Участие в Нейральном Развитии

Roles of Hes genes in neural development R.Kageyama, T. Ohtsuka, T.Kobayashi Develop.Growth Diff. (2008) V.50, S97-S103
Гены Hes являются bHLH транскрипционными репрессорами. Hes1, Hes3 и Hes5 экспрессируются на высоком уровне в нейральных стволовых клетках. Инактивация этих Hes генов ведет к позитивной регуляции пронейральных генов, ускорению нейрогенеза и преждевременному истощанию нейральных стволовых клеток. Напротив, избыточная экспрессия Hes генов ведет к ингибированию нейрогенеза и поддержанию нейральных стволовых клеток. На поздних стадиях развития гены Hes способствуют глиогенезу. Более того, Hes гены регулируюют поддержание границ, которые подразделеяют нервную систему на множество компартментов и делают возможным приобретение соседними компартментами региональных характеристик за счет секреции морфогенов. Разные характеристики между пограничными клетками и компартментами из нейральных стволовых клеток регулируются разными способами экспрессии Hes1. Рис.1. \| The role of basic helix-loop-helix (bHLH) genes in neural development. Initially, neuroepithelial cells proliferate extensively by symmetric cell division. These cells are maintained by the repressor-type bHLH genes Hes1 and Hes3. As development proceeds, neuroepithelial cells gradually change to radial glial cells, which give rise to neurons by asymmetric cell division. Hes1 and Hes5 regulate maintenance of radial glial cells, whereas proneural genes (activator-type bHLH genes) such as Mash1, Ngn2 and Math1 promote neurogenesis. Hes6 helps proneural gene activities by antagonizing Hes1. After production of neurons, radial glial cells finally differentiate into astrocytes. This process is promoted by Hes1 and Hes5. Thus, major processes of neural development are controlled by bHLH genes. Рис.2. \| Structure and function of Hes factors. (A) Hes factors have a conserved basic helix-loop-helix (bHLH) domain in the N-terminal region and a WRPW domain at the C-terminus. Hes1 forms a dimer and binds to the DNA through the bHLH domain and recruits co-repressors through the WRPW domain. (B) Hes1 forms a homodimer, binds to the target sequences (the N box and the C site) and represses transcription by recruiting the co-repressor Groucho homologue (active repression). Hes1 also forms heterodimers with activator-type bHLH factors such as E47, but these heterodimers cannot bind to the DNA, resulting in inhibition of the activity of activator-type bHLH factors (passive repression). Рис.3. \| Oscillatory expression of Hes1 regulated by negative feedback. Hes1 represses its own expression by directly binding to its own promoter. This repression leads to disappearance of both Hes1 mRNA and Hes1 protein, because they are extremely unstable, allowing the next round of expression. In this way, Hes1 autonomously starts oscillatory expression with a periodicity of about 2 h and regulates the timing of cellular events. Рис.4 \| Notch signaling. Upon activation of Notch by its ligands such as Delta, the intracellular domain (ICD) is released from the membrane region and transferred into the nucleus, where the ICD forms a complex with the DNA-binding protein RBP-J. Without ICD, RBP-J represses Hes1 and Hes5 expression by binding to their promoters. However, the complex of RBP-J and the ICD acts as a transcriptional activator. Thus, activation of Notch signaling leads to induction of Hes1 and Hes5 expression. Hes1 and Hes5 function as essential effectors of Notch signaling. Рис.5. \| Different Hes1 expression mode regulates compartment versus boundary cell characteristics. (A) The developing mouse central nervous system is partitioned into many compartments by boundaries. The isthmus is the boundary between the midbrain and the hindbrain and regulates the specification of these brain regions by secreting Fgf8. Boundary cells usually proliferate slowly and do not differentiate into neurons, whereas compartment cells proliferate and differentiate efficiently. (B) Differential Hes1 expression between (a) compartments and (b) boundaries. In compartment cells, Hes1 expression is variable, but is persistent and high in boundary cells. Forced expression of Hes1 in a sustained manner in compartment cells leads to inhibition of both cell proliferation and differentiation, two important features of boundary cells. Thus, different Hes1 expression mode is responsible for different characteristics between compartment and boundary cells. Рис.6. \| Regulation of Hes1 oscillation by pStat3-Socs3 oscillations. Jak2 activates Stat3 by phosphorylation, and phosphorylated Stat3 (pStat3) is transferred from the cytoplasm to the nucleus where it upregulates expression of target genes such as Socs3. Socs3 antagonizes Jak2-dependent activation of Stat3, thereby forming the Jak2-Stat3-Socs3 negative feedback. By this negative feedback, the levels of pStat3 and Socs3 oscillate with a periodicity of about 2 h. pStat3 leads to instability of Hes1 protein, which is important for oscillatory expression. Hes1 promotes Jak2-dependent activation of Stat3 by physical interaction. Thus, Hes1 oscillation and pStat3-Socs3 oscillations depend on each other.	В развивающейся ЦНС нейроэпителиальные клетки активно пролиферируют за счет симметрических клеточных делений на ранних стадиях развития (Рис.1). По ходу развития нейроэпителиальные клетки постепенно превращаются в радиальные глиальные клетки, тела которых находятся в вентрикулярной зоне, а радиальные отростки достигают поверхности мягкой мозговой оболочки (pial ). Как нейроэпителиальные, так и глиальные клетки являются эмбриональными нейральными стволовыми клетками (Alvarez-Buylla et al. 2001; Fishell & Krigstein 2003; Fujita 2003; Gotz & Huttner 2005). Радиальные глиальные клетки дают множество различного типа нейронов за счет повторяющихся асимметричных делений клеток. Каждое асимметричное деление дает одну новую радиальную глиальную клетку и один нейрон или предшественник нейрона. Нейроны мигрируют вдоль радиальных волокон к наружным слоям, тогда как радиальные глиальные клетки остаются в вентрикулярной зоне (Рис. 1). После продукции нейронов радиальные глиальные клетки окончательно дифференцируются в глиалльные клетки, такие как астроциты (Рис.1). Т.о., в развивающейся нервной системе вследствие трех ступеней происходит последовательно симметричная пролиферация нейральных стволовых клеток, нейрогенез и глиогенез. Во время нейрогенеза региональная спецификация регулируется границами, которые подразделяют развивающуюся нервную систему на множество компартментов. Напр., перешеек является границей между средним мозгом и задним и регулирует спецификацию соседних компартментов за счет секреции Fgf8 (Kiecker & Lumsden 2005). Пограничные клетки обычно пролиферируют медленно и не дают нейронов, хотя они морфологически сходны с нейральными стволовыми клетками в компартментах (Kiecker & Lumsden 2005). Было показано, что гены Hes, репрессорного типа bHLH гены, играют важную роль в развитии как компартментных, так и пограничных клеток в ЦНС (Bertrand et al. 2002; Ross et al. 2003; Kageyama et al., 2007). Интересно, что характер экспрессии Hes1, по-видимому, отличается в двух структурах ( персистирует и на высоком уровне в пограничных клетках и варьирует в нейральных стволовых клетках компартментов). Эти разные типы экспрессии участвуют в разных характеристиках пограничных и компартментных клеток. Hes factors are repressors and oscillators Hes гены являются у млекопитающих гомологами генов hairy и Enhancer of split, которые негативно регулируют нейрогенез противодействуя пронейральным генам, таким как комплекс achaete-scute (Akazawa et al. 1992; Sasai et al. 1992). Известны 7 членов семейства Hes, каждый из которых обладает законсервированным bHLH доменом (Рис. 2). Hes факторы формируют гомодимеры посредством HLH региона и соединяются с N box CACNAG и класса С сайтом CACG(C/A)G посредством базового региона с высоким сродством в отличие от большинства др bHLH факторов, которые соединяются с Е box CANNTG с высоким сродством. Помимо bHLH домена Hes факторы имеют еще один законсервированный домен, WRPW (Trp-Arg-Pro-Trp), на С конце, который действует как домен репрессии, путем рекрутирования корепрессоров, гомологов Groucho (Рис. 2А). Т.о., факторы Hes репрессируют транскрипцию путем соединения с последовательностями ДНК мишени и путем активного рекрутирования корепрессоров (активная репрессия; Рис. 2В). Гены мишени включают Mash1, у млекопитающих гомолог пронейрального комплекса генов achaete-scute дрозофилы, который кодирует bHLH активатор и индуцирует дифференцировку нейронов. Hes1 репрессирует транскрипцию Mash1 за счет соединения с класса С сайтом в промоторе Mash1 (Chen et al. 1997). Hes факторы также формируют гетеродимеры с bHLH активаторами, такими как Mash1 и Е47. Однако эти гетеродимеры не соединяются с ДНК, тем самым ингибируя транскрипционную активность bHLH активаторов (пассивная репрессия; Рис. 2В). Т.о., Hes факторы противодействуют активности пронейральных генов c помощью, по крайней мере, двух механизмов. Др. важной мишенью для Hes1 является сам Hes1. Hes1 репрессирует свою собственную экспрессию путем непосредственного соединения с последовательностями N box в промоторе Hes1 (рис. 3; Takebayashi et al., 1994). Эта негативная обратная связь ведет к исчезновению как мРНК, так и белка Hes1, поскольку они чрезвычайно нестабильны, это делает возможным следующий раунд экспрессии. Таким способом Hes1 автономно вызывает осцилляцию экспрессии с периодичностью примерно в 2 ч (Рис. 3; Hirata et al. 2002; Masamizu et al. 2006; Shimojo et al., 2008). В PSM экспрессия Hes7 также осциллирует за счет негативной петли обратной связи с периодичностью примерно в 2 ч и эта осцилляция регулирует сегментацию сомитов (Bessho et al. 2001, 2003). В отсутствие Hes7 др. осцилляторы, такие как Lunatic fringle и Dusp-4 прекращают осцилляторную экспрессию и сомиты сливаются (Bessho et al. 2001; Niwa et al. 2007). очевидно, что Hes7 регулирует сегментацию сомитов, тогда как Hes1 регулирует временной параметр др. событий в качестве биологических часов, хотя точная роль осцилляций Hes1 не установлена. Maintenance of neural stem cells by Hes genes На стадии нейральной пластинки Hes1 и Hes3 широко экспрессируются нейроэпителиальными клетками вдоль всей нейро-оси, Hes5 на этой стадии не экспрессируется (Рис.1; Hatakeyama et al. 2004). Т.к. нейроэпителиальные клетки постепенно изменяются в радиальные глиальные клетки, то экспрессия Hes3 подавляется и вместо этого экспрессия Hes5 появляется в развивающейся нервной системе (Рис.1; Hatakeyama et al. 2004). На ст. нервной трубки экспрессия Hes3 постепенно ограничивается перешейком, тогда как экспрессия Hes5 расширяется и становится в основном комплементарной экспрессии Hes1, при этом экспрессия Hes1 и Hes5 перекрывает почти все регионы развивающейся нервной системы эмбрионов мышей на ст. Е10.5 (Hirata ett al. 2001; Hatekeyama et al., 2004). Позднее экспрессия Hes1 и Hes5 ограничивается вентрикулярной зоной, которая содержит клеточные тела радиальной глии (Akazawa et al. 1992; Sasai et al. 1992). Избыточная экспрессия Hes генов у эмбрионов мышей ингибирует нейрогенез и поддерживает нейральные стволовые клетки (Ishibashi et al.1994; Ohysuka et al. 2001). Напротив, у Hes1 нокаутных мышей экспрессия пронейральных генов, таких как Mash1, усиливается и нейрогенез ускоряется (Ishibashi et al. 1995). Однако т.к. экспрессия Hes5 усиливается, то дефекты относительно слабые у Hes1 нокаутных мышей. У Hes1.Hes5 двойных нокаутных мышей дефекты более тяжелые, но имеется всё ещё много нейральных стволовых клеток в развивающейся нервной системе, это указывает на то, что Hes3 компенсирует дефекты до некоторой степени (Ohtsuka et al. 1999). Напротив, у Hes1;Hes3;Hes5 тройных нокаутных мышей хотя нейроэпителиальные клетки и образуются нормально примерно на ст. Е8, они собственно не сохраняются и преждевременно дифференцируются в нейроны на ст. нервной пластинки (Hatakeyama et al. 2004). у таких мутантных мышей действительно все клетки становятся нейронами в развивающемся спинном мозге на Е10, указывая тем самым, что Hes1, Hes3 и Hes5 ответственны за поддержание всех нейральных стволовых клеток в этой области (Hatakeyama et al. 2004). Т.о., гены Hes необходимы для поддержания, но не для инициального образования нейральных стволовых клеток. Какие гены регулируют инициальное образование нейральных стволовых клеток, предстоит определить. В отсутствие Hes генов нейральные стволовые клетки дифференцируются в рано появляющиеся нейроны и оказываются истощенными перед генерацией поздно появляющихся типов клеток. таких как астроциты. Нейральные стволовые клетки не могут быстро изменить свою компетентность, необходимо время, чтобы они стали компетентными генерировать поздно появляющиеся типы клеток. Т.о., Hes гены являются существенными для генерации всего разнообразия типов клеток за счет поддержания нейральных стволовых клеток вплоть до поздних стадий. Hes1 and Hes5 expression regulated be Notch signaling Notch это трансмембранный белок, активируемый c помощью лигандов, таких как Delta (Рис.4). После активации внутриклеточный домен (ICD) высвобождается от мембранной части и переносится в ядро, где ШСВ формирует комплекс с ДНК-связывающим белком RBP-J. Без ICD RBP-J репрессирует экспрессию Hes1 и Hes5 благодаря связыванию с их промоторами. Однако этот комплекс RBP-J и ICD действует как активатор транскрипции. Т.о., активация передачи сигналов Notch ведет к индукции экспрессии Hes1 и Hes5 (Рис. 4; Honjo 1996; Artavanis-Tsakonas et al. 1999). ICD поддерживает нейральные стволовые клетки благодаря ингибированию нейрогенеза (Furukawa et al. 2000; Gaiano et al. 2000). Однако в отсутствие Hes1 и Hes5 ICD неспособен ингибировать нейрогенез, указывая тем самым. что Hes1 и Hes5 являются важными эффекторами передачи сигналов Notch (Рис. 4; Ohtsuka et al. 1999). Хотя передача сигналов Notch регулирует экспрессию Hes1 и Hes3, их инициальная происходит в нейроэпителиальных клетках ещё до экспрессии компонентов сигнального пути Notch, указывая тем самым. что инициация экспрессии Hes1 и Hes3 не зависит от Notch (Hatakeyama et al. 2004). Однако последующая экспрессия Hes5 происходит совместно с экспрессией компонентов передачи сигналов Notch, подтверждая, что инициация экспрессии Hes5 зависит от передачи сигналов Notch. Кроме того, экспрессия Hes1 также позднее перекрывается с экспрессией компонентов сигнального пути Notch, указывая тем самым, что боее поздняя экспрессия Hes1 регулируется с помощью передачи сигналов Notch. Какие из факторов ответственны за инициальную экспрессию Hes1 и Hes3 в нейроэпителиальных клетках ещё предстоит определить. Пронейральные гены, такие как Mash1 и Neurogenin2 (Ngn2), не только активируют программу дифференцировки нейронов, но и также индуцируют экспрессию Delta, активируя тем самым передачу сигналов Notch и ингибируя нейрональную дифференцировку соседних клеток (Castro etal. 2006). Этот процесс наз. "латеральное ингибирование" (Honjo 1996; Artavanis-Tsakonas etal. 1999). Латеральное ингибирование предохраняет все нейральные стволовые клетки от реакции одним и тем же образом, позволяя лишь субнаборам клеток дифференцироваться в нейроны и удерживая остальных оставаться нейральными стволовыми клетками. Эти оставшиеся нейральными стволовыми клетками позднее дифференцируются в разного типа клетки, Т.о., латеральное ингибирование важно для поддержания нейральных стволовых клеток и генерации полного спектра типов клеток. Promotion of gliogenesis by Hes genes Избыточная экспрессия Hes генов в развивающемся головном мозге поддерживает нейральные стволовые клетки на более ранних стадиях, но способствует образованию астроцитов на более поздних стадиях (Fig. 1), указывая тем самым, что гены Hes обладают двойной активностью в зависимости от стадии развития (Ohtsuka etal. 2001). Сходным образом избыточная экспрессия генов Hes в постнатальной сетчатке способствует генерации Muller глии, единственной глии, образуемой в сетчатке (Furukawa etal. 2000; Hojo et al. 2000). Эти фенотипы скходны с таковыми при инактивации пронейральных генов. В отсутствие пронейральных генов, таких как Mash1 и Math3, дифференцировка нейронов ингибируется, а нейральные стволовые клетки сохраняются на более ранних стадиях, тогда как на более поздних стадиях образование астроцитов и Muller глиальных клеток усиливается, указывая тем самым, что пронейральные гены обладают двойной активностью: способствуют дифференцировке нейронов и ингибируют образование астроцитов и Мёллеровской глии (Tomita etal. 2000; Hatakeyama etal. 2001; Nieto etal. 2001). Согласуется с этим мнением и то, что Ngn1 позитивно регулирует специфичную для нейронов экспрессию генов и репрессирует специфичную для астроцитов экспрессию генов путем секвестрирования коактиватора p300/CBP (Sun etal. 2001). Поэтому вполне возможно, что обеспечение образования астроцитов и Мёллеровской глии с помощью генов Hes обучловлено репрессией пронейральных генов. Нейральные стволовые клетки неспособны дифференцироваться в глиальные клетки на ранних стадиях и необходимо время, чтобы эти клетки приобрели глиогенную компетентность. Молекулярные основы, лежащие в основании глиогенной компетентности ещё предстоит определить, Но состояние метилирования промоторных регионов генов, специфичных для астроцитов, может вносить вклад в эту компетентность. На более ранних стадиях промоторные регионы астроцит-специфических генов гиперметилированы и поэтому резистентны к активации генов, тогда как они гипометилированы и готовы к экспрессии на более поздних стадиях (Takizawa etal. 2001). Более того, деметилирующая обработка нейральных стволовых клеток на ранних стадиях ускоряет дифференцировку астроцитов (Takizawa etal. 2001). Эти результаты указывают на то, что статус метилирования промоторных регионов важен для глиогенной компетентности. Др. механизм - это присутствие факторов партнёров, таких как гомеодоменовый фактор Рахб. Напр., Hes1 индуцирует судьбы нейральных стволовых клеток в клетках, экспрессирующих Рахб, но судьбы астроцитов в Рахб-негативных клетках в развивающемся спиннои мозге (Sugimori et al. 2007). Maintenance of boundary cells by Hes genes Развивающаяся ЦНС подразделяется на множественные компартменты с помощью границ, которые функционируют как организующие центры (Fig. 5A). Пограничные клетки обычно пролиферируют медленно и не дают нейронов. Клетки в верхней (roof) пластинке и донной (floor) пластинки нервной трубки обладают сходными свойствами своих пограничных клеток. В этих регионах Hes1 белок постоянно экспрессируется на высоких уровнях (Fig. 5B). Hes3 обычно экспрессируется в перешейке (isthmus), тогда как Hes5 не экспрессируется на границах. Однако эктопическая экспрессия Hes5 происходит в пограничных регионах Hes1 КО мышей. компенсируя их поддержание. Т.о., все три Hes участвуют в пограничных клетках (Hirata et al. 2001; Baek et al. 2006). На границах пронейральные гены не экспрессируются, указывая тем самым сохраняющаяся экспрессия Hes постоянно репрессирует экспрессию пронейральных генов. В согласии с этим мнением то, что у Hes1;Hes3;Hes5 трижды КО мышей пронейральные гены эктопически экспрессируются и на границах происходит нейрогенез. Как результат все границы или не поддерживаются или не образуются и региональная спецификация тяжело нарушается (Hirata etal. 2001; Baek etal. 2006). В противоположность пограничным клеткам нейральные стволовые клетки в компартментах экспрессируют варьирующие уровни Hes1 (Baek etal. 2006). Эта изменчивость может отражать постепенное подавление экспрессии Hes1 в дифференцирующихся клетках (Fig. 5B). Др. возможность заключается в том, что экспрессия Hes1 осциллирует в нейральных стволовых клетках, как в фибробластах (Fig. 5B). Наши недавние данные по real-time imaging (Masamizu et al. 2006) показали. что последнее действительно так (Shimojo etal. 2008). интересно. что уровенть Mash1 высок в клетках, экспрессирующих низкие уровни Hes1 и vice versa, указывая тем самым, что экспрессия Mash1 также осциллирует в противоположной фазе по отношению к Hes1 (Fig. 5B; Baek etal. 2006). Возможно, что нейральные стволовые клетки в компартментах готовы к нейрональной дифференцировке за счет периодически экспрессируемого Mash1, тогда как пограничные клетки резистентны к нейрональной дифференцировке за счет постоянной репрессии пронейральных генов. Чтобы подтвердить этом мнение форсировали экспрессию Hes1 непрерывно в компартментных клетках это вело к ингибированию нейрональной дифференцировки. Более того, эта процедура снижала скорость пролиферации клеток за счет индукции задержки на G1 фазе клеточного цикла (Baek etal. 2006). Т.о., непрерывная экспрессия Hes1 ведет к ингибированию как клеточной пролиферации, так и дифференцировки, двух важных свойств пограничных клеток. Эти результаты подтверждают, что осциллирующий и непрерывный способ экспрессии Hes1 регулируют характеристики компартментных и пограничных клеток, соотв. Regulation of Hes1 oscillation by Stat3-Socs3 oscillations Точный механизм того, как варьирующая/осциллирующая в противовес непрерывно экспрессии Hes1 регулируется в развивающейся нервной системе, неизвестно, но было показано. что Stat3-Socs3 осцилляции важны для осцилляций Hes1 в фибробластах (Yoshiura etal. 2007). Jak2 активирует Stat3 путем фосфорилирования, а фосфорилированный Stat3 (pStat3) переносится из цитоплазмы в ядро и позитивно регулирует экспрессию генов мишеней (Fig. 6). Один из них это Socs3, который противодействует Jak2-зависимой активации Stat3, образуя тем самым Jak2-Stat3-Socs3 негативную петлю обратной связи (Fig. 6; Levy & Darnell 2002; Yu & Jove 2004). С помощью этой негативной петли обратной связи уровни pStat3 и Socs3 осциллируют с периодичностью около 2 ч (Yoshiura et al. 2007). Интересно, что блокада этих осцилляций ингибирует осцилляции Hes1, делая уровень белка Hes1 постоянным (Yoshiura etal. 2007). Т.о., осциллирующая в противовес непрерывной экспрессии Hes1 регулируется с помощью pStat3-Socs3 осцилляций. Механизм, с помощью которого pStat3-Socs3 осцилляции регулируют осцилляции Hes1, предстоит определить, но pStat3 ведет к нестабильности белка Hes1, которая важна для осцилляторной экспрессии (Fig. 6). Ранее было показано, что Hes1 способствует Jak2-зависимой активации Stat3 за счет физического взаимодействия др. с др. в нейральных стволовых клетках (Kamakura et at. 2004). Т.о., возможно, что Hes1 осцилляции и осцилляции pStat3-Socs3 зависят др. от др. в этих клетках (Fig. 6). Conclusions It has been shown that bHLH genes play an essential role in neural development. Particularly, antagonistic regulation between activator-type and repressor-type bHLH genes is important for maintenance of neural stem cells and proper timings of neurogenesis and gliogenesis. Hes genes maintain neural stem cells by antagonizing activator-type bHLH genes until later stages, lead to generation of a full diversity of cell types and thereby regulate the size, the shape and the cytoarchitecture of the nervous system. Furthermore, variable Hesl expression is important for proliferation and differentiation of compartmental neural stem cells, while persistent and high Hesl expression is required for maintenance of slowly proliferating and non-neurogenic boundary cells. It is likely that this variable versus persistent Hesl expression is controlled by pStat3-Socs3 oscillations, although the exact mechanism remains to be analyzed. It was also shown that the bHLH genes Hesl and Mashl are expressed in the adult brain (Parras etal. 2004; Ohtsuka etal. 2006), suggesting that the genes regulating embryonic neural development also regulate adult neurogenesis. Adult neurogenesis is known to be important for learning and memory, and its inhibition seems to result in depression. Future research should thus reveal whether or not these bHLH genes are involved in adult neurogenesis. Such analysis will be useful to understand the mechanism of brain functions and diseases.

В развивающейся ЦНС нейроэпителиальные клетки активно пролиферируют за счет симметрических клеточных делений на ранних стадиях развития (Рис.1). По ходу развития нейроэпителиальные клетки постепенно превращаются в радиальные глиальные клетки, тела которых находятся в вентрикулярной зоне, а радиальные отростки достигают поверхности мягкой мозговой оболочки (pial ). Как нейроэпителиальные, так и глиальные клетки являются эмбриональными нейральными стволовыми клетками (Alvarez-Buylla et al. 2001; Fishell & Krigstein 2003; Fujita 2003; Gotz & Huttner 2005). Радиальные глиальные клетки дают множество различного типа нейронов за счет повторяющихся асимметричных делений клеток. Каждое асимметричное деление дает одну новую радиальную глиальную клетку и один нейрон или предшественник нейрона. Нейроны мигрируют вдоль радиальных волокон к наружным слоям, тогда как радиальные глиальные клетки остаются в вентрикулярной зоне (Рис. 1). После продукции нейронов радиальные глиальные клетки окончательно дифференцируются в глиалльные клетки, такие как астроциты (Рис.1). Т.о., в развивающейся нервной системе вследствие трех ступеней происходит последовательно симметричная пролиферация нейральных стволовых клеток, нейрогенез и глиогенез.

Во время нейрогенеза региональная спецификация регулируется границами, которые подразделяют развивающуюся нервную систему на множество компартментов. Напр., перешеек является границей между средним мозгом и задним и регулирует спецификацию соседних компартментов за счет секреции Fgf8 (Kiecker & Lumsden 2005). Пограничные клетки обычно пролиферируют медленно и не дают нейронов, хотя они морфологически сходны с нейральными стволовыми клетками в компартментах (Kiecker & Lumsden 2005).

Было показано, что гены Hes, репрессорного типа bHLH гены, играют важную роль в развитии как компартментных, так и пограничных клеток в ЦНС (Bertrand et al. 2002; Ross et al. 2003; Kageyama et al., 2007). Интересно, что характер экспрессии Hes1, по-видимому, отличается в двух структурах ( персистирует и на высоком уровне в пограничных клетках и варьирует в нейральных стволовых клетках компартментов). Эти разные типы экспрессии участвуют в разных характеристиках пограничных и компартментных клеток.

Hes factors are repressors and oscillators

Hes гены являются у млекопитающих гомологами генов hairy и Enhancer of split, которые негативно регулируют нейрогенез противодействуя пронейральным генам, таким как комплекс achaete-scute (Akazawa et al. 1992; Sasai et al. 1992). Известны 7 членов семейства Hes, каждый из которых обладает законсервированным bHLH доменом (Рис. 2). Hes факторы формируют гомодимеры посредством HLH региона и соединяются с N box CACNAG и класса С сайтом CACG(C/A)G посредством базового региона с высоким сродством в отличие от большинства др bHLH факторов, которые соединяются с Е box CANNTG с высоким сродством. Помимо bHLH домена Hes факторы имеют еще один законсервированный домен, WRPW (Trp-Arg-Pro-Trp), на С конце, который действует как домен репрессии, путем рекрутирования корепрессоров, гомологов Groucho (Рис. 2А). Т.о., факторы Hes репрессируют транскрипцию путем соединения с последовательностями ДНК мишени и путем активного рекрутирования корепрессоров (активная репрессия; Рис. 2В). Гены мишени включают Mash1, у млекопитающих гомолог пронейрального комплекса генов achaete-scute дрозофилы, который кодирует bHLH активатор и индуцирует дифференцировку нейронов. Hes1 репрессирует транскрипцию Mash1 за счет соединения с класса С сайтом в промоторе Mash1 (Chen et al. 1997). Hes факторы также формируют гетеродимеры с bHLH активаторами, такими как Mash1 и Е47. Однако эти гетеродимеры не соединяются с ДНК, тем самым ингибируя транскрипционную активность bHLH активаторов (пассивная репрессия; Рис. 2В). Т.о., Hes факторы противодействуют активности пронейральных генов c помощью, по крайней мере, двух механизмов.

Др. важной мишенью для Hes1 является сам Hes1. Hes1 репрессирует свою собственную экспрессию путем непосредственного соединения с последовательностями N box в промоторе Hes1 (рис. 3; Takebayashi et al., 1994). Эта негативная обратная связь ведет к исчезновению как мРНК, так и белка Hes1, поскольку они чрезвычайно нестабильны, это делает возможным следующий раунд экспрессии. Таким способом Hes1 автономно вызывает осцилляцию экспрессии с периодичностью примерно в 2 ч (Рис. 3; Hirata et al. 2002; Masamizu et al. 2006; Shimojo et al., 2008). В PSM экспрессия Hes7 также осциллирует за счет негативной петли обратной связи с периодичностью примерно в 2 ч и эта осцилляция регулирует сегментацию сомитов (Bessho et al. 2001, 2003). В отсутствие Hes7 др. осцилляторы, такие как Lunatic fringle и Dusp-4 прекращают осцилляторную экспрессию и сомиты сливаются (Bessho et al. 2001; Niwa et al. 2007). очевидно, что Hes7 регулирует сегментацию сомитов, тогда как Hes1 регулирует временной параметр др. событий в качестве биологических часов, хотя точная роль осцилляций Hes1 не установлена.

Maintenance of neural stem cells by Hes genes

На стадии нейральной пластинки Hes1 и Hes3 широко экспрессируются нейроэпителиальными клетками вдоль всей нейро-оси, Hes5 на этой стадии не экспрессируется (Рис.1; Hatakeyama et al. 2004). Т.к. нейроэпителиальные клетки постепенно изменяются в радиальные глиальные клетки, то экспрессия Hes3 подавляется и вместо этого экспрессия Hes5 появляется в развивающейся нервной системе (Рис.1; Hatakeyama et al. 2004). На ст. нервной трубки экспрессия Hes3 постепенно ограничивается перешейком, тогда как экспрессия Hes5 расширяется и становится в основном комплементарной экспрессии Hes1, при этом экспрессия Hes1 и Hes5 перекрывает почти все регионы развивающейся нервной системы эмбрионов мышей на ст. Е10.5 (Hirata ett al. 2001; Hatekeyama et al., 2004). Позднее экспрессия Hes1 и Hes5 ограничивается вентрикулярной зоной, которая содержит клеточные тела радиальной глии (Akazawa et al. 1992; Sasai et al. 1992).

Избыточная экспрессия Hes генов у эмбрионов мышей ингибирует нейрогенез и поддерживает нейральные стволовые клетки (Ishibashi et al.1994; Ohysuka et al. 2001). Напротив, у Hes1 нокаутных мышей экспрессия пронейральных генов, таких как Mash1, усиливается и нейрогенез ускоряется (Ishibashi et al. 1995). Однако т.к. экспрессия Hes5 усиливается, то дефекты относительно слабые у Hes1 нокаутных мышей. У Hes1.Hes5 двойных нокаутных мышей дефекты более тяжелые, но имеется всё ещё много нейральных стволовых клеток в развивающейся нервной системе, это указывает на то, что Hes3 компенсирует дефекты до некоторой степени (Ohtsuka et al. 1999). Напротив, у Hes1;Hes3;Hes5 тройных нокаутных мышей хотя нейроэпителиальные клетки и образуются нормально примерно на ст. Е8, они собственно не сохраняются и преждевременно дифференцируются в нейроны на ст. нервной пластинки (Hatakeyama et al. 2004). у таких мутантных мышей действительно все клетки становятся нейронами в развивающемся спинном мозге на Е10, указывая тем самым, что Hes1, Hes3 и Hes5 ответственны за поддержание всех нейральных стволовых клеток в этой области (Hatakeyama et al. 2004). Т.о., гены Hes необходимы для поддержания, но не для инициального образования нейральных стволовых клеток. Какие гены регулируют инициальное образование нейральных стволовых клеток, предстоит определить. В отсутствие Hes генов нейральные стволовые клетки дифференцируются в рано появляющиеся нейроны и оказываются истощенными перед генерацией поздно появляющихся типов клеток. таких как астроциты. Нейральные стволовые клетки не могут быстро изменить свою компетентность, необходимо время, чтобы они стали компетентными генерировать поздно появляющиеся типы клеток. Т.о., Hes гены являются существенными для генерации всего разнообразия типов клеток за счет поддержания нейральных стволовых клеток вплоть до поздних стадий.

Hes1 and Hes5 expression regulated be Notch signaling

Notch это трансмембранный белок, активируемый c помощью лигандов, таких как Delta (Рис.4). После активации внутриклеточный домен (ICD) высвобождается от мембранной части и переносится в ядро, где ШСВ формирует комплекс с ДНК-связывающим белком RBP-J. Без ICD RBP-J репрессирует экспрессию Hes1 и Hes5 благодаря связыванию с их промоторами. Однако этот комплекс RBP-J и ICD действует как активатор транскрипции. Т.о., активация передачи сигналов Notch ведет к индукции экспрессии Hes1 и Hes5 (Рис. 4; Honjo 1996; Artavanis-Tsakonas et al. 1999). ICD поддерживает нейральные стволовые клетки благодаря ингибированию нейрогенеза (Furukawa et al. 2000; Gaiano et al. 2000). Однако в отсутствие Hes1 и Hes5 ICD неспособен ингибировать нейрогенез, указывая тем самым. что Hes1 и Hes5 являются важными эффекторами передачи сигналов Notch (Рис. 4; Ohtsuka et al. 1999).

Хотя передача сигналов Notch регулирует экспрессию Hes1 и Hes3, их инициальная происходит в нейроэпителиальных клетках ещё до экспрессии компонентов сигнального пути Notch, указывая тем самым. что инициация экспрессии Hes1 и Hes3 не зависит от Notch (Hatakeyama et al. 2004). Однако последующая экспрессия Hes5 происходит совместно с экспрессией компонентов передачи сигналов Notch, подтверждая, что инициация экспрессии Hes5 зависит от передачи сигналов Notch. Кроме того, экспрессия Hes1 также позднее перекрывается с экспрессией компонентов сигнального пути Notch, указывая тем самым, что боее поздняя экспрессия Hes1 регулируется с помощью передачи сигналов Notch. Какие из факторов ответственны за инициальную экспрессию Hes1 и Hes3 в нейроэпителиальных клетках ещё предстоит определить.

Пронейральные гены, такие как Mash1 и Neurogenin2 (Ngn2), не только активируют программу дифференцировки нейронов, но и также индуцируют экспрессию Delta, активируя тем самым передачу сигналов Notch и ингибируя нейрональную дифференцировку соседних клеток (Castro etal. 2006). Этот процесс наз. "латеральное ингибирование" (Honjo 1996; Artavanis-Tsakonas etal. 1999). Латеральное ингибирование предохраняет все нейральные стволовые клетки от реакции одним и тем же образом, позволяя лишь субнаборам клеток дифференцироваться в нейроны и удерживая остальных оставаться нейральными стволовыми клетками. Эти оставшиеся нейральными стволовыми клетками позднее дифференцируются в разного типа клетки, Т.о., латеральное ингибирование важно для поддержания нейральных стволовых клеток и генерации полного спектра типов клеток.

Promotion of gliogenesis by Hes genes

Избыточная экспрессия Hes генов в развивающемся головном мозге поддерживает нейральные стволовые клетки на более ранних стадиях, но способствует образованию астроцитов на более поздних стадиях (Fig. 1), указывая тем самым, что гены Hes обладают двойной активностью в зависимости от стадии развития (Ohtsuka etal. 2001). Сходным образом избыточная экспрессия генов Hes в постнатальной сетчатке способствует генерации Muller глии, единственной глии, образуемой в сетчатке (Furukawa etal. 2000; Hojo et al. 2000). Эти фенотипы скходны с таковыми при инактивации пронейральных генов. В отсутствие пронейральных генов, таких как Mash1 и Math3, дифференцировка нейронов ингибируется, а нейральные стволовые клетки сохраняются на более ранних стадиях, тогда как на более поздних стадиях образование астроцитов и Muller глиальных клеток усиливается, указывая тем самым, что пронейральные гены обладают двойной активностью: способствуют дифференцировке нейронов и ингибируют образование астроцитов и Мёллеровской глии (Tomita etal. 2000; Hatakeyama etal. 2001; Nieto etal. 2001). Согласуется с этим мнением и то, что Ngn1 позитивно регулирует специфичную для нейронов экспрессию генов и репрессирует специфичную для астроцитов экспрессию генов путем секвестрирования коактиватора p300/CBP (Sun etal. 2001). Поэтому вполне возможно, что обеспечение образования астроцитов и Мёллеровской глии с помощью генов Hes обучловлено репрессией пронейральных генов.

Нейральные стволовые клетки неспособны дифференцироваться в глиальные клетки на ранних стадиях и необходимо время, чтобы эти клетки приобрели глиогенную компетентность. Молекулярные основы, лежащие в основании глиогенной компетентности ещё предстоит определить, Но состояние метилирования промоторных регионов генов, специфичных для астроцитов, может вносить вклад в эту компетентность. На более ранних стадиях промоторные регионы астроцит-специфических генов гиперметилированы и поэтому резистентны к активации генов, тогда как они гипометилированы и готовы к экспрессии на более поздних стадиях (Takizawa etal. 2001). Более того, деметилирующая обработка нейральных стволовых клеток на ранних стадиях ускоряет дифференцировку астроцитов (Takizawa etal. 2001). Эти результаты указывают на то, что статус метилирования промоторных регионов важен для глиогенной компетентности. Др. механизм - это присутствие факторов партнёров, таких как гомеодоменовый фактор Рахб. Напр., Hes1 индуцирует судьбы нейральных стволовых клеток в клетках, экспрессирующих Рахб, но судьбы астроцитов в Рахб-негативных клетках в развивающемся спиннои мозге (Sugimori et al. 2007).

Maintenance of boundary cells by Hes genes

Развивающаяся ЦНС подразделяется на множественные компартменты с помощью границ, которые функционируют как организующие центры (Fig. 5A). Пограничные клетки обычно пролиферируют медленно и не дают нейронов. Клетки в верхней (roof) пластинке и донной (floor) пластинки нервной трубки обладают сходными свойствами своих пограничных клеток. В этих регионах Hes1 белок постоянно экспрессируется на высоких уровнях (Fig. 5B). Hes3 обычно экспрессируется в перешейке (isthmus), тогда как Hes5 не экспрессируется на границах. Однако эктопическая экспрессия Hes5 происходит в пограничных регионах Hes1 КО мышей. компенсируя их поддержание. Т.о., все три Hes участвуют в пограничных клетках (Hirata et al. 2001; Baek et al. 2006). На границах пронейральные гены не экспрессируются, указывая тем самым сохраняющаяся экспрессия Hes постоянно репрессирует экспрессию пронейральных генов. В согласии с этим мнением то, что у Hes1;Hes3;Hes5 трижды КО мышей пронейральные гены эктопически экспрессируются и на границах происходит нейрогенез. Как результат все границы или не поддерживаются или не образуются и региональная спецификация тяжело нарушается (Hirata etal. 2001; Baek etal. 2006).

В противоположность пограничным клеткам нейральные стволовые клетки в компартментах экспрессируют варьирующие уровни Hes1 (Baek etal. 2006). Эта изменчивость может отражать постепенное подавление экспрессии Hes1 в дифференцирующихся клетках (Fig. 5B). Др. возможность заключается в том, что экспрессия Hes1 осциллирует в нейральных стволовых клетках, как в фибробластах (Fig. 5B). Наши недавние данные по real-time imaging (Masamizu et al. 2006) показали. что последнее действительно так (Shimojo etal. 2008). интересно. что уровенть Mash1 высок в клетках, экспрессирующих низкие уровни Hes1 и vice versa, указывая тем самым, что экспрессия Mash1 также осциллирует в противоположной фазе по отношению к Hes1 (Fig. 5B; Baek etal. 2006). Возможно, что нейральные стволовые клетки в компартментах готовы к нейрональной дифференцировке за счет периодически экспрессируемого Mash1, тогда как пограничные клетки резистентны к нейрональной дифференцировке за счет постоянной репрессии пронейральных генов. Чтобы подтвердить этом мнение форсировали экспрессию Hes1 непрерывно в компартментных клетках это вело к ингибированию нейрональной дифференцировки. Более того, эта процедура снижала скорость пролиферации клеток за счет индукции задержки на G1 фазе клеточного цикла (Baek etal. 2006). Т.о., непрерывная экспрессия Hes1 ведет к ингибированию как клеточной пролиферации, так и дифференцировки, двух важных свойств пограничных клеток. Эти результаты подтверждают, что осциллирующий и непрерывный способ экспрессии Hes1 регулируют характеристики компартментных и пограничных клеток, соотв.

Regulation of Hes1 oscillation by Stat3-Socs3 oscillations

Точный механизм того, как варьирующая/осциллирующая в противовес непрерывно экспрессии Hes1 регулируется в развивающейся нервной системе, неизвестно, но было показано. что Stat3-Socs3 осцилляции важны для осцилляций Hes1 в фибробластах (Yoshiura etal. 2007). Jak2 активирует Stat3 путем фосфорилирования, а фосфорилированный Stat3 (pStat3) переносится из цитоплазмы в ядро и позитивно регулирует экспрессию генов мишеней (Fig. 6). Один из них это Socs3, который противодействует Jak2-зависимой активации Stat3, образуя тем самым Jak2-Stat3-Socs3 негативную петлю обратной связи (Fig. 6; Levy & Darnell 2002; Yu & Jove 2004). С помощью этой негативной петли обратной связи уровни pStat3 и Socs3 осциллируют с периодичностью около 2 ч (Yoshiura et al. 2007). Интересно, что блокада этих осцилляций ингибирует осцилляции Hes1, делая уровень белка Hes1 постоянным (Yoshiura etal. 2007). Т.о., осциллирующая в противовес непрерывной экспрессии Hes1 регулируется с помощью pStat3-Socs3 осцилляций. Механизм, с помощью которого pStat3-Socs3 осцилляции регулируют осцилляции Hes1, предстоит определить, но pStat3 ведет к нестабильности белка Hes1, которая важна для осцилляторной экспрессии (Fig. 6). Ранее было показано, что Hes1 способствует Jak2-зависимой активации Stat3 за счет физического взаимодействия др. с др. в нейральных стволовых клетках (Kamakura et at. 2004). Т.о., возможно, что Hes1 осцилляции и осцилляции pStat3-Socs3 зависят др. от др. в этих клетках (Fig. 6).

Conclusions

It has been shown that bHLH genes play an essential role in neural development. Particularly, antagonistic regulation between activator-type and repressor-type bHLH genes is important for maintenance of neural stem cells and proper timings of neurogenesis and gliogenesis. Hes genes maintain neural stem cells by antagonizing activator-type bHLH genes until later stages, lead to generation of a full diversity of cell types and thereby regulate the size, the shape and the cytoarchitecture of the nervous system. Furthermore, variable Hesl expression is important for proliferation and differentiation of compartmental neural stem cells, while persistent and high Hesl expression is required for maintenance of slowly proliferating and non-neurogenic boundary cells. It is likely that this variable versus persistent Hesl expression is controlled by pStat3-Socs3 oscillations, although the exact mechanism remains to be analyzed. It was also shown that the bHLH genes Hesl and Mashl are expressed in the adult brain (Parras etal. 2004; Ohtsuka etal. 2006), suggesting that the genes regulating embryonic neural development also regulate adult neurogenesis. Adult neurogenesis is known to be important for learning and memory, and its inhibition seems to result in depression. Future research should thus reveal whether or not these bHLH genes are involved in adult neurogenesis. Such analysis will be useful to understand the mechanism of brain functions and diseases.

Roles of Hes genes in neural developmentR.Kageyama, T. Ohtsuka, T.Kobayashi Develop.Growth Diff. (2008) V.50, S97-S103

Roles of Hes genes in neural development
R.Kageyama, T. Ohtsuka, T.Kobayashi
Develop.Growth Diff. (2008) V.50, S97-S103