G-protein-coupled receptors (GPCRs) составляют большое и разнообразное семейство, чья первичная функция заключается в трансдукции внеклеточных стимулов во внутриклеточные сигналы. На базе их гомологоии с rhodopsin они, по-видимому, содержат 7-раз пронизывающую мембрану спираль, внеклеточный N-конец и внутриклеточный С-конец. От этого происхдит их др. название 7-TM рецепторы или heptahelical рецепторы. GPCRs передают внеклеточные стимулы во внутриклеточные сигналы посредством взаимодействия своих внутриклеточных доменов с гетеротримерными G белками, a кристаллическая структура одного из членов этой группы, телячьего rhodopsin, недавно установлена (Palczewski et al., 2000).
Присутствие GPCRs в геноме бактерий, дрожжей, растений, нематод и др. групп беспозвоночных говаоти в пользу относительно реннего эволюционного происхождения этой группы молекул. Разнообразие GPCRs диктуется как многочисленностью стимулов, на которые они реагируют, а также разнообразием внутриклеточных сигнальных путей, которые они активируют. Сюда входят и свет, и нейротрансмиттеры, одоранты, биогенные амины, липиды, белки, аминокислоты, гормоны , нуклеотиды, хемокины и без сомнения многие др. Имеется, по крайней мере, 18 различных Gα белков у человека, с которым GPCRs м.б. купированы (Hermans, 2003; Wong, 2003). Эти Gα белки формируют гетеротримерные комплексы с Gβ субъединицами, которых имееется, по крайней мере, 5 типов, и Gγ субъединицами, которых, по крайней мере, 11 типов (Hermans, 2003).
Подсчёёты количества GPCRs в геноме человека широко варьируют. Исходя из их последовательностей, а также их известных и предполагаемых функций, определяется 5 или 6 больших классов GPCR. При недавнем анализе GPCRs в геноме человека было выявлено более 800 GPCRs (Fredriksson et al., 2003). Из этого общего количества 701 принадлежит к семейству rhodopsin (type A), а из них 241 был не-обонятельным (Fredriksson et al., 2003). Согласно этому анализу имеется приблизительно 460 типа A обонятельных рецепторов, хотя подсчёты варьируют от 322 (Glusman et al., 2001; Takeda et al., 2002) до 900 (Venter et al., 2001), из них 347 уже клонированы (Zozulya et al., 2001). Столь большое количество обонятельных рецепторов объясняет способность людей ощущать широкое разноообразие экзогенных (пахучих) лигандов. Исследование, сходное с Fredriksson et al. (Fredriksson et al., 2003) идентифицировало 367 человеческих endoGPCRs и 392 мышиных endoGPCRs (Vassilatis et al., 2003); термин endoGPCR означает GPCRs для эндогенных (не-обонятельных) лигандов. Зная о существовании альтернативных сплайс-вариантов и редактируемых изоформах GPCRs, м. предположить, что истинное число GPCRs никогда не будет установлено и будет намного выше подсчитанного.
Показаное древо иллюстрирует взаимоотношения между первичными последовательностями белков из 274 типа A rhodopsin-подобных GPCRs; для ясности, семейство secretin рецепторов (в котором 15), семейство адгезивных рецепторов(24), семейство glutamate рецепторов (15) и семейство frizzled/taste2 рецепторов (24) не включены. Чтобы сконструировать это древо был использован список рецепторов, использованный Fredriksson et al. (2003), послуживший стартовой точкой, и добавлены вновь открытые `orphan' рецепторы (http://kidb.bioc.cwru.edu/rothlab/jalview/viewJalView.html).
Установлены белковые последовательности каждого рецептора и последовательности N- и C-концов, которые изменчивы по длине и обнаруживают мало сходства у рецепторов. Белковые последовательности затем сравнивались и выстраивалось древо с использование ClustalW server (http://clustalw.genome.ad.jp/). Файл выверки доступен по адресу http://kidb.bioc.cwru.edu/rothlab/jalview/viewJalView.html и м.б. просмотрен с помощью соотв. интерфейса, использующего JalView applet сайта. Информация по G-protein-coupling в постере происходит из обзора Wong (Wong, 2003).
Группировка рецепторов на этом Рис. сходна, но не идентична той, что у Fredriksson et al. (2003). Напр., Fredriksson's α, β, γ и δ группы, которые выглядят `monophyletic' в их древе, не являются monophyletic в нашем; это скорее всего обусловлено легкими отличиями используемых опций и относительной неточностью локализации корней веточек в обоих древах. Интересно, что орфановые рецепторы GPR57 и GPR58 сгруппированы с trace amine receptors, a сравнение их последовательностей показало, что орфаны, по-видимому, представляют собой эквивалент типа 2 trace amine receptors у грызунов. Т.о. древо этого типа м. служить подспорьем в процессе `de-orphanizing' рецепторов.
How do GPCRs work?
Первой ступенью сигнальной трансдукции является связывание лиганда. Природа GPCR ligand-связывающих сайтов изучена лучше всего в результате коминировнного сайт-направленного мутагенеза, молекулярного моделирования рецептроров и скрининга большого числа потенциальных лигандов. Наша группа курирует самую большую доступную всем базу данных сродства лигандов в качестве составной части Psychoactive Drug Screening Program (http://pdsp.cwru.edu/), тогда как наиболее исчерпывающая база данных эффектов мутаций в GPCRs на связывание лигнадов находится по адресу http://wwwgrap.fagmed.uit.no/. Связывание агониста сопровождается изменением конформации рецептора, это м.б. связано с разрывом строгих ионных взаимодействий между третьей и шестой трансмемранной спиралью (Ballesteros et al., 2001; Shapiro et al., 2002), это облегчает активацию G-protein гетеротримера. В зависимости от типа G белка, с которым связан рецептор, м.б. активированы разноообразные нижестоящие сигнальные пути (Marinissen and Gutkind, 2001; Neves et al., 2002). Передача сигналов затем ослабляыется (десенсибилизация) за счёт интернализации GPCR, которая облагчается связыванием arrestin (Ferguson, 2001). Передача сигналов, десенсибилизация и, наконец, resensitization регулируются сложными взаимодействиями различных внутриклеточных доменов GPCRs с многочисленными внутриклеточными белками (Hall and Lefkowitz, 2003; Bockaert et al., 2003).
Хотя многие исследования использовали β-adrenergic рецепторы в качестве прототипа GPCRs, становится всё яснее, что чем больше будет изучено др. рецепторов, тем яснее станет общая картина. Наши исследования серотонинового 5-HT2A рецептора, напр., показали, что интернализация и десенсибилизация GPCR м. происходить независимо от arrestin (Bhatnagar et al., 2001; Gray et al., 2003), сходные находки описаны и для др. GPCRs (Lee et al., 1998). Взаимодействия GPCRs с др. белками, включая цитоскелетные компоненты, такие как PSD-95 (Hall and Lefkowitz, 2002; Xia et al., 2003), важны для регуляции активности, таргетинга и достави GPCRs.
GPCRs are attractive targets for magic bullets
Хотя биологически GPCRs безусловно интригующи, их безусловная важность подчёркивается тем фактом, что, по крайней мере, треть (Robas et al., 2003) , а вообще-то более половниы (Flower, 1999) современных рыночных лекарств, нацелено на GPCRs, хотя только 10% GPCRs известны в качестве мишеней для лекарств (Vassilatis et al., 2003). Как тольк быдут выявлены новые функции GPCRs, особенно для orphan GPCRs, функция которых пока неизвестна, то количество лекарств, нацеленных на GPCRs м. только увелиситься.
Помимо биологических исследований, упомянутых выше, большая роль принадлежит продолжающейся de-orphanization рецепторов GPCRs и последующему выяснению их фрмакологии и физиологии.
Довольно большая панель GPCRs была получена и исчерпывающе охаактеризована, а дальнейший системный анализ `receptorome' (части протеома, кодирующего рецепторы) приведет к важным открытиям. Мы использовали такой подход для выяснения молекулярных механизмов, отвественных за серьёзные побочные эффекты лекарств – напр., phen/fen-индуцированные сердечные заболевания (Rothman et al., 2000) и избыток веса, ассоциированный с использованием атипичных antipsychotics (Kroeze et al., 2003). Кроме того, скрининг receptorome был использован для выяснения действия натуральных соединенйи и установления молекулярных мишеней для разработки лекарств (напр., Roth et al., 2002)