ISREs | PGC

Fragilis семейство interferon-индуцибельных генов тесно ассоциировано со спецификацией зародышевых клеток у мышей. Более того, его эволюционная консервация предполагает, что оно вероятно играет критическую роль у всех млекопитающих.

Детерминация зародышевой линии у мышей, как полагают, происходит благодаря передаче инструктивных сигналов у гаструлирующих пост-имплантационных эмбрионов. Во-первых, проксимальные клетки эпибласта приобретают компетентность зародышевых клеток на ст. E6.5, частично в ответ на внеэмбриональные, продуцируемые эктодермой сигнальные молекулы. Субнабор таких компететных клеток затем приобретает судьбу primordial germ cell (PGC) и популяция примерно из 45 зародышевых клеток основательниц обнаруживается в задней проксимальной области эмбриона в основании зараждающейся почки аллантоиса на ст. E7.5. Секретируемые сигнальные молекулы, BMP4, BMP8b и BMP2 также как и компоненты пути трансдукции сигналов BMP, включая Smad1 и Smad5, по-видимому, участвуют в спецификации PGCs. Однако, исследования культуры in vitro и анализ BMP4-дефицитных мышей указывает на то, что дополнительные сигналы также м.б. необходимы для приобретения судьбы PGC,но каковы они, неизвестно.

Авт. идентифицировали fragilis, предполагаемый interferon-индуцибельный ген, которые кодирует трансмембранный белок, которые, по-видимому, ассоциирует с приобретением клетками эпибласта компетентности зародышевых клеток. Внеэмбриональная эктодерма способна индуцировать экспрессию fragilis в тканях эпибласта, a BMP4 необходим для такой индукции. fragilis экспрессируется в проксимальной части эпибласта на ст. E6.5, в области, в которой располагаются PGC-компетентные клетки. Когда эти проксимальные клетки перемещаются в заднюю проксимальную область во время гаструляции, то экспрессия fragilis увеличивается в сообществе клеток у основания зарождающейся почки аллантоиса. Клетки с наивысшим уровнем экспрессии fragilis инициируют характерную для зародышевых клеток экспрессию TNAP и stella/PGC-7. Эти зарождающиеся основательницы PGCs высокой экспрессией fragilis обнаруживают также репрессию Hox генов, включая Hoxb1.

В виду строгой ассоциации fragilis со спецификацией PGC было предпринято исследование, как эти гены м.б. регулируемы и какова их точная функция во время развити зародышевых клеток. Теперь ясно, что fragilis отностся к новому семейству генов, представленному 5 членами, которые кодируют очень сходные трансмембранные белки. Гены образуют кластер внутри геномной области в 68 kb. Выявлена определенная гомология семейства Fragilis у людей, коров и крыс cow and rat, оно, по-видимому, эволюционно законсервировано среди млекопитающих. Большинство, если не все гомологичные гены отвечают за передачу сигналов interferon, с этим согласуется присутствие законсервированных interferon stimulable response elements (ISREs), по крайней мере в локусах мышей и людей. Более того, два наиболее близкие к fragilis, fragilis2 and fragilis3, также экспрессируются в основательницах PGCs, хотя их общий паттерн экспрессии у постиплантационных эмбрионов в др. аспектах отличен. Изучение семейства генов Fragilis важно для понимания спецификации PGC, особенно из-за того, что их гомологи участвуют в обеспечении гомотипической клеточной адгезии и в удлиннение времени клеточного цикла. Эти исследования м. также показать, как интерфероны действуют в качестве сигнальных молекул в контекстве эмбрионального развития.

The Fragilis gene family

Использовав последовательности кДНК fragilis в качестве матрицы, осуществляли поиск Ensembl genome browser http://www.ensembl.org/, в результате идентифицировано 8 мышиных генов со сходством последовательностей с fragilis (45–74%). ESTs из разных эмбриональных и взрослых тканей выявило 5 таких генов, из которых 4 обладали двух-экзонной структурой, сходной с fragilis. Анализ геномной локализации последних показал, что 4 гена образуют кластер вокруг локуса fragilis внутри области в 68 kb на дистальном кончике мышиной хромосомы 7 (F5). Новые гены были названы fragilis2-5, в соответствии с их геномным расположением, их сходством с fragilis и их ассоциацией с зародышевыми клетками (Рис. 1). 4 оставшихся предполагаемых генов обнаруживали низкие или не обнаруживали ESTs и кодировались одиночным экзоном, несходным с fragilis. Они были отнесены к псевдогенам.

Чтобы определить, являются ли гены Fragilis эволюционно законсервированными, сравнивали с геномом человека, используя Ensembl, и нашли 4 гомолога на Chr 11 (p15.5), в области синтеничной семейству Fragilis в мышиной Chr 7 (Рис. 1). 3 из этих генов, Ifitm1 (9–27), Ifitm2 (1-8D) и Ifitm3 (1-8U), обладали 58–65% сходством с кластером генов fragilis и локализовались внутри геномного отрезка в 18 kb. Они ответственны за type1/2 interferons и кодируют interferon induced transmembrane (Ifitm) белки, участвующие в передаче антипролиферативных сигналов и гомотипической клеточной адгезии. Четвертый ген, ENSG142056, новый ген с двумя экзонами очень сильно сходный с мышиным геном fragilis4 (83% сходных ДНК последовательностей) и соседним Ifitm2. Гомологи семейства Fragilis у члеовека , следовательно, формируют сходный геномный кластер как и 5 генов Fragilis в геноме мыши (Рис. 1). Филогенетический анализ показывает, что только два гена Fragilis, fragilis4 и или fragilis, fragilis2 или fragilis3, законсервированы у мыши и человека. Последующие удвоения генов м. происходить независимо у обоих видов. Идентифицированы также Fragilis family-подобные гены у коров (bovine 1-8U, bovine 9–27) и 4 гена у крыс (P26376, JC1241, NP110460, AAD48010). Если гены крыс известны как interferon-индуцибельные, то два телячьих гена сходные с человеческими генами Ifitm, отвечают на передачу сигналов интерферона. Из-за недостатка информации нельзя пока решить организованы ли гены коров и крыс в кластер. Interferon stimulable response elements (ISREs, GGAAAN(N)GAAAC) внутри локуса Ifitm человека отвечают за чувствительность трех генов Ifitm человека к интерферону. Сходные ISRE консенсусные последовательности также обнаружены в кластере Fragilis семейства мышей, в частности в связи с fragilis, fragilis2 и fragilis5 (Рис. 1).

Мышиное семейство fragilis и родственные гены кодируют 5 очень сходных транскриптов в 104 - 144 аминокислот, каждый имеет два предполагаемых трансмембранных домена (Рис. 2). Сходство последовательностей с человеческими, коровьими и крысиными fragilis-подобными генами достаточно высокое (в целом 68% сходных аминокислот). Первый трансмембранный домен, а также последующий участок до начала второго трансмембранного домена представляют области наивысшей внутри- и межвидовой консервации.

fragilis, fragilis2 and fragilis3 are expressed during early post-implantation development

Анализировали паттерн экспрессии 5 генов семейства Fragilis с помощью in situ гибридизации, используя зонды, которые захватывают 3' область (150–200 bp) соотв. мРНК. Эти зонды не обнаруживали существенной перекрестной гибридизации между членами семейства Fragilis как показал dotblot анализ. Выявлена экспрессия fragilis ограниченная эпибластом на ст. E5.5 и E6.5. На ст. E7.5, экспрессия fragilis интенсивная в популяции клеток в основании аллантоиса, в области, где происходит спецификация PGC (Рис. 3a,3b,3c). fragilis2 и fragilis3 также экспрессиируются внутри эпибласта на ст. E5.5 (Рис. 3g). В то время как экспрессия fragilis2 после этого существенно уменьшается, экспрессия fragilis3 сохраняется на том же уровне в эмбриональной ткани. На E7.5, fragilis2 обнаруживается в задней мезодерме, тогда как экспрессия fragilis3 , обнаруживается по всему эпибласту. Подобно fragilis, и fragilis2 и fragilis3 обнаруживают высокий уровень экспрессии в области, где возникает кластер клеток основательниц PGCs (Рис. 3i/i',3n/n'). Т.о., эти три члена семейства Fragilis обнаруживают экспрессию связаннаю пространственно и во времени со спецификацией PGC specification.

На E8.5 экспрессия fragilis обнаруживается в клетках у уснования и внутри проксимальной треть аллантоиса (Рис. 3d). Кроме того, сигнал обнаруживается латерально-передних аспектах развивающегося головного мозга (Рис. 3e). На этой стадии fragilis2 экспрессируется в мезодерме каудальной половины эмбриона (Рис. 3j,3k), тогда как fragilis3 , по-видимому, присутствует во всем эмбрионе (Рис. 3p,3q,3r). Экспрессия выглядит достоверно сильнее в клетках у основания и в проксимальной трети аллантоиса (Рис. 3q). На E9.5 сигнал fragilis обнаруживается в мезодерме и глоточных дугах (Рис. 3f). На этой стадии экспрессия fragilis2 выглядит ограниченной хвостовой почкой, мезодермой, каудальнее 15-го сомита и развивающейся легочной ткани (Рис. 3l).

Дальнейший анализ экспрессии fragilis2 осуществляли с помощью гибридизации in situ на поперечных и сагитальных срезах на ст. E9.5 и E10.5 соотв. Это подтвердило паттерн, обнаруживаемый на целых препаратах, а именно, присутствие окраски в пресомитной, сомитеной мезодерме и мезодерме стенки тела в каудальных областях эмбриона E9.5 (Рис. 4a,4b,4c,4d). Очевидно, что экспрессия fragilis2 теряется в дифференцирующейся мезодерме или соматической ткани, этим объясняется каудально-ростральный градиент окрашивания, видимый в каудальной области на целых эмбрионах (Рис. 3l). Кроме того выявлена экспрессия в вентральной части нервной трубки, а также в одиночных клетках стенки задней кишки. Сагитальные срезы эмбрионов E10.5 показывают, что эти последние клетки принадлежат к популяции fragilis2 мРНК позитивных клеток, которые мигрируют вдоль задней кишки и вентральнее дорсаль ной аорты (Рис. 4e,4g). Их расположение строго указывает на то, что эти клетки являются , по крайней мере частично, PGCs, мигрирующими из места своего возникновения к разви вающийся генитальный гребень. Более того, экспрессия fragilis2 обнаруживается в ткани развивающихся легких кзади от эмбрионального сердца и вентральнее дорсальной аорты (Рис. 4e,4f).

Ни fragilis4 ни fragilis5 не обнаруживают экспрессии на ранних постимплантационных стадиях (E7.0-E8.5). Следовательно, только три гена в центре кластера семейства, fragilis, fragilis2 и fragilis3 экспрессируются у эмбрионов между E5.5 и E9.5. Хотя паттерн их экспрессии отличен, имеется очевидное перекрывание в области основательниц зародышевых клеток. М. предположить, что fragilis, fragilis2 и fragilis3 обладают общими регуляторными элементами, которые д. присутствовать внутри кластера.

Single cell analysis of fragilis, fragilis2 and fragilis3 in PGCs and somatic neighbours

Тестировали кДНК одиночных клеток из PGCs и окружающих соматических клеток у E7.5 эмбрионов. И fragilis2 и fragilis3 экспрессировались в основательницах PGCs, которые обнаруживали транскрипцию маркеров зародышевых клеток stella/PGC7 (Рис. 4a). Два члена семейства Fragilis обнаруживались также а окружащих соматических клетках, у которых отсутствовала экспрессия stella/PGC7 . Установлено, что fragilis2 и fragilis3 экспрессировались преимущественно на высоких уровнях в PGCs по сравнению с соседними соматическими клетками (Рис. 4b,4c). Это воспроизводит паттерн, характерный для fragilis, хотя экспрессия этого гена более специфична для заролышевых клеток. Вместе с данными по гибридизации in situ эти наблюдения подтверждают, наличие определенных общих контролирующих элементов, участвующих в активации экспрессии трех генов Fragilis в founder PGCs.

Точная экспрессия генов во время миграции PGCs не очень ясна на этой стадии из анализа авт. Однако, используя гибридизацию in situ и PCR анализ кДНК из одиночных клеток внутри генитального гребня, авт. выявили четкую экспрессию fragilis, fragilis2 и fragilis3 в гонадных зародышевых клетках на ст. E11.5/12.5 (Рис. 5). В то время как экспрессия fragilis3 распространяется на mesonephros, сигнал fragilis и fragilis2 ограничивается гентальным гребнем. Паттерн точечного окрашивания у fragilis, воспроизводит экспрессию, ограниченную зародышевыми клетками, для stella/PGC7 (Рис. 5b). Это указывает на то, что fragilis экспрессируется преимущественно, если не исключительно в зародышевых клетках на ст. E11.5. Ни fragilis4 ни fragilis5 не обнаруживаются в гонадных зародышевых клетках.

Discussion

Итак. три члена семейства Fragilis, fragilis, fragilis2 и fragilis3 обнаруживают э кспрессию, которая связана со спецификацией и развитием зародышевых клеток. Локализованные в клеточной мембране белки Fragilis важны для обеспечения взаимодействий среди зародышевых клеток и окружающих их соседей. Все они обнаруживаю усиление своей экспрессии внутри зарождающихся PGCs. Возможно, что существуют цис-контролирующие элементы внутри локуса, который необходим для этой экспрессии, которая продолжается внутри гонадных PGCs. Дальнейшие исследования установят, существуют ли такие контролирующие элементы, где они расположены и как регулируют экспрессию fragilis-родственных генов.

Хотя 5 сленов семейства Fragilis собраны в кластер, очевидно, что ни fragilis4 , ни fragilis5 не экспрессиируются в ранних эмбрионах или эмбриональных зародышевых клетках. Отсутствие экспрессии м.б. обусловлено присутствием пограничных элементов, которые м. ограничивать действие контролирующих элементов. 4 человеческих гомолога семейства Fragilis также ранжированы в геномный кластер. Однако, сравнение последовательностей указывает на то. что удвоения генов в мышином Fragilis и человеческом Ifitm локусе м. происходить независимо. Следовательно, определенное эволюционное сдерживание м. сущестовать в отношении удвоений и поддержания удвоеных генов в непосредственной близи. Т.к. человеческие гомологи собраны в кластер в синтеничной области и очеть сходны с семейством генов, то м. предположить, что они м. выполнять сходные функции у мыши и человека.

Присутствие некоторых interferon stimulable response element (ISRE) консенсусных последовательностей в локусе Fragilis вместе со сходством генов с их interferon-индуцибельными человечьими и телячьими аналогами строго подтверждает, что fragilis и fragilis-родственные гены яувствительны к интерыеронам и возможно др. цитокинам. В самом деле ISRE тандемный повтор присутствует на 5' фланкирующей области генов Ifitm1, Ifitm2 и Ifitm3 человека, а также присутствует в 5' фланкирующей области fragilis exon 1. Интерфероны, как секретируемые сигнальные молеклы, участвуют в основном в процессе иммунного ответа, ингибировании клеточного роста и контроле апоптоза. Хотя интерфероны и экспрессируются у постимплантационных эмбрионов. их роль во время развития детально не изучена. Полученные данные открывают возможность вовлечения интерферонов в развитие зародышевых клеток.

Conclusion

We have identified the Fragilis family of interferon-inducible genes, which code for transmembrane proteins. The five members are arranged in a cluster within a genomic region of 68 kb in the mouse that also contains ISRE elements. The centrally located fragilis, fragilis2 and fragilis3 genes are of particular interest, because they are expressed in the region and at the time where germ cell specification occurs. The family is evolutionarily conserved amongst mammalian species where it may serve similar functions. Detailed studies of the Fragilis family may also show what role interferons have in embryonic development