидную гиперплазию, а самцы обнаруживают тяжелые дефекты дифференцировки спермиев, которые и ведут к стерильности135. Фенотип Bak-/- у мышей даже менее выражен, чем у Bax-/- мышей: их плодовитость и большинство др. тканей нормальны136, хотя они обнаруживают умеренную гипертрофию тромбоцитов из-за потребности в BAK для обеспечения оборота этих безядерных клеточных фрагментов137.
Одивительно, однако, Bax/Bak двойные нокаутные мыши обнаруживают различные тяжелые дефекты, указывающие на существенное перекрывание их активностей136. Большая фракция Bax/Bak двойных нокаутных мышей погибает во время эмбриогенеза (особенно на инбредном фоне C57BL/6; D.C.S. Huang, unpublished observations) или перинатально (на смешанном генетическом фоне). Новорожденные обнаруживают различные онтогенетические дефекты - такие как кожные складки между пальцами, неперфорированные влагалища и аномально увеличенные количества лимфоидных и миэлоидных клеток - которое обусловлено выживанием клеток, которые обычно подвергаются запрограммированной гибели в ходе развития136, 138. In vitro эксперименты с клетками от Bax/Bak двойных нокаутных мышей показали, что BAX и BAK необходимы для большинства форм индуцированного стрессами апоптоза139 и что эти клетки являются даже резистентными к вынужденной экспрессии BH3-only белков140,141. Эти результаты демонстрируют, что BAX и BAK существенны для индукции апоптозом нижестоящих BH3-only белков.
Важно. что сердце, печень, легкие и многие др. органы развиваются нормально у Bax/Bak двойных нокаутных мышей136. Это может указывать на то, что апоптоз, или по крайней мере, BAX/BAK-зависимый апоптоз, не является критическим для нормального морфогенеза и нормального оборота клеток в этих органах. Однако, остается возможность, что тесно родственный (но плохо изученный) белок BOK выполняет критическую роль в этих тканях. Необходим анализ Bok-/-, Bax/Bok и Bak/Bok двойных нокаутных мышей и особенно Bax/Bak/Bok трижды нокаутных мышей.
BH3-only proteins. Эксперименты по генному таргетингу также помогли определить существенные функции BH3-only белков (rev. Ref. 142). Потеря BIM вызывает аномальное накопление лимфоидных и миэлоидных клеток и на смешанном (C57BL/6x129SV) генетическом фоне фатальную 143. BIM является критическим для делеции аутореактивных T и B клеток144, 145 во время их развития и для терминации иммунных ответов146. In vitro эксперименты демонстрируют. что BIM является существенным для апоптоза, который индуцируется за счет депривации ростового фактора, в широком круге типов клеток, включая лимфоциты143, остеокласты62, мастоциты147, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки63 и нейроны148,149. BIM-дефицитные лимфоциты также менее уязвимы для дерегулируемого притока кальция и обнаруживают лишь незначительную резистентность к гамм-облучению или воздействию глюкокортикоидов143.
Потеря BID оказывает незначительный эффект на онтогенетический апоптоз и хотя она делает мышей резистентными к Fas-индуцированному апоптозу гепатоцитов и фатальному гепатиту13, 14, лимфоидные клетки от Bid-/- мышей как обычно чувствительны к Fas лиганду14. PUMA, напротив, является критическим для апоптоза, индуцированного повреждениями ДНК, который обусловливается p53 (Refs 150-152). Курьезно, что хотя гамма-облучение и УФЛ запускают апоптоз p53-зависимым образом, PUMA является существенным для апоптоза, индуцированного гамма-облучением, а NOXA является существенным для апоптоза. индуцируемого УФЛ внутри одного и того же типа клеток (трансформированных фибробластов)153. Это указывает на то, что в зависимости от типа повреждения ДНК и природы детекции молекулярного механизма повреждения, p53 может быть активирован несколько иным способом, определяя тем самым, какой из её двух про-апоптических BH3-only генов мишеней активируется преимущественно. Альтернативно, разные формы повреждений ДНК могут активировать самостоятельные пути, которые действуют параллельно с передачей сигналов p53, чтобы детерминировать, будут ли PUMA, NOXA или оба индуцированы. PUMA также является критическим для клеточной гибели, которая индуцируется с помощью определенных p53-независимых апоптических стимулов, включая депривацию цитокинов или воздействие глюкокортикоидами или форболовым эфиром150, 151.
Мыши, лишенные белков BH3-only, которые могут связывать только некоторые pro-survival белки (BAD, BIK, HRK, BMF or NOXA) , обнаруживают умеренные фенотипические аномалии. Это согласуется с гипотезой, что эти BH3-only белки являются относительно слабыми киллерами по сравнению с BIM, PUMA или BID, которые соединяются с анти-апоптическими членами семейства BCL-2 довольно неразборчиво. Мыши, которые лишены BAD, BIK, HRK, BMF или NOXA в основном нормальны по виду и фертильны. У BAD-дефицитных мышей некоторые типы клеток обнаруживают умеренную резистентность к истощению epidermal growth factor или insulin growth factor154; однако, хотя эти Bad-/- мыши, как показалось, были аномально склонны к развитию лимфом, но в последующих исследованиях это не было подтверждено (P.N. Kelly and A.S., unpublished observations). Популяции нейронов от Hrk-/- мышей обнаруживают некоторую резистентность к истощению nerve-growth-factor155, 156, но это было выражено в меньшей степени, чем защита, вызываемая потерей BAX157, это указывает на то, что BH3-only белки также возможно участвуют в этом.
Т.к. многие клетки экспрессируют более одного BH3-only белка, то некоторые апоптические стимулы могут активировать более одного BH3-only белка, вероятно имеет место функциональное перекрывание и это в самом деле подтверждено в ранних исследованиях двойных нокаутных мышей, которые лишены двух BH3-only белков. Хотя Bim-/- and Bik-/- самцы мышей имеют аномальный сперматогенез, тяжелые дефекты, которые вызывают стерильность самцов становятся очевидными у Bim/Bik двойных нокаутных мышей158. Как и у Bax-/- самцов135, неспособность продуцировать зрелые спермии у Bim/Bik двойных нокаутных мышей является результатом аномального накопления и персистенции незрелых предшественников, это не позволяет дифференцирующимся клеткам достигать специализированных ниш на стромальных клетках.
Анализ мышей, которые лишены BIM и PUMA показал, что эти два BH3-only белка наиболее критические для инициации апоптоза в ответ на многие апоптические стимулы в широком круге типов клеток, особенно тех, что имеют гематопоэтическое происхождение159. Напр., хотя потеря или BIM или PUMA в отдельности делает лимфоидные и миэлоидные клетки резистентными к истощению цитокинов или воздействию глюкокортикоидами, ли шь комбинированная потеря обоих белков обеспечивает такую надежную защиту, как избыточная экспрессия BCL-2 или комбинированная потеря BAX и BAK159.
BH3-only versus core BCL-2 proteins. Разведение мышей, которые ли шены как BH3-only белка, так и члена BCL-2 pro-survival семейства помогло выяснить функциональные взаимоотношения между этими белками. Удивительно, но потеря одиночного аллеля Bim предупреждает фатальную поликистозную болезнь почек и лимфопению, вызываемую потерей BCL-2 (Bim+/- Bcl-2-/- мыши), а потеря обоих Bim аллелей даже предупреждает аномальную гибель предшественников меланоцитов и преждевременное поседение131. Эти результаты показывают, что когда отсутствует BCL-2 в эпителиальных стволовых клетках почек, лимфоидных клетках и предшественниках меланоцитов, то физиологические уровни BIM не обеспечивают достаточную защиту и вызывают аномальный апоптоз, преимущественно путем нейтрализации активности др. членов pro-survival BCL-2 семейства, таких как BCL-XL или MCL1.
Concluding remarks
Our understanding of the regulation of BCL-2 family members and their roles in tissue dynamics of mammals has greatly expanded in recent years. BH3-only proteins sense signals to induce apoptosis and relay this information to core BCL-2 family members to initiate cell death. BAX and BAK are induced to change conformation and permeabilize the OMM. How BAX and BAK function in this process remains unclear despite intensive study. Difficulties in defining the structure of these proteins after conformational change, oligomerization and membrane insertion, as well as in determining their intermolecular binding partners in membranes, has impeded progress. The molecular trigger that induces BAX translocation and BAK activation has so far also eluded discovery.
The difference between anti- and pro-apoptotic BCL-2 family proteins needs to be defined both on a structural and functional basis. One model to explain the difference is that anti-apoptotic members can act as dominant-negative inhibitors of the pro-apoptotic members. The functional effect of BH3-only proteins binding to the anti-apoptotic BCL-2 family members also deserves more study. Recent advances in understanding the intermolecular interactions among the family members, corroborated at the level of animal studies, along with cell biology advances offer abundant clues for deciphering the remaining mysteries of cellular commitment to apoptosis.
