Стимуляция трансмембранных рецепторов с помощью внеклеточных лигандов ведет к инициации сигнальных сетей, которые передают кодируемую лигандом информацию внутрь клетки1. Чаще всего рецептор собирается в ансамбль с большим количеством белков с разными функциями, которые выражают и распространяют сигнал или ингибируют сигнал путем ограничения времени этими мультибелковыми комплексами2,3. Установлено, что передача сигналов рецепторами зависит от образования супрамолекулярных белковых ансамблей (SIGNALOSOMES) в определенных клеточных компартментах4. В обзоре будет рассмотрено семейство Cbl белков, которое функционирует внутри нескольких путей передачи сигналов рецепторами и которое участвует в регуляции пролиферации, жизнеспособности и подвижности клеток5.
Первый член Cbl-семейства белков, v-Cbl, был клонирован из Cas NS-1 ретровируса в 1989 и было установлено, что он индуцирует pre-B-cell лимфомы и миэлогенную лейкемию у мышей (известную также как Casitas B-lineage lymphoma)6. Затем было установлено, что этот белок является укороченной формой крупного клеточного гомолога, известного как c-Cbl (FIG. 1). Форма полной длины c-Cbl состоит из N-терминального
tyrosine-kinase-связывающего домена (TKB DOMAIN), RING FINGER мотива, богатой пролином области и С-терминального ubiquitin-associated (UBA) домена, который перекрывается с LEUCINE ZIPPER MOTIF (LZ) (REF. 5). Доменовая структура c-Cbl и тот факт, что молекула богата тирозинами и серинами, позволяет отнести ее к классу адапторных молекул, но с некоторыми специальными свойствами. Охарактеризованы три гомолога у млекопитающих - c-Cbl, Cbl-b7 и Cbl-c8,9 - которые отличаются по длине своих С-концов и, следовательно, по способности действовать как адапторы (FIG. 1). c-Cbl и Cbl-b являются повсеместно экспрессируемыми белками, с ортологами у Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans5. Cbl-c является более короткой изоформой Cbl, которая лишена C-терминального UBA/LZ домена. Cbl-c в основном экспрессируется в эпителиальных клетках, но его функция in vivo изучена недостаточно10.
An overview of Cbl interactions
Роль Cbl белков как адапторов активно исследовалась в нескольких типах клеток и тканей. Создан каталог известных белков, взаимодействующих с Cbl. Известно ~150 белков, которые затрагиваются или регулируются с помощью Cbl белков (FIG. 2;Supplementary information S1 (TABLE); see also
the Cbl interactome and Cbl-b interactome in the Online links box). FIGURE 2 была скомпилирована, чтобы отразить сайты связывания Cbl-ассоциированных белков в Cbl и методы, которые были использованы для идентификации этих взаимодействий. Это pulldown assays, immunofluorescence, immunoprecipitation и дрожжевой двугибридный скрининг. Однако, в некоторых случаях прямые взаимодействия между Cbl белками и ассоциированными молекулами не были установлены. Такого типа взаимодействие было обозначено как immunoblotting и было включено, чтобы показать, что определенные пути связаны с Cbl, но взаимодействия ещё полностью не изучены.
Список Cbl-взаимодействующих партнеров не обнаруживает намерения к финалу и завершению - он всё дополняется новыми белками, которые взаимодействуют с Cbl. На сегодня он содержит рецепторы с или без присущей киназной активности, цитозольные киназы, фосфатазы, ubiquitin лигазы, адапторы и огромное множество белков и, следовательно, представляет собой поперечный срез через протеом сигнальной трансдукции. Важно понять, как Cbl
белки рекрутируются в белковые комплексы и где комплексы формируются, т.к. эти ступени предопределяют функциональный исход их взаимодействия. Напр., если Src привлекает Cbl в FOCAL ADHESIONS, то Cbl функционирует в основном как стабилизирующий адаптор, тогда как Src-Cbl взаимодействия на эндоцитотическом пути receptor-tyrosine kinases (RTKs) регулируют активность E3 (UBIQUITIN-PROTEIN LIGASE) лигазы в Cbl (BOX 1), в результате происходит деструкция рецептора. Регуляторные механизмы такой функциональной дискриминации не ясны. Cbl белки могут модифицировать сигнальные пути, функционируя как E3 лигазы, которые обеспечивают ubiquitylation ассоциированных белков, который, в свою очередь, меняют композицию сигнальных комплексов11. Эти модификации добавляют сложности в ряд потенциальных взаимодействий: в общем polyubiquitylation направляет белки на деградацию12, тогда как monoubiquitylated Cbl субстраты функционируют, рекрутируя ubiquitin-связывающие белки13,14. Ниже мы рассмотрим, как специфические Cbl INTERACTOMES предопределяют функциональный исход Cbl-содержащих сигнальных комплексов скорее, чем будем представлять каждое взаимодействие в молекулярных деталях15.
Cbl proteins in RTK regulation
RTKs на клеточных мембранах могут обеспечивать передачу сигналов ниже и регулировать продолжительность нижестоящей реакции, что является столь же важным как и инициация. Помимо дефосфорилирования RTK, подавление передачи сигналов RTK происходит при удалении рецепторов из мембран с помощью эндоцитотических механизмов, ведущих или к рециклингу или деградации. Одним из наиболее изученных примеров, как Cbl белки влияют на трафик рецепторов и, следовательно, на продолжительность времени активированных рецепторных комплексов, является регуляция epidermal-growth-factor receptor (EGFR) с помощью Cbl16-20 (BOX 2).
Этот многоступенчатый процесс первоначально был описан у C. elegans, у которых SLI-1 (ортолог Cbl) негативно регулирует передачу сигналов вниз от LET-23 рецепторов (ортолог EGFR)21-23 (rev. Langdon24). Этот механизм стал моделью регуляции др. RTKs. После стимуляции с помощью EGF, рецепторные мономеры димеризуются и запускают процесс аутофосфорилирования25 (BOX 2a). Это создает док (docking sites) для др. белков и инициирует образование мультибелок-рецепторного комплекса1. Одним из первых белков, рекрутируемых в комплекс является адапторный белок growth factor-receptor bound-2 (Grb2), который может рекрутировать Cbl белки из цитоплазмы на мембрану посредством взаимодействий между proline-rich областью Cbl белков и N-терминальным Src-homology-3 (SH3) DOMAIN в Grb2 (REFS 19,26,27). Во время активации EGFR, Tyr1045 аутофосфорилируется28 и это создает второй EGFR док, с которым Cbl соединяется посредством своего N-терминального TKB домена29 (BOX 2b). Это позволяет нескольким Cbl молекулам рекрутироваться в активные EGFR комплексы и обеспечивать ubiquitylation - и последующую интернализацию - олигомерных рецепторов30,31, что в конечном итоге ограничивает передачу сигналов active-EGFR-complex. Будучи интернализованными в ENDOSOME, рецепторный комплекс может быть направлен на лизосомную деградацию или на повторное использование (recycling), но в любом случае сигналы, которые от него исходят, прекращаются (BOX 2c,d).
Внутри EGFR комплекса активированный Cbl может выполнять три разных функции: он может функционировать как ингибитор, как адаптор или как E3 лигаза. Сегодня эти функции Cbl белков не могут быть отделены др от др32. Однако, возможно, что блокирование индивидуальных функций Cbl путем использования более специфических подходов сможет вычленить каждую из этих функций.
Cbl as an inhibitor or adaptor. Oдна из предполагаемых ингибирующих функций Cbl в передаче сигналов EGFR является косвенной. С помощью связывания Grb2, Cbl конкурирует с guanine-nucleotide-exchange фактором son-of-sevenless (SOS), блокируя тем самым передачу сигналов посредством Ras-mitogen-activated protein kinase (MAPK) пути и ингибируя пролиферацию (сравни BOX 2a с BOX 2b). Cbl инициирует также удаление активированных EGFRs с поверхности мембран и направляет их на лизосомную деградацию, функционируя как адаптор или как E3 лигаза. Действуя как адапторы, Cbl белки рекрутируют адапторные молекулы CIN85 (известный также как SETA или RUK) и CD2AP (CD2-associated protein; известный также как CMS)33, которые запускают сигнальные каскады, которые инициируют ранние фазы эндоцитоза рецепторов (BOX 2). CIN85 ассоциирует с endophilins, которые могут индуцировать негативные изгибы мембраны34,35 (BOX 2a,b). В то же самое время, CD2AP, благодаря своей ассоциации с cortactin, связывает комплекс с ARP2/3, ключевым регулятором ремоделирования актина, а значит и полимеризации актина, это, в свою очередь, облегчает трафик рецепторов36 (BOX 2b,c). Это представляет собой начало DYNAMIN-зависимого, clathrin-обусловленного эндоцитоза рецепторов (BOX 2). Необходимо отметить, что рецепторные могут вступать на этот путь несколькими способами и что механизмы начала эндоцитоза рецепторов в определенной степени избыточны (redundant). CIN85 и CD2AP могут соединяться с adaptor protein-2 (AP2) посредством FXFXP мотива. AP2 ещё один эндоцитотический белок и представляет альтернативный путь к clathrin-обеспечиваемому эндоцитозу, который используется рецепторами, такими как transferrin рецептор (BOX 2a,b). Cbl-обусловленное ubiquitylation EGFR также привлекает ubiquitin-связывающие белки, такие как epsin или EPS15 (BOX 2b), который, в свою очередь, может рекрутировать endophilins (посредством DAP160 или intersectin). Это, по-видимому, способствует точности и эффективности всего процесса и может гарантировать, что эндоцитоз рецепторов будет происходить, даже если некоторые члены рецепторного комплекса отсутствуют.
Cbl as an E3 ligase. Cbl-обусловленное ubiquitylation своих субстратов интенсивно изучалось. Ясно, что monoubiquitylation (по сравнению с polyubiquitylation, которое обеспечивает протеосомную деградацию) выполняет разные функции в сигнальной трансдукции и по многим аспектам эти функции напоминают роль фосфорилирования тирозинов (BOX 3). Целенаправленное ubiquitylation рецепторов (напр., EGFR) происходит параллельно с началом интернализации рецепторов и продолжается по ходу всего эндосомного пути (BOX 2b.d). Чвляется ли эта модификация обязательной для интернализации рецепторов остается спорным37. Установлено, что ubiquitylation рецепторов привлекает ubiquitinbinding
белки, такие как EPS15 или epsin, которые важны для прогресса интернализации посредством non-clathrin-зависимого, lipid-raft-зависимого пути38. Превалирующая роль Cbl, по-видимому, заключается в сохранении рецепторов внутри sorting эндосом путем обеспечения и поддержки их ubiquitylation. Предполагается, что если груз deubiquitylated, то он преимущественно поступает в recycling эндосомы и возвращается на плазматическую мембрану, так что ubiquitylation может способствовать лизосомной деградации37,39. Т.к. ранние эндосомы созревают (BOX 2b) в поздние эндосомы (BOX 2c), то состав Cbl комплексов меняется, т.к. белки, такие как TSG101 (tumour susceptibility gene-101) теперь рекрутируется на ubiquitylated груз. Эти изменения Cbl-ассоциированных белков способствуют дальнейшему созреванию пузырьков в MULTIVESICULAR BODIES (MVB; BOX 2d), которые в конечном итоге приводят к формированию лизосом, в которых Cbl и ассоциированные белки деградируют. Роль Cbl в этом процессе, путем обеспечения белком ubiquitylation, по-видимому, заключается в удерживании белковых комплексов вместе и в сортировке груза для деградации.
Cbl and phosphoinositides. Процесс эндоцитотического переноса сопровождается изменением в композиции phosphatidylinositide phosphates
(PtdInsPs) внутри мембран пузырьков. PtdInsPs являются высоко специфическими для различных компартментов мембран, а также для белков, которые ассоциируют с ними. Регуляция образования PtdInsP рассмотрена здесь40, но механизм, как Cbl влияют на образование различных PtdInsPs представляет прекрасный пример компартментализации сигнальных белков. На плазматической мембране Cbl притягивает CIN85, который, in vitro ингибирует образование phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate
(PtdIns(3,4,5)P3) из PtdIns(4,5)P2 (REF. 41)
(BOX 2a). Cbl, путем ингибирования EGF-индуцированной активности phospholipase C., предупреждает также расщепление PtdIns(4,5)P2 на diacylglycerol и inositol trisphosphate42. Эти действия ведут к повышению локальной концентрации PtdIns(4,5)P2, которая является предварительным условием для начала образования clathrin-покрытых ямок43. Более того, Cbl- и CIN85-ассоциированные
5'-phosphoinositol фосфатазы synaptojanin и Src-homology-2 (SH2) DOMAIN-containing inositol phosphatase-2 (SHIP2) начинают дефосфорилировать PtdIns(4,5)P2 в PtdIns(4)P. Это инициирует освобождение клатрина с покрытых clathrin пузырьков44,45 (BOX 2b). Раздетые пузырьки могут теперь сливаться с ранними эндосомами, где высокие концентрации phosphatidylinositol 3-kinases (PI3Ks), таких как
VPS34/p150, способствуют образованию PtdIns(3)P, которая существенна для эндоцитотического процесса, т.к. она привлекает посредством своего FYVE DOMAIN, early-endosome antigen-1 (EEA1). EEA1 взаимодействует с малой GTPase Rab5, которая играет центральную роль в эндоцитотическом процессе46 (BOX 2c,d).
Negative regulation of Cbl functions
Cbl сам по себе является объектом регуляторных механизмов, которые ингибируют его функцию (FIG. 3), таких как дефосфорилирование с помощью SHP1 (Src-homology-2-containing phosphatase-1)47 (FIG. 3a) или направление на протеосомную деградацию посредством ubiquitylation с помощью HECT-типа E3 лигаз atrophin-1-interacting protein-4 (AIP4)/Itch или
NEDD4 (REF. 48) (BOX 1; FIG. 3b) или косвенно с помощью Src49,50. EGFR сам по себе также может избегать Cbl-обусловленного подавления путем поддержания состояния низкого фосфорилирования, которое не превышает порог, который необходим для Cbl-связывания (FIG. 3c). Это было показано для онкогенной формы EGFR, δ(2-7)EGFR (δEGFR или EGFRvIII), которая не привлекает Cbl,
благодаря своему низкому уровню фосфорилирования, и вследствие этого не интернализуется51.
Др. менее изощренные механизмы, по-видимому, функционируют внутри разных клеточных компартментов для контроля Cbl. Наиболее изученным примером является ингибирование Cbl-обусловленного подавления EGFR с помощью Sprouty2, который является регулятором tyrosine-kinase передачи сигналов52 (FIG. 3d). После стимуляции фактора роста, индуцируется экспрессия Sprouty2 и белок транспортируется в плазматическую мембрану, где он фосфорилируется по Tyr55. Это воспроизводит Cbl-связывающий мотив в EGFR (Tyr1045) и Cbl соединяется с Sprouty2, следовательно, секвестрируя Cbl от EGFR. Эта петля обратной связи зависит от CIN85, т.к. только Sprouty изоформы, которые содержат CIN85-связывающий мотив (PXXXPR), могут ингибировать подавление EGFR53. CIN85 вносит вклад в формирование тримерного комплекса Cbl, CIN85 и Sprouty2, усиливая тем самым Sprouty2-обусловленное ингибирование Cbl53. Недавно βPIX (p21-activated kinase (PAK)-interacting exchange
фактор) был описан как др. связывающий партнер и ингибитор Cbl-обусловленного подавления EGFR54. Очевидно, что постоянно активный Cdc42, a RHO-FAMILY GTPASE, которая взаимодействует с βPIX, секвестрирует Cbl от EGFR посредством βPIX и тем самым ингибирует подавление EGFR (FIG. 3e).
Др. набор белков. котоирые ингибируют подавление EGFR Cbl-зависимым способом, включают STS1 и STS2 (REFS 55.57) (FIG. 3f). Они могут конкурировать с epsin и ассоциируют с ubiquitylated EGFR способом. который зависит от ubiquitin-связывающих доменов, это может указывать, что они могут функционировать как конкурентоспособные ингибиторы процесса сортировки на плазматической мембране или внутри эндосомных компартментов55.
От ранних эндосом и далее, Cbl-обусловленное monoubiquitylation эндосомных белков является важным для направления EGFR по пути деградации. Вмешательство в этот процесс может благоприятствовать рециклингу над лизосомной деградацией. Др. белок, которые затрагивает уровни EGFR и platelet-derived growth-factor receptor (PDGFR) является apoptosis linked-gene 2 (ALG-2)-interacting protein X or 1 (Alix/AIP1)58,59. Alix/AIP1 соединяется с TSG101 и, следовательно, непосредственно связан с белками ESCRT I и III комплексов60. Как Alix/AIP1 влияют на Cbl-обусловленную деградацию рецепторов в этом контекста остается неясным, но он может эффективно конкурировать за удаление Cbl от EGFR59 (FIG. 3f).
The Cbl interactome in lymphocyte signalling
Хорошо изучена изменчивость Cbl-обусловленного подавления рецепторов - это регуляция членов т.наз. семейства immunoreceptor, особенно рецепторов T- и B-клеточных антигенов (TCRs и BCRs; FIG. 4). T и B лимфоциты распознают антигенные сигналы посредством TCR (в случае MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC)-coupled антигенов) и BCR (в случае свободных антигенов) комплексов и также как и в случае RTKs, они нуждаются в tyrosine-kinase активности для максимальной стимуляции. Однако, TCRs и BCRs лишены прирожденной kinase активности и поэтому склонны ассоциировать с protein-tyrosine kinases. Это в конечном итоге ведет к образованиюдолго живущих (несколько часов) supramolecular-activation complexes (SMACs), которые известны также как 'immunological synapses', между антиген-презентирующими клетками и T клетками или B клетками. В случае Т клеток они представлены центральной частью (cSMAC) с сигнальными свойствами, которые состоят из TCR, связанного с MHC-антигеновым комплексом в ассоциации с разными сигнальными и ко-стимулирующими молекулами (такими как CD2, CD4 или CD28). Он окружен кольцом адгезивных молекул, которые формируют периферическую часть (pSMAC). Интересно, что сигнальная способность этого комплекса коротко-живущая (только несколько мин) по сравнению с общим периодом жизни61. Это указывает на то, что сигналные свойства комплекса тонко регулируются. TCR сам по себе является мульти-субъединичным комплексом, который состоит из clonotypic immunoglobulin-like αβ цепей. которые не ковалентно ассоциированы с инвариантными CD3-γ, CD3-δ и CD3-ε цепочками и TCRζ димером. Активация Т клеток с помощью антиген-презентирующих клеток вызывает активацию protein-tyrosine kinases и их ассоциацию с CD3 и TCRζ субъединицами и ко-рецепторами CD4 и CD8. Рекрутирование protein-tyrosine
киназ ведет к фосфорилированию immunoreceptor-tyrosine-based activation motifs (ITAMs) внутри CD3 and TCRζ, в основном с помощью членов семейства Src - Lck и FynT. Это в конечном итоге привлекает ZAP70 (zeta-associated protein of 70 kDa), который является ключевым активатором в комплексе TCR (или его гомолог Syk в BCR). ZAP70/Syk индуцирует фосфорилирование адапторных молекул, известных как LAT (linker for activation of T cells) или LAB (linker for activation of B cells), или SLP76/BLNK (SH2-domain-containing leukocyte protein of 76 kDa/B-cell linker protein), которые также функционируют как активационные платформы или доки (docking sites) для Grb2 или PLCγ (которые также обеспечивают антигенные реакции). Др. важные пути внутри этих ранних сигналосом62 вносят вклад в активацию лимфоцитов и обеспечивают пролиферативный, жизнеспособности, цитоскелетные, адгезивные и миграторные эффекты, все они вносят вклад в поляризацию клеток и позволяют лимфоцитам мигрировать в направлении выявляемых антигенов.
Enter Cbl. Большое количество сигналов, которые описаны выше, ограничивают продолжительность, т.к. неограниченная стимуляция является вредной для организма. По этой причине Cbl привлекается в TCR или BCR комплекс, где он выполняет сходные ингибирующие функции, что описаны для регуляции RTK. Src-подобные адапторные белки (SLAP и SLAP2), которые экспрессируются в T лимфоцитах и B лимфоцитах. соотв., могут приводить Cbl в тесную близость к Src-подобной и Syk-подобной киназам (rev. REF. 63), внося тем самым Cbl в TCR комплекс, где он может взаимодействовать с LAT, ZAP70, Syk, TCRζ цепью64 и др. белками. Cbl затем интегрируется в TCR комплекс путем соединения с центральными адпторными молекулами SLP76 (непосредственно в T клетках65) или BLNK (косвенно через CIN85 в B клетках66). Src-подобные киназы, которые внутри рецепторных комплексов, затем активируют Cbl белки. c-Cbl
и Cbl-b далее ингибируют функцию ZAP70, ассоциируя с ним и индуцируя его деградацию67,68. Однако, это может быть специфичным для ZAP70 т.к. B-клеточный ZAP70 гомолог Syk эффективно направляется на деградацию с помощью c-Cbl69 и Cbl-b70. Даже если ZAP70 не является первичной мишенью, однако активирующие его молекулы Lck69 и TCRζ71 направляются на деградацию с помощью c-Cbl-управляемого ubiquitylation. Итак, ступенька за ступенькой, активный TCR комплекс выключается. Благодаря отсутствию активации ZAP70 или Syk, PLC-γ1 (в Т клетках) или PLC-γ2 (в В клетках) больше не фосфорилируются и уровни внутриклеточного кальция быстро снижаются. Это ведет к деактивации protein kinase C (PKC) на плазматической мембране, это заставляет затем молчать PKC-обеспечиваемую передачу сигналов72. PI3K-обусловленная передача сигналов заканчивается с помощью Cbl-b-обусловленной ubiquitylation регуляторной субъединицы p85 (REF. 73). В конечном итоге, передача сигналов TCR завершается интернализацией всего рецепторного комплекса, это удаляет иммунологические синапсы из клеточной мембраны.
Isoform-specific functions. Доступность одиночных c-Cbl- и Cbl-b-нокаутных мышей, которые имеют четкие фенотипы активации и развития лимфоцитов, позволяют вычленить c-Cbl и Cbl-b функции в Т лимфоцитах. Эти две изоформы Cbl считаются функционально перекрывающимися на базе того, что c-Cbl-/-,Cbl-b-/- двойные нокаутные мыши являются эмбриональными леталями74, тогда как отдельные нокауты жизнеспособны75-78. Однако, двойные нокауты c-Cbl и Cbl-b были получены в Т клетках с помощью условного нокаута c-Cbl специфически в Cbl-b-/- T клетках74.
Различия между c-Cbl и Cbl-b видны наиболее четко при сравнении с c-Cbl-/- (REFS 75,76) и с Cbl-b-/- нокаутными мышами77,78. c-Cbl-/- обнаруживают строгие эффекты на THYMOCYTES, с повышенными количествами клеток в тимусе молодых взрослых особей и с повышенной силой сигнала вследствие вовлечения TCR75. Более того, CD4/8-двойные позитивные тимоциты от таких мышей обнаруживают повышенные количества CD3, TCRβ, TCRζ, Lck и
FynT. Нарушение передачи сигналов в тимоцитах не зависит от TKB домена c-Cbl, т.к. TKB knock-in не нормализует фенотипа79. Кроме того, активация ZAP70 в тимоцитах от c-Cbl-/- неотделима от потребности в стимуляции CD4 ко-рецептора75,76. Интересно, что периферические Т клетки обнаруживают пониженные скорости пролиферации, возможно, как результат усиления позитивного отбора CD4+ T клеток76. Это может быть из-за повышенных активностей Src и MAPKs, которые вызываются высокими уровнями передачи сигналов TCR у c-Cbl-/- мышей.
В противопложность этому фенотипу, Cbl-b-/- мыши не обнаруживают очевидных аномалий тимуса, но становятся жертвами распространенных автоиммунных заболеваний с воспалительными повреждениями тканей77,78. Этот эффект является результатом повышенной пролиферации Т клеток внутри периферического лимфоидного компартмента в ответ на антигены или anti-TCR антитела, и повышенной цитолитической активности CD8+клеток. Интересно, что в этих CD8+клетках ко-стимулирование с помощью CD28 рецептора не нужно и Cbl-b дефицит может быть устранен Т-клеточной гипер-чувствительностью, которая возникает у мышей, лишенных CD28 или его нижестоящей мишени VAV, GUANINE-NUCLEOTIDE-EXCHANGE FACTOR (GEF)80.
Биохимические различия их партнеров по взаимодействию могут приводить к вовлечению c-Cbl и Cbl-b в разных путях сигнальной трансдукции. В то время как c-Cbl больше участвует в негативной регуляции уровней TCR и киназ Src-семейства в тимоцитах74,75, превалирующий способ действия Cbl-b заключается в контроле передачи сигналов от VAV к Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP), которые в конечном итоге приводят к ремоделированию цитоскелета77,78. Путь регуляции TCR непосредственно затрагивает сам рецепторный комплекс, который больше не способен отвечать за силу результирующего сигнала. Эта передача сигналов WASP пути мишеням стабильности иммунологических синапсов, которая может быть более важной для продолжительности сигнала81. Более того, c-Cbl, как было установлено, негативно регулирует PLCγ42,82,83, в то время как Cbl-b может регулировать этот энзим позитивно84, это существенно для притока Ca2+ и инициальной реакции иммунных клеток. Эти находки могут объяснить, почему Cbl-b выполняет важную роль в развитии аутоиммунитета и ANERGY, в то время как c-Cbl не делает этого85,86.
c-Cbl, но не Cbl-b, может взаимодействовать с 14.3.3 PROTEINS
посредством двух тандемных сериновых повторов на С конце87
(FIG. 1). Этот мотив является предположительно местом регуляции PKC в
c-Cbl. На плазматической мембране, c-Cbl может взаимодействовать с PLCγ. Возникающее в результате увеличение InsP3 увеличивает концентрацию внутриклеточного Ca2+, запуская рекрутирование PKC в плазматическую мембрану, где она полностью активируется fс помощью diacylglycerol88,89. Активная PKC фосфорилирует Cbl по 4-м сериновым остаткам на его С конце, это привлекает 14-3-3 белки, чтобы связываться и подавлять фосфорилирование тирозина, и, следовательно, влияет на способность c-Cbl рекрутировать SH2-домен содержащие белки72. Cbl-b не может выполнять эту функцию, т.к. он лишен второго серинового тандемного повтора. Наконец, Cbl-b, но не c-Cbl, может соединяться с ubiquitylated белками в клетках посредством своего С-терминального UBA домена90. Могут ли эти различия функции UBA домена объяснить различие мишеней для c-Cbl и Cbl-b передачи сигналов иммунными клетками пока не установлено.
Cbl in the regulation of the actin cytoskeleton
Cbl-обусловленное подавление рецепторов нуждается в действии нескольких белковых сетей для удаления активных рецепторов из плазматической мембраны. Диффузия может быть слишком медленной и недостаточной, так что удаление рецепторов нуждается в клеточных структурах, которые могут развить механические силы для оттаскивания рецепторы-содержащих пузырьков от клеточной поверхности. Такими структурами, как было установлено, являются актиновая91,92 и tubulin93,94 сети (FIG. 5). В самом деле, эндоцитотические пузырьки, когда они созревают в MVBs и в конечном итоге в лизосомы, то путешествуют вдоль этих маршрутов от плазматической мембраны к околоядерным областям95. Установлено, что стимулы, которые вызывают ре-организацию актинового цитоскелета индуцируют также фосфорилирование тирозина в Cbl96,97 и наоборот98. Адгезия макрофагов к fibronectin или vitronectin субстрату, напр., вызывает ре-локализацию Cbl в плазматическую мембрану, а также фосфорилирование Cbl96,99. Этот процесс регулируется с помощью Src-family киназ после их активации с помощью интегринов, TCR или BCR
комплексов или RTKs5. Src-family киназы, которые постоянно ассоциированы с Cbl, фосфорилируют важные тирозины, которые находятся в С-терминальной области и которые привлекают SH2-домен содержащие адапторы, которые связывают Cbl с актиновым цитоскелетом100-103.
Cbl and actin linkers. Наиболее известные SH2-домен содержащие белки, которые связывают Cbl с актиновыми структурами, являются VAV (который соединяет Cbl по pTyr700)104 и Crk адапторы
(которые соединяют по pTyr700/774)105, а также p85 регуляторная субъединица PI3K (которая соединяется с pTyr371 и pTyr731 (в т. наз. pYXXM мотивах106,107)); для локализации индивидуальных фосфотирозинов см. FIG. 1. Эти белки участвуют в сигнальных сетях, которые соединяют Cbl белки в фокальными адгезиями, LAMELLIPODIA, PSEUDOPODIA и актиновыми стрессовыми волокнами15. Более того, Cbl может быть сцеплен с цитоскелетом путем связывания его богатого пролином домена с SH3-домен содержащими белками, такими как c-Cbl-associated-protein
(CAP)108, Arg/Abl-binding protein-2 (ArgBP2)109,
CIN85 (REF. 110) или CD2AP111. CAP, как было показано, затрагивает образование актиновых стрессовых волокон108. ArgBP2
связывает Cbl с тирозин киназой PYK2 (которая играет критическую роль в формировании комплексов фокальных адгезий) GROWTH CONES нейронов112, a CD2AP в основном ко-локализуется с Cbl на LEADING EDGES клеток и в ламеллиподиях111. CIN85, с др. стороны, найден в актиновой и тублиновой сетях при высоких концентрациях в комплексах фокальных адгезий110. Ассоциация Cbl
с комплексами фокальных адгезий хорошо изучена - в частности соединение с focal-adhesion kinase (FAK)110,113 и её родственной PYK2 (REFS 58,112,114). Cbl ассоциирует с FAK и PYK2 и, следовательно, влияет на силу клеточного прикрепления ко внеклеточному матриксу115. Боле того, он связан с paxillin и talin116, которые также являются компонентами адгезивных комплексов. Эти примеры иллюстрируют потенциально важную роль Cbl в регуляции фокальных адгезий и актинового цитоскелета. Следовательно, вмешательство в функцию Cbl при использовании антисмысловыих олигонуклеотидов ведет нарушению резорбции кости с помощью остеокласт-подобных клеток100, а делеция Cbl в OSTEOCLASTS ингибирует миграцию клеток114. Считается , что активация αVβ3 интегрина (рецептора vitronectin) в остеокластах индуцирует образование PYK2-Src-Cbl комплекса, что является инициальной ступенью в формировании фокальных адгезий. Cbl и Src являются ключевыми регуляторами в этом процессе и функциональное вмешательство в любой из них ведет к дефектам образования ламеллиподий и миграции остеокластов. Поэтому остеокласты мышей, которые лишены Src и PYK2 аномальны по своей способности мигрировать и резорбировать кость и приводят к фенотипу остеопетроза114.
Cbl and GTPases. Вовлечение Cbl в перестройки цитоскелета приводит также к его взаимодействию с малыми GTPases. Показано, что Cbl облегчает стимуляцию Rac1 или Cdc42 (посредством p85 субъединицы PI3K) и R-Ras94,117 (посредством CrkL или CrkII, последняя формирует комплекс с GEF C3G). В случае передачи сигналов инсулина в адипоцитах, Cbl-CrkII-C3G комплекс направляется в детергент-устойчивые микродемены (LIPID RAFTS и CAVEOLAE) посредством CAP. CAP содержит SORBIN-HOMOLOGY (SOHO) DOMAIN, который может взаимодействовать с flotillin, резидентным белком липидных платформ. Транслокация комплекса Cbl-CrkII-C3G
позволяет C3G активировать специфическую, располагающуюся в платформе GTPase TC10 (REF. 118), которая, в свою очередь, инициирует полимеризацию кортикального актина и перераспределение глюкозного транспортера GLUT4 из внутриклеточной тубуло-везикулярной системы на клеточную поверхность119. Координация взаимодействий между кортикальным актином и компартментами липидных платформ во время индуцированной инсулином транслокации тарнспортеров глюкозы может быть важной функцией партнеров. взаимодействующих с Cbl. Определенно, эти механизмы ещё полностью не описаны, т.к. GTPases также реципрокно влияют на Cbl белки (как это было описано выше для Cdc42 и βPIX). Однако, существенно, что Cbl не только ассоциируют с актин-связывающими белками, но и также влияют на статус активации GTPases, которые регулируют полимеризацию актина. Это придает Cbl белкам двойную силу для создания и модулирования их собственных микроусловий и затем для разрушения их сетей.
Conclusions and perspectives
Many biological processes are regulated by intracellular
signalling networks, which convey messages that
are essential for specific cellular responses. Cbl-linked
networks have been implicated in the control of the
immune system, cell proliferation, differentiation and
cell morphology. Although the nature of proteins that
interact with Cbl in distinct cellular compartments is
well established, the functional translation of these
protein–protein interactions into specific biological
consequences still remains, for the most part, undefined.
The emerging theme is that the regulation
mechanisms and the principles of RTK and TCR
pathways, for example, are similar, but different sets of
Cbl-interacting proteins are used.
Future challenges in the field lie in the development
of methodologies that will allow comprehensive
monitoring of these processes at the molecular level.
The complex nature of such processes will require a
systems-biology approach to integrate experimental
and theoretical methods, such as live-cell imaging,
proteomics and functional genomics, combined with
the generation of mathematical models that can predict
cellular responses on the basis of changes in the protein
interactome. Precise regulation of protein interactomes
is also of medical relevance, as changes in the composition
or localization of crucial components of these networks
can lead to the development of human diseases.
Сайт создан в системе
uCoz 
