HNOB and HNOBA domain proteins

Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins
Lakshminarayan M Iyer, Vivek Anantharaman and L Aravind
BMC Genomics 2003 4:5

http://www.biomedcentral.com/1471-2164/4/5

Soluble guanylyl cyclases (SGCs) are dimeric enzymes that transduce signals downstream of nitric oxide (NO) in animals. They sense NO by means of a heme moiety that is bound to their N-terminal extensions.
Using sequence profile searches we show that the N-terminal extensions of the SGCs contain two globular domains. The first of these, the HNOB (Heme NO Binding) domain, is a predominantly О±-helical domain and binds heme via a covalent linkage to histidine. Versions lacking this conserved histidine and are likely to interact with heme non-covalently. We detected HNOB domains in several bacterial lineages, where they occur fused to methyl accepting domains of chemotaxis receptors or as standalone proteins. The standalone forms are encoded by predicted operons that also contain genes for two component signaling systems and GGDEF-type nucleotide cyclases. The second domain, the HNOB associated (HNOBA) domain occurs between the HNOB and the cyclase domains in the animal SGCs. The HNOBA domain is also detected in bacteria and is always encoded by a gene, which occurs in the neighborhood of a gene for a HNOB domain.
The HNOB domain is predicted to function as a heme-dependent sensor for gaseous ligands, and transduce diverse downstream signals, in both bacteria and animals. The HNOBA domain functionally interacts with the HNOB domain, and possibly binds a ligand, either in cooperation, or independently of the latter domain. Phyletic profiles and phylogenetic analysis suggest that the HNOB and HNOBA domains were acquired by the animal lineage via lateral transfer from a bacterial source.


(Рис.1.)  |  Multiple Sequence Alignment of the HNOB domain


(Рис.2.)  |  Multiple alignment of the HNOBA domain


(Рис.3.)  |  Phylogenetic tree, domain architectures and gene neighborhoods of proteins containing HNOB domains

Разнообразные средовые малые молекулы, а именно, пищевые вещества, ксенобиотики и первичные мессенджеры распознаются клетками с помощью специализированных белковых сенсоров на их поверхности. Дополнительно клетки также используют связанные белками малые молекулы, такие как FAD, cinnamic acid, tetrapyrroles и heme в качестве сенсоров фотонов и окружающего окислительно-восстановительного состояния. Внутри клеток малые молекулы, такие как циклические нуклеотиды, используются как внутриклеточные мессенджеры для передачи сигналов, возникающих от различных стимулов. Существенным компонентом взаимодействий малых молекул с белками является относительно небольшой набор с давних пор законсервированных белковых доменов, которые связываются со своими лигандами, используя специализированные карманы. Определенные белковые складки характеризуют несколько больших сверхсемейств лиганд-связывающих доменов. Это и PAS-подобные складки, которые являются поддержкой PAS, GAF и возможно CACHE сверхсемейства и ACT-подобные складки, которые обнаруживаются в ACT, ferredoxin и родственных лиганд-связывающих доменах.
Типично, что эти small molecule-binding domains (SMBDs) комбинируются внутри одних и тех же полипептидов с рядом законсервированных доменов, которые непосредственно участвуют в сигнальной трансдукции. Сюда входят энзиматические домены, такие как nucleotide cyclases, histidine и serine/threonine kinases, cNMP phosphodiesterases, receiver (получатели) domains и несколько разного типа АТФаз. Не-каталитические домены, подобные ДНК- или РНК-связывающим модулям (напр., helix-turn-helix домены), methyl-воспринимающие домены и FHA домены, которые связывают фосфорилированные пептиды, также часто слиты с SMBDs.
Soluble guanylyl cyclases является важной сигнальной молекулой, которая трансдуцирует сигналы, опосредуемые газообразным первичным мессенджером, nitric oxide. У животных NO функционирует в качестве нейротрансмиттера в ЦНС и ПНС. NO высвобождается клетками благодаря действию nitric oxide synthase (NOS) из своего субстрата аминокислоты аргинина. NO диффундирует через соседние клетки и осуществляет свою функцию путем активирования soluble guanylyl cyclase (SGC), которая синтезирует цГМФ, используя ГТФ в качестве субстрата. SGCs у животных - это димерный энзим, состоящий из двух гомологичных субъединиц, О± и ОІ. Сходство последовательностей у этих субъединиц распространяется на всю их длину, они содержат длинные расширения N-терминальнее cNMP генерирующего каталитического домена. N-терминальная область ОІ субъединицы формирует ковалентную связь с гемом посредством гистидина (H105 в SGC1 ОІ человека). Благодаря porphyrin он идентичен тому, что обнаруживается в гемоглобине, но он связывает только NO и окись углерода, но не кислород, даже если O2 присутствует в значительно более высокой концентрации в клетке. Эта лиганд-специфичность NO связывающего домена SGCs у животных очень сходна с таковой бактериального cytochrome c', который, по-видимому, связывает также только NO и CO. N-терминальная область О± субъединицы связывается с определенными синтетическими pyrazolopyridine лигандми, которые действуют как мощные NO-независимые агонисты циклазной активности.
Установлено, что гем-связывающий домен SGCs у животных характеризует новое семейство лиганд-связывающих доменов, которые широко распространены у бактерий. SGCs содержат также второй глобулярный домен, расположенный между гем-связывающим и циклазным доменом. Показано, что этот домен присутствует также и у бактерий и что эти два домена скорее всего функционируют вместе и у эукариот и бактерий, активируя разнаобразные наборы нижестоящих сигналов.

Results and Discussion


Identification of the HNOB and HNOBA domains


Считается, что и О± и ОІ субъединицы SGCs являются гомологичными по всей длине, но только ОІ субъединица содержит критические гем-связывающие остатки. Т.к. N-терминальное расширение SGC субъединиц не обнаруживает сходства с ранее охарактеризованными доменами, поэтому провели его сиквенс-анализ. Длина и способ консервации N-терминального домена указывает на то, что N-терминальное расширение SGCs скорее всего представлено двумя глобулярными доменами. Это подтверждается также и анализом сложности последовательностей полипептидов с помощью программы SEG.
PSI-BLAST поиск начат с законсервированного N-терминального расширения SGC (human SGC1ОІ, gi: 4504215, region 1–360), используя порог включения .01. И N- и C-терминальные части этого включения содержат несколько отдельных hits с разными бактериальными белками, это подтверждает наличие двух отдельных глобулярных доменов. Поиск в N-терминальной части расширения выявил дистоверные hits с бактериальными белкам длиной в 180–195 остатков внутри первых трех iterations (напр. Mdge1313 из Microbulbifer degradans выявлены с ожидаемыми значениями (e) в 10-4 в первой iteration). Эта область сходства соответствует всей длине этих бактериальных белков и включает гем-связывающий гистидин SGC ОІ субъединицы и является скорее всего отдельным глобулярным доменом. Сonvergence поиск выявил помимо soluble guanylyl cyclases животных, несколько бактериальных белков, включая некоторые methyl-accepting chemotaxis рецепторы бактерий, таких как Desulfovibrio и Clostridium. Transitive поиск начатый с малыми бактериальными белками, которые полностью соответствуют N-терминальной большей части домена SGCs также выявил некий набор белков с e <.01. Это указывает на то, что N-terminal-most домен SGCs эволюционно мобилен: он появляется в некоторых определенных контекстах с др. доменами в одних и тех же полипептидах или stand-alone форме.
PSI-BLAST поиск с C-терминальной частью SGC-специфического расширения (областью между N-terminal-mostдоменом и C-терминальным cyclase доменом; human SGC1ОІ, region: 200–370) выявил гомологичные регионы во всех др. soluble guanylyl cyclases животных и дополнительно N-терминальные области в histidine kinases из Nostoc и Anabaena видов (eg. gi: 17229771, e = 10-4 in iteration 1) и из diguanylate cyclase из Rhodobacter sphaeroides (gi: 22958462 e = 10-3 in iteration 3). Региональное сходство между этими бактериальными белками и SGCs у животных соответствуют более или менее всей средней области, которая находится между двумя др. глобулярными доменами. Реципрокные поиски с соотв. регионами histidine kinases цианобактерий и животными SGCs подтвердили эволюционные взаимоотношения между этими областями. Все это указывает на то, что средняя область животных SGCs соответствует второму эволюционно мобильному глобулярному домену, который обладает сходством с некоторыми определенными бактериальными белками.
Анализировали N-terminal-most домен SGCs и его гомологи у бактерий с помощью T_coffee программы и ручной коррекции на базе PSI-BLAST HSPs (Рис.1). Мultiple aligment показал, что гем-связывающий гистидин SGC-ОІ субъединиц находится внутри этого домена. Этот домен был назван HNOB (Heme-Nitric Oxide Binding) домен. Предполагается, что гистидин расположен рядом с N-концом О±-спирали и законсервирован во всем этом сверхсемействе, за исключением О±-субъединицы SGCs (Рис. 1) и двух бактериальных версий из Rhodobacter sphaeroides и Magnetococcus видов. Считается, что SGC О±-субъединицы лишены гистидина, области соответствующей домену HNOB, в SGC1О± человека являются важными для фунгкционального связывания гена димерным энзимом. Следовательно, помимо ковалентного связывания гена, домены HNOB также м. взаимодействовать с ним нековалентно. N-терминальная часть домена содержит униварсально законсервированный остаток, который м. играть критическую роль в создании локальных условий для избирательности NO. Остальные из законсервированных последовательностей картируются в основном в сердцевине элементов вторичной структуры и некоторых хорошо законсервированных перегибов (Рис.1). Предполагаемая вторичная структура указывает на то, что HNOB домен скорее всего адаптирует преимущественно О±-спиральную складку с немногими разбросанными extended элементами. Предполагаемая трансмембранная топология HNOB доменовых белков указывает на внутриклеточное расположение для всех проявлений этого домена. Однако, ни прямые сравнения, ни sequence-structure threading не выявляют какой-либо взаимосвязи с двумя др. хорошо охарактеризованными О±-спиральными гем-связывающими доменами, а именно, globin и cytochrome C. Очевидно, что HNOB домен принимает структуру, отличную от этих доменов.
Т.к. средний домен SGCs всегда ассоциирован с HNOB доменами, поэтому он был назван HNOBA (HNOBAssociated) домен. Показано, что в отличие от HNOB домена, он скорее всего адаптирует О± + ОІ форму складки с сегрегированными О± и ОІ доменами (Рис. 2). Его суть составляют 5 законсервированные нити и на самом С-конце длинная спираль, которая скорее всего образует форму суперскрученного (coiled-coil) линкерного региона, участвующего в димеризации (Рис. 2). В стержне первые две нити, по-видимоу, образуют ОІ-шпильку со спиральной областью, которая в свою очередь сопровождается 3 последовательными нитями и одиночной О±-спиралью. Сходный паттерн вторичных структур обнаруживается и в некоторых др. лиганд-связывающих доменах, таких как PAS, GAF, profilin и возможно даже CACHE домены. Sequence-structure threading с помощью 3DPSSM метода анализировали PAS домен (Photoactive yellow protein PDB: 1drm) с (.5, 50–70% probability of correct fold prediction). Это подтвердило, что HNOBA домен д. потенциально содержать PAS-подобную складку.
Все версии HNOBA домена, за исключением одно от Rhodobacter sphaeroides, содержат законсервированный гистидин между стержневой областью и длинной С-терминальной О±-спиралью, которая связывает его с киназным или циклазным доменом (Рис. 2). Однако, не получено доказательств для второго ковалентного гем-связывающего сайта, это говорит о том, что данный гистидин выполняет др. функцию. Предполагается, что соотв. участок SGC1 О±-субъединицы человека участвует во взаимодействии с этим лигандом. Считается, что действиительное cross-linking происходит с цистеиновым остатком, расположенным непосредственно N-терминальнее домена HNOBA, возможно, что остальная часть домена участвует в контакте с лигандом. Возможно, что HNOBA домен связывает некоторый, пока неизвестный, эндогенный лиганд. В этом случае он д. участовать с аллостерической регуляции SGCs, подобно GAF доменам в cyclic nucleotide phosphodiesterases.

Evolutionary history, domain architectures, and gene neighborhoods of the HNOB and HNOBA domain proteins


Домен HNOB обнаружен в разных бактериальных ветвях, таких как cyanobacteria, proteobacteria и low GC Gram-позитивных бактерий bacteria. Он полностью отсутствует у всех archaeal proteomes, a среди эукариот обнаруживается только в ветви животных. У бактерий, HNOB доменовые белки имеют две принципиальные архитектуры. Они м. обнаруживаться у одиночных белков, целиком состоящих из HNOB домена, в некоторых ветвях бактерий (Рис. 3). У low GC Gram-positive бактерий и Desulfovibrio desulfuricans они появляются в комбинации с methyl accepting chemotaxis рецепторными белками, с или без HAMP доменом. Дополнительно, у Magnetococcus, HNOB домен слит на своем С-конце с неохарактеризованным глобулярным доменом (Рис. 3). У животных HNOB домен всегда появляется с N-терминальном расширении SGCs. Филетический паттерн HNOB доменов указывает на то, что он наиболее вероятно появился рано в эволюции у животных посредством латерального переноса из бактериального источника. На Рис. 1 сконструировано филетическое древо HNOB доменового сверхсемейства, показывающее, что животная его версия образует строгую монофилетическую группу (Рис. 3). У животных имеется небольшое линейное специфическое расширение в ветви нематод. SGCs с отдельными О± и ОІ субъединицами выявляются впервые у coelomate после их дивергенции от ветви нематод. У бактерий HNOB домены появляются в chemotaxis рецепторах, они образуют монофилетическую группу, тогда как остальные втономные формы являются парафилетическими (Рис. 3). Интересно, что solo versions от Nostoc и Anabaena групп видов строго соответствует SGC, подтверждая происхождение последней формы путем горизонтального переноса из бактериального источника (Rell BP support 80%, 10000 replicates).
Гены, чьи продукты тесно взаимодействуют с любым др. макромолекулярным комплексом или биохимическим путем, часто образуют совместные кластеры в геномах прокариот. Эти ко-функциональные кластеры генов или опероны часто несут контекстуальную информацию, которая м. пролить свет на функцию неохарактеризованных белков. Анализировали гены, соседние HNOB доменовым у бактерий. Гены, кодирующие практически все solo версии HNOB доменов появляются в одном и том же предсказуемом опероне таком как histidine kinase или GGDEF домен (diguanylate cyclase). В некоторых случаях такие опероны кодируют также receiver domain белки из двухкомпонентной системы, PP2C phosphatases или cyclic diguanylate phosphodiesterases (Рис. 3). Интересно, что histidine kinases из двух cyanobacteria и GGDEF доменовый белок из Rhodobacter, которые появляются вместе с solo HNOB доменовыми белками, содержат HNOBA домены на своих крайних N-концах (Рис. 3). Т.о., даже у бактерий HNOBA домен всегда появляется в функциональной ассоциации с HNOB доменом. Очень возможно, что животная ветвь приобрела HNOB и HNOBA домены в виде одного куска. Т.о., HNOB и HNOBA домены напоминают функционально сходные CACHE и CHASE домены, которые также были приобретены некоторыми линиями эукариот посредством латерального переноса от бактерий. Филогенетический анализ guanylyl cyclase доменов животной SGCs показывает, что их ближайшими родственниками являются циклазы от различных бактерий, таких как cyanobacteria, и Leptospira (data not shown). Все это подтверждает бактериальное происхождение этих компонентов nitric oxide сигнального пути. Это согласуется также с присутствием ортологов animal NO synthases у некоторых бактерий.
Совместное появление HNOB и HNOBA доменов указывает на строгую функциональную взаимосвязь между ними. Изучение SGC1 человека показало, что синтетический pyrazolopyridine лиганд связывает сайт, отличный от NO и гема, но нуждающийся в гем-связывающем сайте для своего действия. Это м. указывать на синергичность или кооперацию между этими доменами heme interation и cyclase activation. Большинство бактериальных HNOB доменовых белков ковалентно связывают гем. Те версии, в которых отсутствет гем-связывающий гистидин, м. или нековалентно взаимодействовать с гемом, как в случае SGC О±-субъединиц, или связываться с неким др. неизвестным лигандом. Они скорее всего функционируют как сенсоры диффундирующих газообразных лигандов, которые активируют, по крайней мере три отдельных нижестоящих сигнальных пути: а именно, перенос фосфора через двухкомпонентную систему, methyl эфир-зависимая хемотактическая реакция и передача сигналов cyclic nucleotide через diguanylate cyclases/phosphodiesterases.

Conclusions


Using sequence profile searches we identify two conserved domains in the N-terminal extensions of the soluble guanylyl cyclases from animals. One of these, the HNOB domain, contains the heme-binding site of the SGCs and defines a family of small-molecule binding domains exclusively occurring in animals and bacteria. In bacteria the HNOB domain occurs either as a standalone version or fused to the HAMP and methyl accepting domains of chemotaxis receptors. The bacterial solo versions co-occur in predicted operons encoding genes for two component systems and diguanylate cyclases or phosphodiesterases, and are likely to transmit signals to these downstream molecules. The second conserved domain of SGCs, the HNOBA domain is always associated with the HNOB domain either in the same polypeptide or in polypeptide encoded by neighboring genes in an operon. It is predicted to adopt an О± + ОІ fold that is possibly related to the PAS-like fold. The HNOB and HNOBA domains are likely to function synergistically or cooperatively. The latter may either cooperate in binding heme or might bind distinct ligands.

The phyletic pattern of these domains, and phylogenetic analysis of the HNOB domain suggest that the animal versions were probably acquired through lateral transfer from a bacterial source. Identification of the HNOB and HNOBA domains could help in further investigations of the SGCs that are critical components of the nitric oxide signaling pathway in animals. Furthermore, investigating their role in bacteria, such as Vibrio cholerae, could be important in understanding the sensory mechanisms of human pathogens.


Сайт создан в системе uCoz