Как эволюция генома животных ведет к столь удивительному разнообразию форм тел? Некоторые из большинства информативных указаний по этой фундаментальной проблеме получены при изучении мутаций гомеобоксных (Hox) генов. Эти мутации имеют мощные и интерпретируемые эффекты на морфологию большинства бросающихся в глаза HOMEOTIC TRANSFORMATIONS у Drosophila melanogaster1,2. Кроме того, Hox гены присутствуют и экспрессируются в виде сходных паттернов почти у каждого (BILATERAL) животного с билатеральной симметрией, которые были проанализированы в отношении их роли в морфологической диверсификации, возможно появившейся ещё до возникновения первых bilateral животных. В самом деле, первоначально они засветились в консервации генов, контролирующих развитие у metazoan, в исследованиях кластеров Нох генов у D. melanogaster3, которые были первоначально (и более информативно) названы гомеозисными генами селекторами.
Среди разнообразия животных, в пределах от нематод до мышей, мутации Hox генов приводят к морфологическим дефектам, которые ограничены дискретными сегментными зонами вдоль anterior-posterior (A-P) оси и иногда включают гомеозисные трансформации, сходные с теми, что встречаются у D. melanogaster4,5. Следовательно, одной из законсервированных функций разных членов семейства Hox генов является выбор одной A-P аксиальной качественной особенности (identity) среди др. Hox гены интересны также благодаря их контролю аксиальной морфологии, они осуществляют свое влияние в разных органах, тканях и типах клеток внутри разных A-P регионов. Следовательно, выпячивание роли Нох генов в контроле A-P или ORAL-ABORAL осевых качественных особенностей является упрощением функций Нох генов, которые достигли разнообразия в течение эволюции их в 600 миллионов лет у миллионов ветвей животных6-10, очевидна их родоначальная роль в формировании онтогенетических паттернов11.
Нох гены картируются в хромосомных кластерах и разных кластерах PARALOGUES они обычно располагаются колинеарным способом по отношению к их самостоятельным, часто перекрывающимся доменам экспрессии (FIG. 1a,b). У эмбрионов животных, у которых можно различить mid-head и заднююд часть живота, 'head' Hox гены имеют свои инициальные передние границы экспрессии в эпидермальных, нейральных и мезодермальных клетках в области средины головы, а 'tail' Hox гены имеют свои инициальные передние границы экспрессии в соотв. типах клеток в задней части живота3. После того как инициальные границы заложены, паттерны экспрессии Нох генов могут быть лабильными внутри ограниченных крупных инициальных доменов12,13.
Гомеодоменовые транскрипционные факторы, которые кодируются с помощью Нох генов, активируют и репрессируют батареи нижестоящих генов путем непосредственного соединения с последовательностями ДНК в чувствительных к Нох энхансерах. In vitro, Hox белки могут связываться с высоким сродством как с мономеры, так и мультимеры со специфическими сайтами связывания ДНК3 (за исключением
Labial/Homeobox 1 (LAB/HOX1) класса белков, которые соединяются почти исключительно как гетеро-димеры с Pre-B-cell homeobox/CEH-20 (PBC) классом белков14,15). In vivo, однако, Hox белки соединяются с и регулируют транскрипцию посредством широкого набора сайтов связывания (FIG. 1c). Со многими энхансерами мишенями Hox белки кооперативно соединяются с каноническими гетеродимеры-связывающими сайтами14,15 членов семейства PBC гомеодоменовых белков (называемых PBX у млекопитающих, EXD у D. melanogaster, CEH-20 и CEH-40 у Caenorhabditis elegans)16 и сайтами связывания для HTH/MEIS сверхсемейства гомеодоменовых белков (которые включают MEIS или PREP у млекопитающих, HTH у D. melanogaster и
UNC-62 у C. elegans16), часто обнаруживаемых по соседству. Функциональный регуляторный комплекс, который действует на Нох-чувствительные элементы, часто вовлекается HOX-PBC-MEIS гетеротримеры17. Частично благодаря различным предпочтениями в связывании определенных Нох белков в эти х гетеротримерных комплексах и частично благодаря PBC/MEIS-независимым механизмам, активируются и репрессируются самостоятельные, но перекрывающиеся комбинации нижестоящих генов, в результате чего закладывается морфологические различия в аксиальных доменах.
Здесь будут рассмотрены 4 области, в которых исследования Нох были успешными в последние годы.
Hox targets and morphological diversification
Частично Hox белки действуют как высокого уровня исполнители, регулирующие др. исполнительные гены (включая самих себя,
extradenticle (exd) и homothorax (hth)18-22), которые кодируют транскрипционные факторы или сигналы морфогенов. Однако, накапливаются доказательства, что они действуют непосредственно на большинстве др. уровней23, даже на 'blue collar' гены, которые обеспечивают адгезию, скорость делений клеток, гибель клеток и движения клеток. Часто сокрушаются в печати, что известно мало генов мишеней для Hox, но это не так. Известно, по крайней мере, 35 генов мишеней, у разных организмов, которые предоставляют прекрасные доказательства непосредственной регуляции с помощью одного или нескольких Hox белков (TABLES 1,2). Помимо этих хорошо охарактеризованных мишеней, многие др. гены испытывают влияние со стороны экспрессии Нох, но они не обнаруживают непосредственно регуляции с помощью Нох генов. Эксперименты с микромассивами идентифицировали довольно большой пул потенциальных генов мишеней24-26.
Hox regulation: executive level. Имеется множество примеров непосредственной Нох регуляции генов, которые кодируют межклеточные сигнальные молекулы или др. транскрипционные факторы. Большинство таких генов мишеней считаются потенциальными мишенями, т.к. их мутантные фенотипы обнаруживают сходство с фенотипами нох мутантов. Др. были причислены к ним из-за своих паттернов A-P экспрессии, или воссоздающих или комплементарных паттернов одного или нескольких Нох белков, что согласуется с позитивной или негативной регуляцией, соотв.
Одним из исполнительных генов мишеней является decapentaplegic (dpp), который экспрессируется в A-P домене VISCERAL MESODERM у D. melanogaster. Этот паттерн экспрессии dpp обеспечивается, частично, с помощью Hox белков Ultrabithorax (UBX) и Abdominal-A (ABD-A), которые активируют и репрессируют транскрипцию dpp, соотв.27. Локальная продукция DPP, секретируемого морфогена для класса bone morphogenetic protein (BMP), затем запускает изменения клеточной формы в кишке, что необходимо для нормальной висцеральной морфологии6. UBX и ABD-A также непосредственно репрессируют ген Distal-less (Dll) в абдоминальном эпидермисе D. melanogaster28 (заметим, что белки Hox могут оперировать как транскрипционные активаторы, как UBX в отношении dpp в висцеральной мезодерме, или как репрессоры, как UBX действует на Dll в эпидермисе). Ген Dll кодирует гомеодоменовый транскрипционный фактор, который способствует развитию придатков, так что его репрессия с помощью UBX приводит к отсутствию конечностей в абдоминальной области. У C. elegans, ген, который кодирует гомолог транскрипционного фактора Twist, helix-loop-helix 8 (hlh-8), непосредственно активируется в мезодермальных клетках середины тела с помощью Нох белков abnormal cell lineage 39 (LIN-39) и male abnormal 5 (MAB-5)29 (FIG. 1a,b). Ген hlh-8 необходим для развития нормальной мезодермы, а его отсутствие вносит вклад в локальные мышечные дефекты, которые наблюдаются у мутантов lin-39 и mab-5.
Hox regulation: cell adhesion. Уже давно было осознано, что Hox белки д. регулировать клеточные слипчивость, деления, миграцию и форму для того, чтобы отладить морфологию30. Однако, лишь недавно были идентифицированы некоторые Hox гены мишени, гены реализаторы30, которые непосредственно обеспечивают такие свойства на клеточном уровне у развивающихся животных. Некоторые из первых доказательств Нох контроля клеточной адгезии получены Yokouchi et al.31. Мышиный Hoxa13 обычно экспрессируется в развивающихся AUTOPODS. Эктопическая активация Hoxa13 в целой развивающейся конечности обусловливает заметную редукцию зачатков хряща для прокисмальных частей конечностей, хряща, который обычно развивается в radius и ulna31. Этот фенотип оказался ассоциированным с Hoxa13-зависимым увеличением адгезии гомофильных клеток в проксимальных зачатках хряща.
Напротив у мутантных Hoxa13 мышей, мезенхимные конденсаты, которые обычно формируют autopod, рыхло и слабо организованы, в результате чего теряются или аномальны пальцы, carpal и tarsal кости, которые происходят из дистальных частей конечности32. Обычно ген, который кодирует ephrin рецептор EPHA7 экспрессируется в дистальных доменах конечностей способом, который очень соответствует экспрессии Hoxa13. Однако, у мутантов Hoxa13 экспрессия EphA7 сильно редуцирована. Снижение функции белка EPHA7 с помощью блокирующих антител на Hoxa13+/- фоне приводит к неспособности образования нормальных хондрогенных конденсатов в дистальных частях зачатков конечностей, сходно с фенотипом, который наблюдается у мутантов Hoxa13-/-. N/r/ во многих контекстах прямые взаимодействия между трансмембранными ephrin рецепторами и их связанными с мембраной лигандами необходимы для нормальной клеточной слипчивости (а также для многих др. клеточных реакций)33, кажется вполне возможным, что HOXA13-обусловленные мезенхимные конденсации в дистальных частях конечностей возникают частично в результате активации экспрессии гена EphA7. Регуляция гена ephrin рецептора и/или ephrin лиганда с помощью Hox белков, по-видимому, всеобща. В комбинации с PBX1, белки HOXA1 и HOXB1 м.
соединяться и активировать специфичный для ромбомеров мышей энхансер из гена Epha2 в COS7 CELLS34, а мышиный HOXA9 белок м.соединяться и активировать ген Ephb4 в культивируемых клетках эпителия35. Кроме того, недавний геномный скрининг генов мишеней для Нох показал, что мышиный ген Epha3 репрессируется
Hoxd13-зависимым и Hoxa13-зависимым образом в задних регионах развивающихся autopods36.
Hox regulation: cell cycle. Имеется ряд доказательств вовлечения Hox в развитие кровяных клеток у млекопитающих37, включая активацию гена Hoxa10 во время дифференцировки культивируемых MYELOMONOCYTIC CELLS в MONOCYTES. Роль Hoxa10 в миэлоидном и эритроидном развитии в клетках костного мозга сложна и пока неясно, как он функционирует в культивируемых myelomonocytes, воспроизводя их функцию у животных38. Форсированная экспрессия HOXA10 белка в культивируемых миэломоноцитных клетках вызывает преждевременную дифференцировку в моноциты, что сопровождается остановкой роста36. Этот фенотип ареста роста, по-видимому, конитролируется с помощью Hoxa10-зависимой активации Cdkn1a гена, который кодирует циклин зависимый киназный ингибитор, p21. Белок HOXA10 вместе с PBX1 и MEIS1 белками м. соединяться с последовательностями промотора Cdkn1a in vitro , что, по-видимому, является частью цис-регуляции ДНК, которая обеспечивает эффекты HOXA10 на клеточный цикл in vivo.
Hox regulation: cell death. Др. путь. с помощью которого Hox белки м. регулировать морфологию, м. заключаться в устранении клеток, которые не являются частью предполагаемой тканевой формы. Имеются доказательства, что гены Hox действуют как скульпторы. регулирующие клеточную гибель. У эмбрионов D. melanogaster
поддержание сегментных границ между maxillary и mandibular сегментами головы (FIG. 1a) нуждается в локальной гибели клеток на границе, что контролируется с помощью гена, способствующего апоптозу, reaper (rpr). Мутации в Hox гене Deformed (Dfd) обнаруживают сходные дефекты сегментации головы с мутантами, у которых делетированы некоторые гены клеточной гибели и которые в основном обусловливаются отсутствием экспрессии rpr на maxillary-mandibular границе у Dfd мутантов39. Когда полоска экспрессии rpr обеспечивается на границе у Dfd мутантов, то сегментная граница сохраняется. Кроме того, выявлен небольшой rpr энхансер, который необходим для 4-х DFD-связывающих сайтов для транскрипционной активации на maxillary-mandibular границе у эмбрионов39 (BOX 1).
Сходным образом, морфология в абдоминальной области D. melanogaster взрослой ЦНС создается Hox зависимым способом. У взрослых абдоминальная ЦНС значительно меньше, чем торакальная ЦНС из-за меньшего количества клеток. Bello et al. установили, что кратковременное пульсовое воздействие экспрессии белка ABD-A в крупном субнаборе абдоминальных постэмбриональных нейробластов запускает апоптоз таким способом, который зависит от про-апоптических генов rpr, head involution defective 1 (hid1) и grim, с последующей редукцией размеров абдоминальных NEUROMERES взрослых40.
Hox regulation: cell migration. Hox гены, как известно модулируют миграцию клеток и одним из наиболее подходящих примером является контроль миграции Q NEUROBLAST во время развития C. elegans с помощью Hox генов mab-5 и lin-39. Функция mab-5 необходима CELL AUTONOMOUSLY для миграции кзади производных QL нейробластов41, a lin-39 необходим для миграции кпереди производных QR нейробластов42,43. Клеточные биологические медиаторы, которые регулируются с помощью LIN-39 и MAB-5 белков, неизвестны. Приведенные выше примеры непосредственно вычеркивают поверхностные Hox-регулируемые морфологические эффекторные гены, и теперь они показывают, что клеточные биологические эффекторы, которые регулируются Hox белками, чтобы создавать морфологию вдоль A-P оси, чрезвычайно разнообразны. Hox белки активируют и репрессируют множественные эффекторные гены в разнообразных типах клеток и тканей, в ходе эмбрионального развития. Из-за огромной сложности этих взаимодействий, вряд ли вероятно, что мы сможем полностью понять на молекулярном уровне, как Hox гены предопределяют, чтобы целый сегмент приобрел торакальную в противоположность абдоминальной качественной особенности. Мы, по-видимому, никогда не сможем понять, как клеточная адгезия и др. свойства контролируются с помощью системы Hox на самой малой шкале в обеспечении разнообразия аксиальных морфологий.
Hox-regulated enhancers
Хотя мы можем никогда не закончит картину Hox-зависимых клеточно-биологических изменений, которые делают отличным один сегмент от др., но возможно, что однажды мы поймем принципы, с помощью которых Hox target enhancers строятся, по крайней мере достаточно, чтобы предсказывать их локализацию в геноме с разумной частотой. Наше определение Hox target enhancers в этом обзоре касается только тех, для которых существует строгие доказательства непосредственной регуляции с помощью Hox белка у развивающихся животных. Наиболее точный тест для оценки прямого target элемента, 'золотой стандарт', это слегка мутантные Hox-связывающие сайты энхансера, так что они предпочитают связывать Bicoid, не-Hox гомеодоменовый белок. Это изменение дает в результате энхансер с редуцированным родством связывания и , следовательно, с редуцированной реакцией на предполагаемый Hox trans-регулятор. Компенсаторные мутации затем вносятся в ДНК-связывающий домен предполагаемого Hox trans-регулятора, что позволяет ему соединяться с высоким сродством с мутантным сайтом энхансера. Если измененный белок восстанавливает способность регулировать измененный энхансер, то это строго доказывает, что специфический Hox белок соединяется со специфическим энхансером в эмбриональных клетках. Лишь немногие Hox-регулируемые энхансеры были оценены, используя этот тест27,44-47, который к тому же был применен к эмбрионам Drosophila. Однако, т.к. это обычно для большинства исследований in vivo энхансеров животных, то был проделан более общий тест, может ли мутантный энхансер, в котором все Hox-связывающие сайты были элиминированы, воспроизводить активность энхансера дикого типа у мутантных эмбрионов, которые лишены предполагаемого Hox trans-регулятора (BOX 1).
Common principles of Hox target enhancers. Пять энхансеров, которые показаны в BOX 1 представляют собой выборку из разнообразных Hox-чувствительных ДЕК элементов. Хотя они отличаются многими способами, включая организм. из которого произошли, они все же обладают некоторыми общими свойствами.
Первым общим свойством является ткане-специфичность. Напр., UBX-зависимый энхансер из Drosophila dpp активен только в висцеральной мезодерме (BOX 1), и не активен в эпидермальных, ЦНС и соматических мезодермальных клетках, которые также содержат UBX белок. Эта специфичность обусловлена тем, что dpp энхансер регулируется также с помощью Biniou/FOXF, транскрипционного фактора, специфичного для висцеральной мезодермы forkhead-типа48. Два аутоактивационных энхансера из Dfd гена также подтверждают это правило 'тканевой специфичности'. Один, который картируется на 5 kb выше точки старта транскрипции Dfd, активен только в эпидермальных клетках, которые экспрессируют DFD белок на maxillary-mandibular границе49. Хотя DFD белок также аутоактивирует и транскрипцию Dfd в ЦНС, этот процесс обеспечивается посредством др. энхансера, который картируется в крупном интроне гена Dfd50.
Вторым общим свойством чувствительных к Hox элементов является необходимость для множественных сайтов, связывающих Hox-мономеры (FIG. 1c) (BOX 1), большинство из которых обладает ATTA (или TAAT) стержневой последовательностью. Многие чувствительные к Hox элементы нуждаются также в Hox-PBC-гетородеимер-связывающих сайтах (BOX 1) и часто содержат MEIS-связывающие сайты также при варьирующих пространственных расстояниях от Hox-PBC сайтов. Пределы Hox-мономеры-связывающих сайтов и Hox-PBC-связывающих последовательностей широки (FIG. 1c). Это согласуются с данными, показывающими, что не имеется систематических взаимоотношений между сродством к мономерным и гетеродимерным сайтам in vitro и с их функциональной важностью in vivo27,51-54. Как функциональная специфичность Hox-регулируемых энхансеров укрепляется без помощи PBC или MEIS сайтов, неизвестно, но не удивительно, что, давление естественного отбора 'использует' любой доступный механизм для генерации многозначимых паттернов экспрессии Hox энхансеров. На базе генетических доказательств на D. melanogaster, имеется, по крайней мере, два др. эволюционно законсервированных транскрипционных фактора, Teashirt и Disco, которые, по-видимому, оперируют как Hox кофакторы в спецификации A-P осевых качественных особенностей55-58. Взаимодействуют ли эти два белка механически с Hox белками, чтобы активировать или репрессировать мишени энхансеры и как они это делают, неизвестно.
In silico searches for Hox targets. Наибольшие надежды выявления, по крайней мере, субнабора чувствительных к Hox элементов с помощью биоинформационных средств, дает поиск геномных областей, которые богаты Hox, PBC и MEIS консенсусными сайтами. Чтобы протестировать пригодность этой стратегии, Ebner et al. исследовали геном D. melanogaster на канонические LAB-EXD-гетеродимер-связывающие последовательности в 40 пар оснований из HTH-consensus-связывающих последовательностей и идентифицировали 30 геномных областей, которые отвечают этим условиям54. Паттерны экспрессии генов вблизи 16 из этих локусов были тестированы в отношении перекрывания с паттерном экспрессии LAB. Помимо lab ауторегуляторного энхансера (источника сиквенс мотивов), идентифицирован только один иной предположительно LAB-чувствительный элемент. Он был картирован в первом интроне гена CG11339 , который кодирует актин-связывающий белок, который активируется в виде LAB-подобного паттерна экспрессии в энтодерме54.
Тестирование геномного фрагмента в 2 kb, который содержит LAB-EXD-HTH консенсус, показало, что он не функционирует как чувствительный к Hox элемент, Однако, авт. тестировали др. фрагмент ДНК вокруг единицы транскрипции CG11339 и идентифицировали вышестоящий фрагмент, который действует как LAB-зависимый энхансер, когда слит с репортерным геном. При тестировании in vitro было установлено, что энхансер обладает HTH связывающим сайтом, а также LAB-EXD сайтом. Интересно, что последний высоко дивергентен в сравнении с каноническим сайтом, что и было использовано для биоинформационных поисков, но всё ещё необходим для активации энхансера in vivo. Этот LAB-EXD сайт также соединяется с LAB белком в качестве мономера, опровергая тем самым превалирующее мнение, что LAB обладает небольшим или не обладает ДНК-связывающим сродством в отстутствие EXD59. Возможно, что CG11339 был идентифицирован в качестве чувствительного к LAB гена случайно, хотя эта случайная находка ведет к интересной новой информации о
accident, albeit an accidental find that led to interesting
in vivo регуляции LAB-EXD54. Во всяком случае результаты этого исследования не позволяют сделать биоинформационные предсказания о естественно используемых Hox-PBC чувствительных элементах, которые используют современную версию 'DNA-binding-selectivity model'60,61.
На базе современных знаний становится ясно, что элементы мишеней для Hox не следуют простому правилу. Даже индивидуальные энхансеры, по-видимому, регулируются с помощью PBC-зависимого и PBC-независимого механизмов20. Учитывая огромное разнообразие структур чувствительных к Hox энхансеров, очевидно, что даже небольшой успех в предсказании элементов, чувствительных к Hox-response нуждается в более обширных знаниях о пределах взаимодействий Hox белков с кофакторами и сайтами мишенями в ДНК.
Hox genes and morphological evolution
В последнее время множество исследований подтверждают идею, что мутации Hox генов вносят вклад в морфологическую эволюцию1, т.к. имеются доказательства, что планы тела животных меняются с помощью мутаций, происходящих на разных уровнях регуляторной иерархии Hox62. По-видимому, некоторые из этих мутационных изменений возникают в цис-регуляторных последовательностях Hox генов, Напр., вариации в паттерне экспрессии UBX и ABD-A ортологов в разных группах ракообразных коррелируют с эволюцией из передних торакальных конечностей в специализированные пищевые придатки (maxillipeds)63. На микроэволюционном уровне, незначительные вариации в паттерне экспрессии UBX белка коррелируют с различиями в паттернах волосков на втором торакальном фемуре у близко родственных видов Drosophila64. Только немногие из множества исследований были посвящены выявлению взаимосвязи между изменениями паттерна экспрессии Hox и изменениями в формировании паттерна тела. Многие др. примеры может найти у Carroll et al.62
Имеется также вполне достаточно доказательств, что мутации в последовательностях Hox белков внесли вклад в морфологическое разнообразие во время эволюции65. Напр., две группы нашли скоррелированные и экспериментальные доказательства, показывающие, что между отдаленно родственными arthropods, различия в С-терминальных областях UBX белков, которые изменили их в более лучшие транскрипционные репрессоры, могли внести вклад в уменьшение количества конечностей во время эволюции насекомых от многоногих артропод66,67. В обоих случаях изменения функции UBX белка сопровождались изменениями их паттернов экспрессии в области туловища развивающихся эмбрионов. Наиболее впечатляющими находками эволюции изменений паттерна экспрессии Hox и изменений функции Hox-белков получены в исследованиях эволюционного происхождения у D. melanogaster гомеодоменовых генов bicoid
(bcd), zerknullt (zen), fushi tarazu (ftz) и even skipped
(eve)65. Все эти гены происходят из родоначальников Hox, но их функции сегодня у D. melanogaster варьируют в пределах от контроля ранней эмбриональной полярности (bcd) до количества сегментов (ftz и eve). Три из этих Hox производных всё ещё картируются в D. melanogaster Hox кластере (FIG. 1b).
Эволюция ftz из Hox5/6-подобного гена особенно интересна. У многих эмбрионов членистоногих, включая и некоторых насекомых, родоначальные ftz гены экспрессировались в виде Hox-подобных паттернов, но у жуков и мух паттерны экспрессии были вовлечены в умножение паттернов полос, характерных для генов, которые специфицируют количества сегментов68-72, в качестве противовеса сегментным качественным особенностям. Параллельно с этим изменением в эмбриональном паттерне экспрессии, кодирующая область ftz насекомых подверглась мутациям, которые элиминировали YWPM аминокислотный мотив (характеристика Hox класса гомеодоменовых белков) и добавили LXXLL мотив. Современные доказательства показывают, что эти изменения родоначального FTZ белка были таковы, что они потеряли свои функции спецификации качественных особенностей вдоль оси и приобрели способность регулировать количество сегментов у ранних эмбрионов73,74.
Все эти исследования показывают, что паттерны экспрессии Hox и функции белков Hox чрезвычайно лабильны для онтогенетических регуляторов высшего уровня. Было бы замечательно открыть механизмы, которые делают возможными подобные изменения функции Hox во время эволюции, не влияя на жизнеспособность и плодовитость.
Hox genes as microRNA targets
MicroRNAs (miRNAs) недавно открытый класс регуляторных молекул. Эти ~22-нуклеотидов РНК действуют на уровне транскриптов, которые генерируются с помощью RNA polymerase II в результате двухступенчатого процесса расщепления, катализируемого с помощью ядерной RNaseIII Drosha и цитоплазматической RNaseIII Dicer75,76. После процессинга зрелые miRNA упаковываются в функциональные RNA-INDUCED SILENCING COMPLEX (RISC). RISC может катализировать точное эндонуклеолитическое расщепление РНК мишеней, если они имеют безупречную или почти безупречную комплементарность с RISC-связанными miRNAs, или редуцируют продукцию белка с помощью неизвестных пост-транскрипционных механизмов, если имеется не точная комплементарность. Учитывая огромное количество идентифицированных miRNAs, известно пока немного мишеней in vivo. Однако, имеются указания на то, что Hox гены могут быть важным классом мишеней для miRNA.
Potential regulation of Hox by miRNAs. Получены доказательства пост-транскрипционной регуляции экспрессии Hox генов. Паттерны накопления мышиных HOXB4 белков и Hoxb4 транскриптов сходны в сомитах 7-13 и в задней части заднего мозга развивающихся эмбрионов, но транскрипты были также обнаружены и в задней части нервной трубки, тогда как белок нет77. Кроме того, имеются доказательства пост-транскрипционной регуляции HOXC6 в задних конечностях эмбрионов кур78. Имеются также доказательства пост-транскрипционой регуляции Sex combs reduced (Scr) отолога ракообразных Porcellio scaber, которая может быть связана с модификацией первого торакального сегмента, чтобы продуцировать GNATHAL APPENDAGES в противоположность ходящим ногам79. Неизвестно, являются ли эти расхождения между паттернами экспрессии транскриптов и белков результатом регуляции miRNA или др. механизмов, таких как локальная нестабильность белков.
Хотя немногие Hox гены регулируются пост-транскрипционно с помощью неизвестных механизмов, но многие Hox гены, как было предсказано in silico являются прямыми мишенями для miRNAs у позвоночных80 и беспозвоночных81. На базе частичной комплементарности между последовательностями miRNA и 3'UTR последовательностями, Enright
et al. предположили, что D. melanogaster Scr, Antennapedia
(Antp), Ubx, abd-A и Abd-B транскрипты являюдтся мишенями для регуляции с помощью miRNA81. Если это верно, то это должно указывать, что регуляция с помощью miRNA экспрессии Hox белков, по крайней мере у мух, является скорее правилом, чем исключением. Однако, оценка этих предполагаемых взаимодействий еще не произведена in vitro или in vivo.
Единственной оценкой Hox miRNA мишени является белок кодирующий Hox мышей Hoxb8. Транскрипт Hoxb8 содержит почти безупречный miR-196 сайт мишень на своем 3'UTR, a анализ мышиных эмбриональных RACE CLONES показал, что некоторые Hoxb8 транскрипты расщепляются эндонуклеолитически по сайту мишени для miRNA в 10 нуклеотидов82,83, что является типичным для сайтов с точной комплементарностью с miRNA регуляторами. Этот сайт мишень законсервирован в генах Hoxb8 позвоночных, но неизвестно, какое влияние осуществляет эта miRNA-обусловленная регуляция на осевую морфологию у позвоночных.
Помимо miR-196, др. miRNAs, которые кодируются внутри кластеров Hox генов также может быть регуляторами экспрессии Hox белков. Ген microRNA-10 (mir-10 у D. melanogaster) филогенетически законсервирован и присутствует в законсервированном положении у насекомых и позвоночных в Hox кластерах между генами Dfd/Hox4 и Scr/Hox5 (FIG. 2a). У млекопитающих ген mir-10a картирован по соседству с Hoxb4, a mir-10b по соседсу с Hoxd4. Ген mir-57 у C. elegans скорее всего является дивергировавшим ортологом mir-10 семейства (FIG. 2b), хотя он картируется на др. хромосоме, чем Нох гены C. elegans. Кроме того, по крайней мере, ещё один ген miRNA картируется среди задних Hox генов в геномах насекомых и позвоночных, но гены D. melanogaster mir-iab-4 и mir-196 miRNA ген позвоночных, по-видимому, не являются структурными ортологами, т.к. имеют только фрагментарное сходство последовательностей (FIG. 2b).
Expression patterns of Hox-complex miRNAs. Паттерны пространственной экспрессии Hox-кластерных miRNAs также показывают, что они играют роль в формировании A-P аксиального паттерна (FIG. 2c). Одним из способов выявления доменов экспрессии miRNAs является использование повсеместно транскрибируемого репортерного трансгена с 3' UTRs, которые содержат последовательности точной комплементарности к предполагаемым miRNA трансрегуляторам (miRNA сенсорам). Область тела, в которой экспрессия репортерного белка отсуствует, и будет представлять паттерн экспрессии miRNA, которая должна быть комплементарной сайту мишени84. Эта стратегия делает возможным грубок картирование функциональных доменов miR-10a и miR-196 у эмбрионов мышей83. Сенсор miR-10 показывает, что активность miR-10 присутствует в областях задней части торакса и животе, но не в голове и хвостовой почке. Это сходно с паттерном экспрессии соседнего гена, Hoxb4, что согласуется с возможность того, что они регулируются скоординировано83. Одним из ограничений современных исследований 'sensor' является трудность интерпретации 'negative' паттернов клеточного разрешения.
Первичные транскрипты miRNAs являются обычно более длинными, чем зрелые miRNAs75, a в условиях in situ гибридизации м
выявить эти синтезируемые (nascent) транскрипты в хромосомных сайтах их транскрипции. Этот м-д использован, чтобы выявить паттерн экспрессии D. melanogaster pri-mir-10 у ранних эмбрионов85.
Транскрипты pri-mir-10 выявлены в виде Hox-подобного паттерна, который занимает будущие торакальные и абдоминальные сегменты у эмбрионов на стадии бластодермы. Др. метод выявления паттерна экспрессии miRNA связан с использованием LOCKED-NUCLEIC-ACID OLIGONUCLEOTIDE PROBES86. Это позволило локализовать in situ большой субнабор транскриптов miRNA у зрелых рыбок данио87, включая miR-10a, miR-10b и miR-196a. Все три Hox miRNAs выявляются у эмбрионов рыбок данио в виде Hox-подобных паттернов в развивающемся спинном мозге и туловище, с экспрессией границ miR-10a и miR-10b кпереди от границ miR-196a. Сравнение этих трех работ показывает, что локализованная экспрессия miR-10 у эмбрионов мышей, рыбок данио и D. melanogaster выявляет их Hox-подобный паттерн экспрессии в задней части головы, торакальных и абдоминальных зачатках, законсервирована83,85,87.
Почему же гены mir-10, и вообще-то mir-196/iab-4,
были законсервированы в Hox кластерах во время расхождения
DEUTEROSTOME-PROTOSTOME? Это возможно как и для белок кодирующих генов Hox-кластеров потому, что они имеют отношение к регуляторным механизмам, т.к. обладают общими энхансерами и широко масштабной Polycomb-Trithorax-обусловленной репрессией и активацией88-90. Предполагается, что miRNAs происходят из инвертированный дупликаций 3' UTRs будущих генов мишеней91. Возможно, что существуют случаи для Hox miRNAs, особенно, если учесть, что они могут быть нацелены на соседние Hox-белок-кодирующие гены.
Не известны мутации, специфичные для mir-10, mir-196
или mir-iab-4 генов, и остается еще выяснить, кокое значение они могут иметь для регуляции формирования онтогенетического паттерна во время эмбриогенеза билатерально симметричных животных. Важно выявить роль этих высоко законсервированных miRNA генов, которые располагаются в Нох кластерах животных уже как минимум 550 миллионов лет. Очевидно, что избыток или потеря сайтов мишеней для Hox miRNA или изменения в пространственно временной экспрессии Hox-нацеленных miRNAs может быть важным способом регуляции Hox генов в развитии и эволюции животных.
Conclusions
We have discussed recent advances in four areas of
Hox regulatory biology. Although a few Hox realizator
genes have been identified that illustrate how Hox
genes accomplish their function of sculpting variations
on a basic segmental shape, many remain to be identified.
We think it entirely plausible that the number of
known Hox morphological effector genes will expand
until almost every gene that can mediate cell adhesion,
division, migration and so forth will be found to be
directly regulated by Hox proteins in some developmental
context.
Recent evidence has revealed a surprising lability
in Hox protein functions during evolution, and
this lability makes them the best current system for
understanding how transcription-factor functions
evolve in animals. As we have reviewed here, this
lability might be facilitated by their ability to interact
with a great range of binding sites within enhancers,
either with or without cofactors from the PBC and
MEIS families of proteins. From this perspective, the
difficulty with coming to a general understanding of
how different Hox proteins achieve their functional
specificity might simply be due to their basic principles
of operation. As Hox proteins operate in so
many different cell types and developmental stages,
selective pressure might have acted on their functions
so that they will observe as few ‘rules’ as possible,
allowing them to fit into nearly all developmental
genetic circuits to tweak morphology. To look at
this in anthropomorphic terms, it is amazing what
the Hox proteins can accomplish when they let the
tissue-specific transcription factors get the credit for
making muscle, bone, skin and nerve.
Сайт создан в системе
uCoz 
