Посещений:
Мультимерные белки

Na;K-ATPase и G белки

Functional Genomic Dissection of Multimeric Protein Families in Zebrafish
K.C.Cheng (kcheng@psu.edu), R.Levenson, J.D. Robishow
Dev.Dyn. V.228, No 3, P. 555-567, 2003
Zebrafish Na,K-ATPase Genes


Из EST и геномных баз данных для рыб данио (http://www.genetics.wustl.edu/fish lab/frank/cgi-bin/fish/ и http://www.sanger.ac.uk/Projects/D rerio/) была идентифицирована кагорта генов, кодирующих α и β субъединицы. Последовательности клонов полной длины указывают на то, что рыбки данио сожержат 9 отдельных Na,K-ATPase α и 6 β субъединиц генов. Из 9 α субъединиц 6 являются ортологами α1, α2 генов субъединиц млекоптающих и двух α3 субъединиц. Нет у рыб ортолога гену субъединицы α4 млекопитающих. Из 6 β субъединиц два являются ортологами β1 млекопитающих, два ортолагами β2 и два ортологами β3.
Из-за дополнительного раунда геномного удвоения генома рыбок данио каждому гену субъединиц α и β у млекопитающих д. сответствовать два ортолога у рабок данио. Однако найден только один ортолог для α2 субъединице крыс, возможно он был потерян в ходе эволюции. 6 генов α субъединиц рыбок являются ортологами α1 субъединицы млекопитающих, т.е. происходили дополнительные удвоения (тандемные удвоения в LG1). Возможно, что некоторые из этих удвоенных генов выполняют функции, отсутствующие у плекопитающих.
Все 15 генов Na,K-ATPase у рыбок данио экспрессируются во время эмбриогенеза. Два гена для α субъединиц обнаруживают некоторый пространственный паттерн распределения, а каждая β субъединица обнаруживает уникальный паттерн экспрессии. Экспрессия спустя 36 ч. после оплодотворения представлена в Табл.3. По крайней мере, 14 из 54 возможных комбинаций α/β субъединиц продуцируются у эмбрионов рыбок. Напр., β субъединицы строго экспрессируются в пронефрических протоках. Ассоциация β1α касается каждой их 4 α субъединиц, экспрессируемых в этой ткани.

Analysis of Na,K-ATPase Gene Function


мРНК с разных Na,K-Atpase генов анализировали в отношении её способности восстанавливать morphant фенотип. Способность мРНК одного гена восстанавливать morpant нокдаун др. гена д. указывать на перекрывание функций. В этом контексте необходимо отметить, что гены субъединиц α и β Na,K-ATPase обнаруживают отдельные паттерны экспрессии. У мышей α1 и α2 субъединицы экспрессируются в сердце, нулевые мутантны по любому из них вызывают эмбриональную гибель.
Morpholino нокдаун подход использован для выяснения функции β субъединиц. Na,K-ATPase β субъединицы относятся к классу II-типа мембранных белков, содержащих одтн трансмембранный сегмент и внеклеточный N-терминалный домен. Установлено, что β субъединицы являются ваэжным компонентом Na,K-ATPase, она абсолютно необходима для активности Na,K-ATPase. Но β субъединицы, по-видимому, не участвуют ни в каталитическом цикле Na,K-ATPase, ни в ouabain чувствительности. Предполагается важная роль β субъединиц в упаковке и поставке в мембрану энзима. Возможно, что β субъединицы м. модулировать активность энзима. Субъединица α Na,K-ATPase грызунов обеспечивает selectable фенотип, outbain резистентности. Напротив β субъединица не отвечает за selectable фенотип.
Во время эмбриогенеза рыбок данио транскрипты β1α активно экспрессируются в пронефрических протоках, отических пузырьках, хрусталике и сердце. Оба морфолина практически давали один и тот же morphant фенотип и каждый действовал дозово-зависимым способом. Наиболее заметный эффект β1α morpolino сказывался на функции сердца, который проявлялся у 100% эмбрионов. Наблюдаемые дефекты сходны с таковыми у мутантов pipe heart и tango. Эксперименты по восстановлению morphant ведутся.
Важно понять, как уменьшение уровней экспрессии β1α Na,K-ATPase приводит к кардиальным дефектам. Один из подходов выяснение электрической активности в мутантном сердце. Важно также определить какие морфологические нарушения возникают в миокардиальных клетках. И важно выяснить вклад α1 и α2 в гетеродимеры β1α в сердце.
Предварительные эксперименты выявили неожиданную роль генов насосов натрия в развитии уха.

HETEROTRIMERIC G PROTEIN SIGNALING


Гетеротримерны G белки являются ассоциироваными с мембраной белками, необходимыми для перадчи сигналов рецепторами во всех клетках эукариот. Члены семейства G белков функционируют в виде гетеротримеров, состоящих из α, β и γ субъединиц. Несмотря на большое количество работ остается несовсем ясно, как субъединиц G белков собираются, чтобы конролировать специфичность нескольких сотен путей передачи сигналов через рецепторы. Уже идентифицировано 16 α, 5 β и 12 γ субтипов, которые в принцыпе м. дать 960 разных гетеротримерных комбинации. Т.к. индивидуальные субъединицы структурно различны и экспрессируются дифференциально, то м. предсказать, что специфические изоформы G белков играют специализированные роли в определенных рецептор-сигнальынх путях.
Попытки очистить индивидуальные субъединицы α, β и γ G белков оказались безуспешными. Это связано с прирожденной тенденцией к диссоциации субъединиц G белка и разрушению физической организации сигнальной системы интактных клеток. Подход с трансфекцией и реконституцией дал однако важную структурно-функциональную информацию, включая идентификацию областай α, β и γ субъединиц, важных для взаимодействия с определенными рецепторами и эффекторами. К сожалению, сравнеие биохимических свойств различных комбинаций α, β и γ субъединиц в G белках не выявило судественных функциональных отличий. Это м. отражать высокую гомологию сради различных членов семейств α, β и γ субъединиц, что позволяет им легко замещать др. др., когда они оказываются вместе или отсутствуют некие факторы, оперирующие в клеточно-специфическом контексте. Независимо от биохимических подходов неясно участие опеределнных комбинация α, β и γ субъединиц в конкретных сигнальных путях в контексте организма.
Генетические подходы к проблеме комбинаций субъединиц имеют существенный потенциал. Если бы м.б. уменьшить экспрессию индивидуальной субъединицы в рганизме, то ассоциированный с этим фенотип строго подтвердил бы её функцию. Генный таргетинг у мышей начал выявлять функциональные отличия среди α, и γ субъединиц G белков. Однако большие размеры этих семейств генов и большое количество возможных комбинаций ограничивают надежды. По этой причине использование антисмыслових морфолино для ингибирования специфических генов субъединиц G белков у рабыок данио открывает уникальную возможность скрининга интересующих фенотипов с потерей функции у нокаутных мышей.

Diversity of G Protein α, β и γ Subtypes


Геномы человека и мыши содержат 16 α, 5 β и 12 γ генов субъеджиниц. В геноме рыбок данио выявлено 12 α, 5 β и 10 γ генов субъединиц которые в большинства случаев являются четкими гомологами генов млекопитающих. Геномы дрожжей, грибов и нематод не обнаруживают подобного разнообразия. Так, геном S.cerevisiae и Dictyoctelium содержат только по одному гену для β и γ субъединицы.

Differencial Expression of G Protein Subunit Isoforms


Изучение паттернов экспрессии α, β и γ субъединиц G белков является необходимым условием для понимания, какие комбинации субъединиц явля.тся оперативными в контексте организма.
Рыбки данио имеют опредленные преимущества в этом отношении. М.б. использована in situ гибиридизация в целом для выявления временного и пространственного паттернов экспрессии генов. Более того, т.к. эмбрионы прозрачны, то любые изменения в экспресси генов м.б. скоррелированы со специфическими онтогенетическими процесами. В лаб. установлено, что α, β и γ субъединицы G белка обладают отличными паттернами генной экспрессии во время эмбриогенеза, это м.б. использовано для заключения о потенциальных ассоциациях и функциях. Напр., мы идентифицировали новую γ субъединиц у G белка, обозначенную γ15. Спустя 24 ч после оплодотворения γ15 субъединица экспрессируется в очень ограниченной области диэнцефалона которая даёт шишковидную железу (epiphysis). Мы идентифицировали также специфическую β субъединицу, чей паттерн экспрессии перекрывается с экспрессиие γ15 субъединицы в этой ткани. Всё это указывает на на механизм, в котором регулируемая экспрессия м.б. использована для продукции новых тримеров G белка из α, β и γ субъединиц, которые м. играть специализированную роль в шишковидной железе. Путем последующего анализа промоторной области и поиска потенциальных энхансеров, м.б. возможна идентификация и тестирование этих регуляторных свойств, ответственных за скоординированную экспрессию у трансгенных рыб. Последующий анализ их фенотипа потери функции возможно сможет напрямую связать этот новый G белковый тример с определенной функцией и сигнальным путём.

Functional Heterogeneity of G Protein Isophorms


Хотя комбинационные ассоциации предсказывают существование нескольких сотен G белковых α, β и γ тримеров, однако их специфические роли в путях передачи сигналов с определенных рецепторов трудно установить с помощью трансфекции и реконституции. Недавно был использован подход генного таргетинга для получения первых весомых доказательств, что рецепторы распознают G белковые тримеры на основании их α, β и γ субъединичного состава в организме. Несмотря на экспрессию большого разнобразия γ субтипов в головном мозге мы показали, что генетическое разрушение субтипа γ7 ставит под вопрос сборку G белкового тримера, который необходим для передачи сигналов с помощью D1 dopamine рецепторов. Этот результат подчеркивает огромную неэффективность в этой области. В огромном большинстве случаев неизвестно какие рецепторы какими активируются G белковыми α, β и γ тримерами в контексте организма, неизвестно и как кодируется специфичность их взаимодействия.
Имеется мало информации о роли G белковых α, β и γ субъединиц во время развития позвоночных. Тем не менее в соответствии с их множественностью и разнообразием морфолино-"накдаун" α иди γ субтипов сможет дать более дискретные фенотипы, тогда как нокдаун β субтипов будет дваать более генерализованные фенотипы. Более того определенные субнаборы α, β и γ субъединиц смогут давать перекрывающиеся фенотипы, предоставляя столь необходимую информацию об их функциональных ассоциациях и роли в определенных путях передачи сигнадов через рецепторы.

Developmental Functions of G Proteins


Хотя G белки экстенсивно используются для регуляции развития у низших эукариот, их значение для высших эукариот выяснить очень трудно. Это связано с трудностями изучения раннего эмбриогенеза у большинства модельрных позвоночных. Нокаут генов многих G белковых α субтипов подчеркивает их важность для эмбриогенеза, а сходные исследования ведтся сейчас в отношении β и γ субъединиц. Несмотря на это мышинные модели неудобны для анализа подобного типа. Рыбки данио имеют короткое время генерации. Они дают большие clutches сихронизированных эмбрионов, которые облегчают генетические манипуляции, а прозрачность эмбрионов делает возможным визуальный скрининг аномалий развития. Намечается прорыв в изучении роли α, β и γ субъединиц в передаче сигналов черех edg 5 и cxcr4 рецепторы у рыбок данио.
Всё больше доказательств, что G белки служат в качестве точки конвергенции для множественных сигналов, происходящих от разных типов сигнальных путей. Имеются некоторые доказательства того, что неклассические рецепторы с 7 трансмембранными доменами, такие как smoothenend и акшяядув, также м. нуждаться в G белках для некоторых из своих действий во время развития. Напр., у рыбок дланио возможно участие G белкового αi субтипа в вентральной спецификации переднего мозга и сомитогенеза путем воздействия на передачу сигналов hedgehog; а у Xenopes αi субтип м. участвовать в обеспечиваемой smoothened агрегации пигмента в меланофорах. Недавно было показано, что химеры по frizzled рецепторам содержат лиганд связывающие домены β-адренэргического рецептора, способные индуцировать формирование примитивной энтодермы в культурах клеток мыши в ответ на isoproterenol; этот эффект блокируется pertussis токсином что указывает на участи G белков. Все эти данные указывают на то, что, по крайней мере, некоторые FRZ рецепторы bona fide с G белком купированные рецепторы, которые взаимодействуют непосредственно с G белками, чтобы обеспечить свои эффекты.
Широта биологических процессов, регулируемых G белками удивительна. Вырисовывающаяся картина указывает на то, что α, β и γ субъединичный состав G белков м. обеспечивать механизм распространения на столь широкий круг реакций. Итак, G белки получают, интегрируют и осуществляют процессинг многообразных сигналов, необходимых для развития организма.
Сайт создан в системе uCoz