Эмбриологические и генетические исследования предоставили доказательства существования самостоятельных головного и туловищного организаторов (Spemann, 1931; Thomas and Beddington, 1996; Belo et al., 1997; Bouwmeester and Leyns, 1997; Schneider and Mercola, 1999). Выделение и изучение Xenopus cerberus (Xcer; Bouwmeester et al., 1996), нового секретируемого фактора с сильной активностью индукции головы, экспрессирующегося в anterior dorsal endoderm (ADE), в первых сообщениях подчеркивали возможную роль этого региона в индукции передней части головы. Топографически эквивалентный этому региону у эмбрионов мыши, anterior visceral endoderm (AVE), также участвует в спецификации передних частей (Thomas and Beddington, 1996). Выделение мышиного cerberus-like гена (cerl-1; Belo et al., 1997; Biben et al., 1998; Shawlot et al., 1998), экспрессирующегося в AVE перед и во время гаструляции в регионе, лежащем в основе проспективной передней нейроэктодермы, вызвало заниженную оценку индуктивной роли этого региона у эмбрионов мыши.

Микроинъекции мРНК Xcer в вентральные бластомеры приводит к индукции второй головы. Они включают передний и средний мозг, глаза, цементную железу и обонятельные плакоды (Bouwmeester et al., 1996). Экспланты анимальной шапочки Xenopus широко используются для изучения клеточной дифференцировки, вызванной инъекциями мРНК, кодирующих специфические генные продукты, т.к. без инъекций анимальные шапочки обычно дают только эпидермис. В эксплантах анимальной шапочки микроинъекции мРНК XCer индуцировали маркеры передней части ЦНС, такие как Otx2, но не более задние, подобные Engrailed-2 или HoxB9, это согласуется с отсутствием структур головного мозга кзади от среднего мозга в генерируемой эктопической голове. Энтодермальный ( endodermin) и сердечный ( Nkx-2.5) маркеры также активируются в экспериментах с анимальной шапочкой (Bouwmeester et al., 1996). В некоторых случаях индукция этих похожих на голову структур сопровождалась удвоением сердца и печени. Этот факт может быть связан со способностью мРНК XCerberusиндуцировать упомянутые энтодермальные и сердечные маркеры. XCerberus экспрессируется в клетках, богатых желтком, которые образуют ведущий край гаструлирующей энтодермы Xenopus. Эта клеточная популяция д. в конечном итоге дать переднюю и среднюю кишку. включая печень, как показывает отслеживание клеточных клонов с DiI (Bouwmeester et al., 1996).

В попытке определить генетические и биохимические основы индукции головы с помощью XCer, Piccolo and colleagues продемонстрировали, что Cerberus действует как мультивалентный антагонист ростовых факторов, соединяясь с белками Nodal, BMP и Wnt (Piccolo et al., 1999), ингибируя тем самым активность этих белков во внеклеточном пространстве. Используя некоторые антагонисты этих сигнальных путей, удалось продемонстрировать, что ингибирование сигналов Nodal, BMP и Wnt в вентральных бластомерах достаточно, чтобы индуцировать вторую голову (Piccolo et al., 1999; Glinka et al., 1997). В свете этих фактов было предположено, но не подтверждено, что секреция Cerberus во внеклеточное пространство необходима для закрытия программы головного организатора путем одновременного противодействия трем сигнальным путям, участвующим в формировании туловища, тем самым ограничивается туловищная территория задней частью тела.

Чтобы попытаться выяснить роль XCer, мы использовали комбинацию подходов, используя нокдаун, избыточную экспрессию и рекомбинацию тканей. Morpholino oligonucleotides against XCer (Cer-MO) микроинъецироали в два дорсальных вегетативных бластомера на 4-8 клеточной стадии эмбрионов Xenopus, это нарушало индукцию головы, где уменьшались первичная голова и глаза (Silva et al., 2003; Kuroda et al., 2004). Чтобы выяснить биологическую роль XCer и ADE в формировании головы, мы решили изменить активность и локальную потребность в Xcerberus во время этого процесса.

Мы взялись за это, используя mcer-1 промотор для управления экспрессией BMP, Nodal или Wnt молекул в ADE. До этого мы генерировали лини трансгенных мышей, используя этот промоторный элемент для управления экспрессией EGFP в AVE (Mesnard et al., 2004). Мы также продемонстрировали, что этот мышиный промотор специфически активируется в Xenopus ADE и сильно напоминает пространственно-временной паттерн экспрессии эндогенного XCer (Silva et al., 2003). В этих экспериментах, целенаправленное увеличение BMP, Nodal и Wnt сигналов (которым предположительно противодействует XCer) в ADE, приводит к заметной синергичной потере передней части головы без нарушения задних (туловищных) структур. Но когда мы одновременно истощали уровни XCer и ко-микроинъецировали CerMO, то мы наблюдали сильное усиление фенотипов, генерируемых увеличением уровней активности BMP, Nodal и Wnt, а возникающие эмбрионы полностью лишены головных структур (Silva et al., 2003). Эти результаты демонстрируют, что фактически Xcerberus является биологическим ингибитором передачи сигналов BMP, Nodal и Wnt и что его активность необходима in vivo на ведущем крае ADE для собственно индукции и формирования паттерна головы. Это д. сопровождаться генерацией "headfield", защищенного от постериоризующих сигналов от туловища. Следовательно, правильный баланс агонистов и антагонистов в ADE является критическим для образования головы. Благодаря этой соотв. роли Xcer и ADE в процессе индукции головы, выделение и изучение его мышиного гомолога д. иметь важное значение для понимания механизма развития эмбриона млекопитающих. Мы и др. выделили мышиный Cerberus-like ген (cerl-1; Belo et al., 1997; Biben et al., 1998; Shawlot et al., 1998). Этот ген экспрессируется в AVE со ст. E5.5, а позднее постепенно смещается с помощью возникающей передней дефинитивной энтодермы. Эксперименты с анимальной шапочкой демонстрируют, что этот мышиный ген способен индуцировать тот же самый набор сигналов, как и XCer гомолог (Belo et al., 1997; Biben et al., 1998), но он не способен генерировать характерные эктопические головы, будучи микроинъецирован в вентральные вегетативные бластомеры (Belo et al., 1997). Эти индуктивные активности mCer-1 и Xcer в анимальных шапочках характеризуются ингибированием передачи сигналов BMP (Sasai et al., 1996). Используя биохимические и функциональные методы, мы продемонстрировали, что фактически cerl-1 соединяется и ингибирует сигналы BMP и Nodal, но в отличе от своего аналга у Xenopus , он неспособен соединяться с белками Wnt (Belo et al., 2000). Более того, эксперименты по тканевым рекомбинациям продемонстрировали. что экспрессия Otx2 сохраняется в эктодермальных эксплантах, рекомбинируемых с Cerl-1-экспресирующей сомитной-пресомитной мезодермой (Shawlot et al., 1998).

Итак, cerl-1 экспрессируется в AVE, в регионе, расположенном под проспективной передней нейроэктодермой, он обладает нейральной индуцирующей способностью в экспериментах с Xenopus и способен поддерживать экспрессию Otx2 в эксплантах мышей.

Otx2 и Lim1 являются генами экспрессирующимися в AVE и передней части нейроэктодермы. Сгенерированные KO мышиные линии демонстрируют свою необходимость для собственно образования передних головных структур (Acampora et al., 1995; Matsuo et al., 1995; Shawlot and Behringer, 1995). AVE топологически эквивалентна Xenopus ADE и участвует в спецификации передних частей (Thomas and Beddington, 1996; Belo et al., 1997). Эта роль была подтверждена находкой, что химерные эмбрионы мыши, состоящие из комбинации эпибласта дикого типа и мутантных внеэмбриональных тканей (а именно, AVE), лишенные или Otx2 или Lim1, не формируют собственно голову (Rhinn et al., 1998; Shawlot et al., 1999). В свете всех этих свойств, cerl-1 стал рассматриваться как критический игрок программы головного организатора.

Чтобы исследовать его роль в развитии, мы генерировали целенаправленную инактивацию cerl-1 у мышей (Belo et al., 2000; Shawlot et al., 2000; Stanley et al., 2000). Неожиданно, ни в одной из трех сгенерированных KO линий мышей не обнаружено дефектов головы или эмбриональной оси, это говорит против ранее широко принятой роли cerl-1 в раннем развитии.

Cerl-1, как было продемонстрировано, обладает сильной anti-BMP активностью (Belo et al., 1997; Biben et al., 1998). Др. секретируемые факторы также обладают сходной биохимической активностью: chordin, noggin и follistatin (Iemura et al., 1995; Piccolo et al., 1996; Zimmerman et al., 1996; Piccolo et al., 1999). Этот антагонизм генерирует градированное ингибирование передачи вентральных сигналов BMP, что существенно для формирования дорсо-вентрального паттерна и нейральной индукции у эмбрионов позвоночных (De Robertis and Sasai, 1996). Учитывая эти наблюдения мы предположили, что некоторые др. гены могут компенсировать отсутствие функции cerl-1 у KO мышей. Такой феномен наблюдался с BMP ингибиторами Chordin и Noggin, как указывалось выше (Bachiller et al., 2000). Оба гена экспрессируются в узелке эмбрионов мыши на ст. поздней гаструлы. Позднее они ко-экспрессируются на уровне хордальной и прехордальной пластинок. Удивительно, что двойные гомозиготные chordin;noggin обнаруживают усиливающие синергичные дефекты на уровне развития переднего мозга (Bachiller et al., 2000). Эти дефекты не индуцировались одиночными мутациями в отдельности (McMahon et al., 1998; Brunet et al., 1998; Bachiller et al., 2003), указывая на то, что некоторая компенсация происходит, когда отсутствует только один ингибитор BMP.

Эти доказательства ведут нас к тестированию, могут ли noggin или goosecoid (McMahon et al., 1998; Brunet et al., 1998; Yamada et al., 1995) компенсировать отсутствие функции cerl-1 у мышей. Оба участвуют в ингибировании передачи сигналов BMP и ко-экспрессируются с cerl-1 на уровне мезэнтодермы прехордальной пластинки, а позднее также в AVE (Belo et al., 1998). В экспериментах с Xenopus Xgsc репрессировал экспрессию BMP-4 в маргинальной зоне (Fainsod et al., 1994) и может индуцировать экспрессию chordin (Sasai et al., 1994). Однако сгенерированные двойные мутанты cerl-1;noggin и cerl-1;gsc не давали какого-либо синергичного фенотипа (Borges et al., 2001, 2002), указывая тем самым, что ни noggin, ни goosecoid не компенсируют потерю функции cerl-1 и что эти гены не взаимодействуют генетически. Эти результаты могут указывать на то, что настоящее биологическое значение cerl-1 у мышей может быть не связано с anti-BMP активностью.

Как упоминалось выше, cerl-1 обладает сильной anti-Nodal активностью (Belo et al., 2000). Исследования куриного гомолога Caronte (или chick Cerberus, cCer ) продемонстрировали, что его экспрессия в гипобласте (у кур эквивалент AVE мышей и ADE у Xenopus) необходима для образования головы (Bertocchini and Stern, 2002), путем предотвращения образования мезодермы туловища в проспективную головную нейроэктодерму посредством его anti-Nodal активности. Lefty1 является др. секретируемым узелком антагонистом и экспрессируется в клетках AVE (Meno et al., 1997). Подобно cerl-1 KO эмбрионам, сгенерированные мышиные мутанты, лишенные lefty-1, также лишены гаструляционных фенотипов (Meno et al., 1998; Belo et al., 2000). Однако, когда были получены cerl-1;lefty1 двойные мутантные животные, то развитие возникающих в результате эмбрионов было сильно нарушено из-за избыточной и нерегулируемой активности узелка (Perea-Gomez et al., 2002; Yamamoto et al., 2004). Yamamoto с коллегами показали, что асимметричное ингибирование Nodal управляет миграцией Distal Visceral Endoderm (DVE) в переднее положение. Эта миграция сопровождается стимуляцией пролиферации висцеральных энтодермальных клеток с помощью Nodal, тогда как Lefty1 и Cerl-1 детерминируют направление миграции за счет асимметричного ингибирования активности Nodal на проспективную переднюю сторону (Yamamoto et al., 2004). Позднее это сочетанное ингибирование активности Nodal в AVE также необходимо, чтобы ограничить формирование первичной полоски задним концом эмбриона мыши путем противодействия передаче сигналов Nodal (Perea-Gomez et al., 2002). Итак, эти исследования четко показывают потребность в ингибиторах узелка cerl-1 и lefty1, чьи перекрывающиеся активности во время раннего развития существенны для закладки A-P оси.

Итак, результаты исследований Xcer, Cer-l и cCer строго подтверждают роль в генерации асимметрии на перигаструляционных стадиях. В этом контексте молекулы Cerberus проявляются как основные игроки в установлении Anterior-Posterior оси у ранних эмбрионов позвоночных.