Ранее был проведен биоинформационный поиск специфичных для насекомых генов с усиленной экспрессией в OSNs (Benton et al., 2007). Среди них мы нашли членов крупного семейства ionotropic glutamate receptor (iGluR) с неизвестной биологической функцией (Littleton and Ganetzky, 2000).
A Large Family of Divergent Ionotropic Glutamate Receptor-like Genes in Drosophila
Мы идентифицировали 6 экспрессирующихся в антеннах генов, кодирующих белки iGluRs (data not shown) (Littleton and Ganetzky, 2000). Используя последовательности этих рецепторов, произвели исчерпывающий BLAST поиск в геноме Drosophila , идентифицировали семейство из 61 предсказанного гена и двух псевдогенов. Эти гены распределены по геному как в виде индидуальных последовательностей, так и в виде тандемных рядов из 4-х генов (Figure 1 A; data not shown). Мы назвали это семейство ionotropic receptors (IRs) и дали имена индивидуальным генам IRs, используя номенклатурные конвенции Drosophila OAs (Drosophila Odorant Receptor Nomenclature Committee, 2000) (Figure 1A).
Филогенетический анализ последовательностей IR белков показал, что они не являются близко родственными членами каноническим семействам iGluRs (AMPA, kainate, NMDA или delta) (Figure 1B). Однако они имеют, по-видимому, сходную модулярную организацию с iGluRs, представлены внеклеточным N концом, двусоставным лиганд-связывающим доменом, чьи две доли (S1 м S2) разделены доменом ионного канала, и коротким цитоплазматическим C концом (Figures 1 and 2 and data not shown) (Mayer, 2006). Мы отмечаем, что структура генов и последовательности белков большинства рецепторов пока только в виде компьтерных предсказаний. Тем не менее , семейство чрезвычайно разнообразно, обладает в целом идентичными 10%-70% аминокислотными последовательностями. Наиболее консервативная область между IRs и iGluRs распространяется на пору ионного канала (Figure 1C), указывая тем самым, что IRs сохраняют ион-проводящие свойства.
Лиганд-связывающие домены значительно более изменчивы, хотя расположение небольших регионов S1 и S2 долей в IRs и iGluRs делают возможным экспертизу консервации позиций аминокислот, это делает возможным прямой контакт с glutamate или искусственными агонистами в iGluRs (Armstrong et al., 1998; Armstrong and Gouaux, 2000; Jin et al., 2003; Mayer, 2005) (Figure 2). Хотя все iGluRs имеют arginine (R) остаток в S1, который связывает α-carboxyl шоуппу глютамата, только 19 из61 (31%) IRs сохранили этот остаток (Figure 2A). В первой половине S2 домена, 9 из 61 (15%) IRs сохранили threonine (T), который контактирует с γ-carboxyl группой глютамата во всех AMPA и kainate рецепторах (Figure 2B). Интересно, что iGluRs, которые лишены T остатка (NR1, NR3A, delta) имеют глицин или серин, а не глютамат в качестве предпочтительного лиганда (Mayer et al., 2006; Naur et al., 2007). Наконец, во второй половине S2 домена, 100% iGluRs имеют законсервированный aspartate (D) или glutamate (E), который взаимодействует с α-amino группой лиганда глютамата. по сравнению с 10 из 61 (16%) IRs (Figure 2B). Из 61 IRs, только три (IR8a, IR75a, IR75c) сохранили R, T и D/E остатки, характерные для iGluRs, хотя эти остатки расположены в иной структурной основе. Др. IRs обнаруживают разнообразие аминокислот в одной или нескольких из этих позиций. Т.о., лиганд-связывающая специфичность большинства или всех IRs скорее всего отличается от таковой iGluRs и варьирует в семействе IR.
IRs Are Expressed in Chemosensory Neurons that Do Not Express ORs or OR83b
Мы выявляли экспрессию IR семейства с помощью ткане-специфической RT-PCR и РНК гибридизации in situ. 15 IR генов экспрессируются в антенне (Figure 1A and Figure 3). Транскрипты этих генов не были обнаружены где-либо ещё в голове, теле или придатках взрослых мух за исключением IR25a и IR76b, которые экспрессировались также в хоботке (data not shown). Экспрессия остальных 46 IR генов не обнаружена воспроизводимо в какой-либо взрослой ткани. Неясно или эти гены не экспрессируются или экспрессииются на разных стадиях жизни или экспрессируются ниже порога детекции нашего метода.
Мы анализировали, где в антенне экспрессируются IR гены в сравнении с ORs с помощью двойной РНК гибридизации in situ с зондами для OR ко-рецептора OR83b и одного из нескольких IR генов, включая IR64a, IR76b, IR31a и IR40a (Figure 3A and data not shown). IRs не экспрессируются в basiconic и trichoid сенсиллах, т.к. они не ко-экспрессируются с OR83b, и экспрессия IR сохраняется у мутантов по пронейральному гену с отсутствием md нейронов и обонятельных сенсилл (amos) (Goulding et al., 2000; zur Lage et al., 2003) (Figure 3A, top and middle panels; data not shown). Однако экспрессия этих IRs зависит от пронейрального гена atonal, который специфицирует coeloconic сенсиллы, а также в перо-подобной проекции, наз. arista, и в трехкамерном кармане, называемом sacculus (Figure 3A, bottom panel; data not shown) (Gupta and Rodrigues, 1997; J Haven et al., 2000). Т.о., ORs и IRs экспрессируются в онтогенетически разных сенсорных клонах в антенне. Единственным исключением является субпопуляция coeloconic OSNs, которые экспрессируют и IR76b и OR35a/OR83b (Couto et al., 2005; Yao et al., 2005) (Figure 3A). Мы подтвердили, что IR-экспрессирующие клетки в антенне являются нейронами, продемонстрировав, что они ко-экспрессируют нейрональный elav (Figure 3B and data not shown).
Затем мы создали исчерпывающую карту экспрессии IR (Figures 3C-3F). Каждый обследованный IR имеет топологически определенный паттерн экспрессии, который законсервирован между индивидами и обоими полами (data not shown). IR8a и IR25a, которые кодируют близко родственные рецепторы (Figure 1B), экспрессируются широко и обнаруживаются в перекрывающихся популяциях нейронов вокруг sacculus и в основной части антенны (Figure 3C; data not shown). IR25a, но неIR8a обнаруживается также в аристе (data not shown; see below). IR21a экспрессируется приблизительно в 6 нейронах в аристе (Figure 3D), а также в 5-10 нейронах вблизи третьей камеры sacculus (Figure 3E, bottom panel). Три IRs обладают специфической экспрессией в нейронах, окружающих sacculus: IR40a и IR93a ко-экспрессируются в 10-15 нейронах соседних первой и второй камер sacculus (Figure 3E, top panel), тогда как IR64a обнаруживается в 10-15 нейронах, окружающих третью камеру (Figure 3E, middle panel).
Остальные 9 IRs экспрессируются в coeloconic OSNs, распределенных по антенне (Figure 3F), двойные и тройные из этих рецепторов в ammonia-insensitive ac4 сенсиллах (Figure 7A) (Yao et al., 2005). Если IR92a эктопически экспрессировался в ac4 сенсиллах, то эти нейроны становились чувствительными к стимуляции с помощью аммиака (Figures 7A and 7B). 1,4-diaminobutane, контрольный стимул, который не активирует ни ad, ни ac4 нейроны (Yao et al., 2005), не стимулировал ac4 сенсиллы, неправильно экспрессирующие IR92a. Более того, не наблюдалось неспецифической реакции на аммиак у контрольных UAS-IR92a животных или у животных, у которых др. рецептор, IR31a, эктопически экспрессируется в ac4 OSNs (Figure 7B). Мы отметили, что величина реакции эктопических IR92a на аммиак ниже, чем при нативных ammonia-вызываемых реакциях в ad сенсиллах (Yao et al., 2005). Это может быть обусловлено отсутствием кофакторов, присутствующих в ad сенсиллах, но не в ac4 сенсиллах. Тем не мене эти результаты указывают на то, что IR92a представляет. по крайней мере, частично ammonia-специфический хемосенсорный рецептор.
DISCUSSION
Molecular Biology of IR Function
Специфические комбинаторные паттерны экспрессии IRs в сенсорных нейронах и разнообразие их лиганд-связывающих доменов трудно согласовать с генеральной ролью в сигнальной трансдукции, независимо от распознаваемого лиганда. Более важно, что non-native обонятельная чувствительность, индуцируемая эктопической экспрессией IR84a и IR92a, указывает на то, что IR белки действуют непосредственно как лиганд-специфические хемосенсорные рецепторы. Хотя эти эксперименты демонстрируют достаточность IRs для обеспечения чувствительности к запахам, определенная проверка их необходимости нуждается в анализе мутаций потери функции.
В нервной системе животных iGluRs обеспечивают коммуникации между нейронами путем образования glutamate-контролирующих ионных каналов (Mayer, 2006), мы полагаем, что IRs также формируют ионные каналы, контролируемые с помощью запахов и др. хемосенсорных стимулов. Растущее число ионотропных механизмов в хеморецепции хорошо известно. Напр., члены семейства transient receptor potential (TRP) ионных каналов являются первичными рецепторами болезненных соединений, включая capsaicin и menthol (Jordt et al., 2003; Bandell et al., 2007) и участвуют также в определении вкуса кислот (Huang et al., 2006; Ishimaru et al., 2006). ORs насекомых также обнаруживают функциональные свойства ионных каналов (Sato et al., 2008; Wicher et al., 2008). Доказательства, что IRs функционируют как ионные каналы требуют электрофизиологической их характеристики в гетерологичных системах экспрессии, а доказательства прямого связывания хемосенсорных лигандов с IRs нуждаются в биохимических исследованиях in vitro.
iGluRs обычно функционируют как гетеротетрамерные ансамбли с изменчивым субъединичным составом, которые обладают отличающимися функциональными свойствами, такими как чувствительность к лиганду и проницаемость для ионов. Наш анализ показал, что до 5 различных IRs может ко-экспрессироваться в одиночном сенсорном нейроне, открывается возможность. что эти рецепторы также формируют мультимерные белковые ансамбли с зависимыми от субъединиц характеристиками. особый интерес представляют два широко экспрессирующихся члена семейства, IR8a и IR25a, которые могут представлять собой общуюю субъединицу во многих разных типах IR комплексов. Их функция неясна, но возможно, что они обладают ко-рецепторной функцией с др. IRs, подобно OR83b (Larsson et al., 2004; Nakagawa et al., 2005; Benton et al., 2006; Sato et al., 2008). Предварительный анализ IR25a мутантов не выявил очевидных дефектов в реакциях, вызываемых запахами с coeloconic сенсиллах (data not shown), но это может быть обусловлено перекрываемостью IR25a с IR8a или существованием гомомерных IR рецепторов без IR8a или IR25a. Др. IRs, такие как IR75a и IR76b, экспрессируются в двух или более типах coeloconic сенсорных нейронов. В этих случаях реакционные свойства могут быть предопределены комбинацией IRs, экспрессируемых в этих самостоятельных популяциях нейронов. Однако сегодня неизвестны соотв. лиганды для некоторых coeloconic OSNs , это делает затруднительным сопоставление специфических лигандов с индивидуальными IR нейронами на базе только наших карт экспрессии.
Comparative Chemosensation by IRs and ORs
Репертуар IR удивительно сходен по размеру, общей геномной организации и дивергенции последовательностей с Drosophila ORs. Подобно ORs, индивидуальные IRs специфически экспрессируются в небольших субпопуляциях хемосенсорных нейронов и эта экспрессия регулируется относительно короткими (менее 1-2 kb) вышестоящими регуляторными регионами (Couto et al., 2005; Fishilevich and Vosshall, 2005; Ray et al., 2007) (Figures 5A and 5B; and R.B., unpublished data). Более того, по крайней мере, одна популяция IR-экспрессирующих нейронов конвергирует в одиночную гломерулу в антенной доле подобно wiring логике, выявленной для OR-экспрессирующих нейронов как в обонятельной системе у беспозвоночных, так и позвоночных (Mombaerts et al., 1996; Gao et al., 2000; Vosshall et al., 2000; Couto et al., 2005; Fishilevich and Vosshall, 2005). Однако наблюдаются некоторые отличия в организационной логике экспрессии IR и OR. Большинство OR-экспрессирующих нейронов экспрессирует одиночный OR ген, вместе с OR83b, в самостоятельных кластерах, которые иннервируют специфические обонятельные сенсиллы. Напротив, большинство IR-экспрессирующих нейронов, идентифицированных в антеннах, экспрессируют два или три IR гена в дополнение к одному или обоим широко экспрессируемым генам IR8a и IR25a. Более того, перекрывание наблюдается как в отношении молекулярного состава разных IR нейронов, так и в отношении комбинации нейронов, которые иннервируют данную сенсиллу. Напр., IR76b ко-экспрессируется с, по крайней мере, двумя др. отличающимися IR генами в, по крайней мере, двух разных сенсиллах-с IR92a в ad и с IR76a в ac4-а также ко-экспрессируется с OR35a и OR83b в ac3. Хотя точная биологическая логика ко-экспрессии IR ждет соотнесения специфических хемосенсорных лигандов с IR-экспрессирующими нейронами, комбинаторная экспрессия IRs может вносить более существенный вклад в их роль по сенсорной детекции, чем для ORs.
Почему Drosophila обладает двумя типами антенных хемосенсорных рецепторов? Хотя оба могут быть ионотропными, IRs и ORs являются не просто небольшими эволюционными вариантами. Семейства рецепторов молекулярно неродственны и находятся под контролем разных онтогенетических программ и находятся внутри сенсорных структур с радикально отличающейся морфологией. Поэтом вполне возможно, что эти хемосенсорные рецепторы обеспечивают разные функции хемочувствительности. Анализ хемосенсорного поведения. обеспечиваемого IR sensory circuits-сегодня возможен после нашей идентификации специфических молекулярных маркеров для этих путей-он может предоставить информацию о вкладах этих разных обонятельных субсистем. IRs могут также функционировать в др. хемосенсорных модальностях, т.к. два антенных IRs обнаруживаются также в хоботке, а экспрессия 46 членов остаётся с неизвестным репертуаром.
An Evolutionarily Ancient Chemical-Sensing Mechanism
Хемовосприятие является родоначальной сенсорной модальностью, которая датируется более ранним числом эволюции эукариот. Существуют ли пути консервации в молекулярных механизмах, с помощью которых прокариоты и эукариоты ощущают внешние химикалии? iGluRs , как известно, возникли ещё у прокариот. Их домен ионного канала гомологичен бактериальному калиевому каналу, а домен, связывающий лиганд, структурно родственен бактериальным periplasmic binding proteins (PBPs), внеклеточным белкам, которые устраняют или ощущают аминокислоты, углеводы и ионы металлов благодаря соединению с транспортерами или chemotaxis рецепторами (Mayer and Armstrong, 2004; Mayer, 2006). Эволюционные связи между функциями iGluRs и PBP рассматриваются нечасто, воотще-то частично из-за их очень слабого сходства первичных последовательностей, широко распространенное появление PBP складки-также присутствует, напр., в бактериальных транскрипционных регуляторах-и выполняет роль в iGluRs по обеспечению или регуляции синаптической передачи, процессу довольно удаленному от потребления растворимых веществ и хемотаксиса у бактерий.
Наше открытие семейства дивергентных iGluR-подобных белков, которые могут действовать как периферические хемосенсоры, предоставляет связь между несопоставимыми функциями этих белковых модулей. Хотя роль IRs в детекции различных внешних лигандов аналогична функции бактериальных PBPs, первичные последовательности и экспрессия в нейронах IRs безусловно ближе к свойствам iGluRs. Интересно, что огромное семейство iGluR-родственных белков, GLRs, идентифицирована также у растения Arabidopsis thaliana (Lam et al., 1998; Chiu et al., 1999). Хотя ничего неизвестно о их физиологических функциях, но биоинформационный анализ GLRs указывает на то, что glutamate вряд ли является их природным лигандом (Dubos et al., 2003; Qi et al., 2006). Возможно, что GLRs могут выполнять роли хемосенсоров, напр., для детекции питательных веществ почвы или летучих компонентов в воздухе. Т.о., хотя iGluRs были тщательно исследованы в отношении их роли в синаптических коммуникациях, наша характеризация IRs ведет нас к предположению об родоначальной функции этого семейств белков в детекции химических лигандов, чтобы обеспечить как внутриклеточные коммуникации, так и восприятие средовых химических соединений.
Сайт создан в системе
uCoz