MIXED-LINEAGE KINASE CONTROL OF JNK AND P38 MAPK PATHWAYS
Kathleen A. Gallo (gallok@msu.edu) & Gary L. Johnson Nature Reviews Molecular Cell Biology3,No 9, P 663-672 (2002),
Mixed-lineage kinases (MLKs) are serine/threonine protein kinases that regulate signalling by the c-Jun amino-terminal kinase (JNK) and p38 mitogen-activated-protein kinase (MAPK) pathways. MLKs are represented in the genomes of both Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. The Drosophila MLK Slipper regulates JNK to control dorsal closure during embryonic morphogenesis. In mammalian cells, MLKs are implicated in the control of apoptosis and are potential drug targets for many neurodegenerative diseases.
Box 3 | CEP-1347, a small-molecule inhibitor of MLKs
CEP-1347 is a derivative of the natural product K252a,
which was isolated from culture broths of Nocardiopsis.
CEP-1347 has been found to have important neuroprotective
properties, protecting primary neurons in culture from
neurotrophic-factor-withdrawal-induced apoptosis.
Furthermore, animal models of chemical-induced neural toxicity have
shown that CEP-1347 is an effective neuroprotectant in vivo.
CEP-1347 was found to block c-Jun amino-terminal kinase (JNK), but
not extracellular-signal-regulated-kinase 1/2 or p38 activation, in
response to trophic-factor withdrawal. However, this is not due to
the direct inhibition of JNK. Screening of upstream kinases in the
JNK pathway showed that CEP-1347 inhibited MLKs, but not the
mitogen-activated-protein kinase (MAPK) kinase kinases
apoptosis-inducing kinase or MEKK1.
In addition to trophic-factor withdrawal, other stresses including
ultraviolet-induced apoptosis were blocked by CEP-1347.
The studies with CEP-1347 support a role for MLKs in stimulating
JNK-regulated apoptosis. The obvious inference from the cumulative
evidence for JNK involvement in neurodegenerative diseases including
Huntington's, Alzheimer's and Parkinson's is that MLKs are logical
therapeutic targets in the prevention of neuronal cell death.
Indeed, CEP-1347 is currently in clinical trials for Parkinson's
disease.
The mixed-lineage kinases (MLKs) это семейство serine/threonine protein kinases, которые функционируют в модуле, чтобы контролировать активность специяических mitogen-activated-protein kinases (MAPKs) (Box 1). MAPK каскады существуют у всех эукариот и контролируют различные клеточные активности, включая митозы, запрограммированную гибель клеток, подвижность и метаболизм. Субстратами для MAPKs служат транскрипционные факторы, phospholipases, др. протеин киназы,ассоциированные с цитоскелетом белки и мембранные рецепторы.
Все известные MLKs млекопитающих действуют как MAPK-kinase kinases (MKKKs), активируя c- amino-terminal kinase (JNK) путь (Рис.1 ). JNKs являются MAPKs, которые были впервые охарактеризованы по их активации в ответ на -индуцированное ингибирование белкового синтеза. Далее было установлено, что эти киназы активируются в ответ на многие др. стимулы, вызывающие в клетках стресс, такие ка хитшок, ингибирование гликозилирования белков, воздействие воспалительных цитокинов и ультрафиолетовое облучение. Эти активируемые стрессами протеин киназы оказались связаны с фосфорилированием и увеличением транскрипционной активности c-Jun.
Как компонент , c-Jun регулирует транскрипцию цитокиновых генов и многих др. генов. AP-1 активируется внешнесредовыми стрессами, радиацией, цитокинами и ростовыми факторами, т.е. стимулами, которые активируют также JNKs. MLKs фосфорилирует и активирует MAPK kinases (MKKs), такие как и/или , которые, в свою очередь, активируют JNKs. Однако, существуют не только MLKs, которые м. активировать JNK путь; и др. MKKKs, включая MEK kinases (MEKKs), apoptosis-inducing kinase 1 () и transforming-growth factor β (TGFβ)-activated kinase 1 ().
При экспрессии в клетках млекопитающих, некоторые MLKs активируют p38. Путь p38 MAPK активируется с помощью многочисленных стимулов, включая многие цитокины и клеточные стрессы, которые активируют и JNKs. Т.к. с JNKs, и др. MKKKs м. активировать p38, включая TAK1, ASK1 и MEKK4.
Из 11 законсервированных субдоменов протеин киназ, субдомены I–VII у MLKs напоминают таковые у serine/threonine kinases, особенно MEKKs и Raf (на MKKK в MAPK/extracellular-signal-regulated kinase (ERK) 1/2 пути), тогда как субдомены VIII–XI скорее напоминают таковые tyrosine kinases, таких как fibroblast-growth-factor рецепторы и Src. Поэтому, когда MLK были клонированы, то hydroxyamino acid специфичность продуктов соотв. генов была неизвестна, поэтому они и получили название 'mixed-lineage kinase'. Однако, , как было установлено, фосфорилирует сериновые и треониновые остатки, и это указывает на то, что все MLKs являются bona fide серин/треониновыми киназами.
Three subfamilies of MLKs
Идентифицировано семь MLKs у млекопитающих. На основании расположения доменов и сходстве последовательностей их каталитических доменов этот кластер MLKs подразделен на три подгруппы: MLKs; dual-leucine-zipper-bearing kinases (DLKs); и zipper sterile-α-motif kinase (). Табл. 1 суммирует номенклатуру и синонимы членов семейства MLK, а распределение доменов в MLKs людей представлено на Рис. 2.
MLKs.
Первая подгруппа, которая включает –MLK4, характеризуется N-терминальным () , за ним следут последовательно киназный домен, leucine-zipper область и /Rac-interactive binding ; в соответствии со своим названием мотив взаимодействует с Rac и Cdc42. MLK1–MLK4 обладают 75% идентичных последовательностей внутри каталитических доменов и ~65% идентичных последовательностей от их SH3 домена до их CRIB мотива. С-концы этих белкоыв разошлись, это указывет на то, что эти области м. выполнять разные регуляторные функции, но все они богаты пролином. Их функции не установлены. MLK3 имеет Gly–Pro-rich N-конец, который отсутсвует у MLK1, или MLK4. Из подсемейства MLK только MLK2 (называемая также MKN28-derived serine/threonine kinase), MLK3 (называемая также SH3-domain-containing proline-rich kinase) и protein-tyrosine-kinase 1 хоть как-то были охарактеризованы биохимически.
DLKs.
Второе подсемейство MLK, DLKs, определяется по киназному домену, за которым следуют два leucine-zipper мотива, которые прерываются спейсером в 31 аминокислоту. , подобно MLKs, имеют богатый пролином С-конец, но его регуляторная функция не определена. Каталитические домены у двух членов семейства DLK человека, DLK (называемая также zipper (leucine) protein kinase и MAPK-upstream kinase) и leucine-zipper kinase () на 87% идентичны.
ZAKs.
Третья подгруппа MLKs представлена ZAK. ZAK отличается по присвтсвию и и sterile-α motif (). Домен SAM является независимо складывающимся модулем из ~70 аминокислот, которые обнаруживаются (обычно вблизи N- или С-конца) во многих сигнальных молекулах,включая рецепторные тирозин киназы, адапторные белки и GTPase-активирующие белки. Установлено, что SAM домены м. обеспечивать гомо- или гетеродимеризацию. В ZAK млекопитающих, домен SAM ZAKα изоформы находится в середине белковых последоватльностей. ZAKβ сплайс-вариант (известен также как MLK-like mitogen-activated-protein triple kinase-β (MLTKβ) и MLK-related kinase-β (MRKβ)) идентичен с N-конца zipper домену ZAKα, но затем дивергирует и заканчивается вскоре после этого, так что он лишен SAM домена (Рис. 2a).
Phylogenetic relationships.
Дендограмма киназных доменов MLKs показана на Рис. 2b. У Drosophila MLK, известная как (Slpr), содержит N-терминальный SH3 домен, киназный домен, leucine zipper и CRIB мотив, как и все подсемейство MLK. Slpr участвует в регуляции дорсального закрытия (dorsal closure) у эмбрионов мух. За исключением Slpr, нет ни генетических, ни биохимических данных об MLKs у низших эукариот. MLKs отсутствуют у дрожжей, но анализ NCBI (National Center for Biotechnology Information) базы данных белков показал, что по сходству последовательностей внутри каталитического и zipper доменов, и D. melanogaster и C. elegans имеют DLK гомологов. Кроме того, ZAK-подобная kinase, с полным каталитическим доменом, zipper мотивом и SAM доменом обнаружена у C. elegans.
C. elegans имеет также кодирующие последовательности для SH3-domain-содержащей kinase, каталитический домен которой наиболее сходен с большим семейством MLK, но эта протеин киназа не совсем сопоставима ни с одним из подсемейств MLK.
Regulation of MLKs by dimerization
Помимо сходства своих каталитических доменов все 7 MLKs содержат определенного типа лейциновую застежку (leucine zipper) (Рис. 2a). Лейциновые застежки обеспечивают димеризацию или олигомеризацию белков путем образования , которые стабилизируются в первую очередь с помощью лейцина или др. неароматических гидрофибных остатков, которые взаимодействуют сторонами (interfaces), противоположными спиралям. Т.к. zipper-регулируемая стоихометрия MLKs экспериментально не установлена, мы здесь использует понятие 'dimerization' для простоты. Лейциновые застежки MLK1–MLK4 обнаруживают ~70% идентичных последовательностей, но они только на 35% идентичны тем, что имеются у DLK и LZK, это указывает на то. что домены лейциновых застежек из разных подсемейств MLK м. регулировать избирательность межбелковых взаимодействий.
Homodimerization.
Димеризация является наиболее общим механизмом для активации протеин киназ, таких как growth-factor-receptor tyrosine kinases и c-.
Лейциновая застежка DLK необходима для DLK само-ассоциации, фосфорилирования,активации и стимуляции JNK пути. Мутантная LZK, у которой домен лейциновой застежки делетирован, указыват на то, что этот домен вероятно имеет ту же самую функцию и у этого белка. Модель, в которой лейциновая застежка у DLK обеспечивает гомодимеризацию и трансфосфорилирование, чтобы активировать киназу, подтверждается находкой, что индуцированная димерирзация мономерных DLK способствует аутофосфорилированию и активации JNK. Согласуется с этой моделью то, что трансфосфорилирование ведет к активации DLK лейциновой застежки, при избыточной продукции эффективно ингибирует димеризацибю и активацию DLK полной длины, возможно за счет образования неактивных комплексов leucine-zipper–DLK. Димеризация DLK не нуждается ни в киназной активности, ни в фосфорилировании DLK она функция DLK leucine zipper.
Подобно DLK, MLK3 димеризуется с помощью лейциновой застежкит, а делеция всей лейциновой застежки дает MLK3 вариант, неспособный к аутофосфорилированию и активированию JNK пути. Изучение форм MLK3, в которых leucine-zipper-обусловленная димеризация нарушена внесением дестабилизирующих остатков пролина, подтвержадет, что MLK3 димеризация необходима для активации JNK. Однако, эти мутанты MLK3, подобно версии дикого типа, все еще м.б. индуцированы к аутофосфорилированию с помощью активного Cdc42, но неспособны фосфорилировать остаток T258 (где T представлен threonine), один из двух сайтов, активирующих фосфорилирование в нижестоящей мишени, MKK4. Это указывает на то, что Cdc42 регуляция MLK3 не нуждается в стабильной leucine-zipper-обеспечиваемой димеризации, но что димеризация необходима для собственно взаимодействия и фосфорилирования субстрата.
Heterodimerization.
Лейциновая застежка DLK не образует эффективных гетеродимеров с др.MLK белками, это указывает на то, что вряд ли этот домен участвует в гетеродимеризации разных MLKs. Гетеродимеризация DLK и LZK связана с N-концом DLK , но не лейциновой застежкой. Однако, т.к. не выявлено прямого взаимодействия между N-концами DLK и LZK, то м. предполагать, что это взаимодействие является функцией промежуточного белка, такого как JNK-interacting protein 1 (), который м. сам по себе олигомеризоваться и который связывается с N-концами DLK и LZK. Эту функцию м. выполнять и др. белки.
SH3-mediated autoinhibition of MLK3
MLK1–MLK4 имеют N-терминальные SH3 домены, которые отсутствуют в др. подсемействах MLK (Рис. 2a). Предполагается, что SH3 домены рекрутируют MLK1–MLK4 на специфические белки, которые содержат определенные богатые пролином мотивы для локализации и регуляции передачи сигналов. Домен SH3 у MLK3 аутоингибирует собственную киназную активность, это впервые было усатновлено для SH3 домена в функционировании serine/threonine киназ. Разрушение SH3 домена MLK3, с помощью мутации в законсервированного остатка тирозина 52 на alanine, увеличивает киназную активность MLK3. Домен MLK3 SH3, по-видимому. связывается внутримолекулярно с областью между лейциновой застежкой и CRIB мотивом, а мутация здеть в одиночном пролине предупреждает SH3 связывание и увеличивает киназную активность. Следовательно, MLK3 аутоингибируется путем связывания своего SH3 домена с ауторегуляторными последовательностями, это сходно с аутоингибирующей функцией домена SH3 в Src семействе tyrosine kinases. Критический пролин в области, связывающей SH3, MLK3 законсервирован у MLK1, MLK2, MLK4 и Slpr, это указывает на то, что это подсемейство MLKs использует общий механизм SH3-опосредуемой аутоингибиции (Рис. 3).
Regulation by Rho GTPases
Семейство Rho малых GTPases, которое включает несколько Rho и Rac изоформ, и Cdc42, регулирует широкий набор клеточных процессов у эукариот, такие как контроль нормального и трансформированного роста, клеточная подвижность и цитоскелет. Rho-семейство GTPases модулирует также пути передачи сигналов протеин-киназ. Постоянно активные мутантные формы Rac и Cdc42 , как известно. активируют JNK и p38 protein-kinase каскады. Члены подсемейства MLK с SH3 доменом (MLK1–MLK4) содержат также центральный CRIB мотив. MLK3, которая содержит 6 из 8 законсервированных остатков в своем CRIB мотиве, соединяется с активированными формами Cdc42 и Rac. Когда MLK3 и активированнаная Cdc42 ко-экспрессируются, то увеличивается активность MLK3 и происхоит потенциирование MLK3-iиндуцируемой активации JNK, это согласуется с существованием Rac и/или Cdc42 вышестоящих активаиторов MLK3 на JNK пути.
Ко-экспрессия активированных Cdc42 и MLK3 способствует олигомеризации MLK3.
Кроме того, обнаруживаются изменения в паттерне in vivo фосфорилирования MLK3, когда она ко-экспрессируется с активированной Cdc42. Учитывая тесную близость CRIB мотива и аутоингибирующих SH3-связывающих последовательностей MLK3 (Рис. 3), взаимодействие Cdc42 с MLK3 м. нарушатьe SH3-обусловленное аутоингибирующее взамиодействие. Наконец, Rho-семейство GTPases ассоциирует с клеточными мембранами с помощью действительной пост-трансляционной . Активированные, GTP-связанные Cdc42 или Rac м. прекрасно направлять MLK3 в мембранные компартменты клеток для локализованной активации MAPK путей.
Физиологическое значение Rac и/или Cdc42 в регуляции активности SH3-содержащих MLKs подтверждается генетическими доказательствами, которые выявляют связь между Drosophila Rac () и SH3-domain-содержащей Slpr на JNK сигнальном пути. Более того, c Rac-специфическим (GEF) идентифицировал — a MAPK scaffold, который ассоциирует непосредственно с MLK3 и p38 — в качестве партнера по связыванию. Итак, JIP2 м. специфически координировать Tiam1/Rac-индуцированную MLK-активацию p38. Некоторые из идентифицированных GEFs м. активировать Rac и/или Cdc42, но их эффекты на MLK активность не исследованы. По-видимому, дискретные GTPase-зависимые сигнальные комплексы отвечают за пространственно-временной контроль передачи сигналов MAPK и др. клеточных функций, таких как изменение цитоскелетной архитектуры.
Regulation of MLKs by phosphorylation
Многие протеин киназы, включая MKKKs, регулируются с помощью фосфорилирования. Внутри их каталитического домена, активационная петля часто содержит регуляторные сайты фосфорилирования. Последовательность TTXXS (остьатки 277–281; где X это любая аминокислота, а S - serine) обнаружена в активационной петле MLK3. Мутагенные исследования подтвердили идею, что T277 и S281 являются позитивными регуляторными сайтами (auto)фосфорилирования. Т.к. последовательности S/TXXXS законсервированы в активационной петле у всех MLKs млекопитающих, то аналогичные остатки м. выполнять сходную функцию и у др. MLKs. Идентификация 11 in vivo
сайтов фосфорилирования MLK3 показала, что они формируют кластер на С-конце. Обнаружение, что пролиновый остаток непосредственно следует за 7 из идентифицированными сайтами, указывает на то, что MLK3 является мишенью нацеленных на пролин киназ, типа MAPKs и cyclin-dependent kinases. Одна из интересных возможностей заключается в том, что MLK3 активирует JNK (и/или p38) путь, который фосфорилирует MLK3 с помощью петли обратной связи. В самом деле, хотя точные места фосфорилирования не идентифицированы, MLK2 м.б. фосфорилирована в своей С-терминальной области с помощью JNK.
JIPs and MLKs
В соответствии со способностью MLKs активировать JNK путь, некоторые MLKs, включая MLK2 и MLK3, DLK и LZK взаимодействуют с JNK-pathway JIP1/islet-brain 1 () (Box 2). JIP1 связывается с MKK7, но не с MKK4, это указывает на то, что — по крайней мере в контексте JIP1-обеспечиваемой передачи сигналов — MKK7 имеет отношение к субстрату для MLK. Установлено, что JIP1 вероятно регулирует активацию DLK, предупреждая ее олигомеризацию, и что JIP комплекс является динамическим по природе и м. действовать как молекулярный переклчатель.
JIP2/ связывает JNK очень слабо, но связывает и при MLK-обусловленной активации p38 MAPK пути. Некоторая активация p38 с помощью DLK, MLK3, MLK2 и ZAKα наблюдалась в экспреиментах по трансфекции. Все это указывает на то, что JIP2 взаимодействет и с MLKs и p38, и что MLKs м. активировать и JNK и p38 пути.
Структурно отличающийся поддерживающий белок (scaffold) взаимодействует MLK3, MKK7, b .
Однако, JNK/stress-activated-protein-kinase-associated protein 1 (JSAP1), сплайс-вариант JIP3, связывает , MKK4 и JNK1/2. Разрушение гомолога Drosophila JIP3, известного как (Syd), ведет к деффекту -зависимого аксонального транспорта. Однако, не только Syd/JIP3, но и также JIP1 и JIP2взаимодействуют с компонентами кинезиновых моторных комплексов, это указывает на то, что JIPs м.ю. грузом для кинезином-обеспечиваемогог транспорта и м. выполнять сложую роль по субклеточной локализации и транспорту.
Slpr: the Drosophila MLK
У D. melanogaster, путь JNK регулирует процесс dorsal closure во время эмбриогенеза. Dorsal closure это процесс морфогенеза клеточных слоев, который связан с движением из латерального положения к дорсальной срединной линии и с заключением эмбриона в непрерывный защитный эпидермис. Изучение этого процесса у vs[ идентифицировало путь, который связан с GTPase dRac1, MKKKK названной Misshapen (), Slpr, MKK7 гомологом Hemipterous (), JNK гомологом Basket () и AP-1 транскрипционными факторами и dFos, который кодируется (kay) (Рис.4). Мутационный анализ этого пути выявил функцию Slpr в морфогенезе слоев эпидермальных клеток.
Slpr регулируется вышестоящими GTPase, dRac1 и Msn. Ген slpr функционально выше hep и bsk на Drosophila JNK пути. JNK выполняет две регуляторные функции во время морфогенеза слоев эпителиальных клеток. Одна - это контроль экспрессии AP-1-опопсредованных генов. Decapentaplegic () является Drosophila гомологом bone morphogenic protein 4 (), члена TGFβ семейства цитокинов. Во время dorsal closure, dpp экспрессируется в ведущем крае эпидермиса и нуждается в передаче сигналов JNK и в активации AP-1 для своей экспрессии. Мутации в гене slpr нарушают экспрессию dpp в ведущем крае эпидермиса во время dorsal closure, это согласуется с потрей функции JNK и AP-1 у slpr-мутантных эмбрионов. Второй установленной функцией передачи сигналов JNK во время dorsal closure является контроль растянутой морфологии эпителиальных клеток. Инициация этой функции, однако, не подавлена у slpr-мутантных эмбрионов, хотя клетки не м. поддерживать растянутую морфологию и округляются. Роль JNK в этом процессе изучена плохо, но тот факт, что slpr-мутантные эмбрионы дефектны по этому процессу указывает на роль MLK в контроле формы эпителиальных клеток во время dorsal closure.
JNK участвует не только в dorsal closure эмбрионов, но также в морфогенезе взрослых, плоскостной полярности эпителия, innate иммунитете и апоптозе у мух. Slpr, по-видимому, не нужен для JNK регуляции плоскостной полярносити эпителия или innate иммунитета. Регуляция innate иммунного ответа у мух связана с , а др. MKKKs , по-видимому, контролируют JNK путь во время установления поскостной полярности. Эти исследования четко указывают на участие MLK в контроле JNK пути в специфических регуляторных процессах у эмбрионов Drosophila, которые связаны с контролем экспресси генов и формы клеток.
MLKs in mammalian cells
MLKs определенно регулируют JNK путь и в клетках млекопитающих. Но пока не получено целенаправленного разрушения генов семейства MLK. Поэтому функциональный анализ MLKs в клетках млекопитающих ограничивается экспреиментами по трансфекции и использованию CEP-1347, низкомолекулярного ингибитора MLKs (Box 3).
MLK3 and transformation.
JNK, как полагают, участвует в клеточных трансформациях, это согласуется с доказательствами того, что AP-1 транскрипционный комплекс вносит вклад в трансформации и туморогенез. Избыточная продукция дикого типа MLK3 трансформирует NIH3T3 фибробласты, тогд как каталитически неактивная MLK3 не трансформирует. Пока нет доказательств, что какой-либо член чемейства MLK функционирует как онкоген у людей. Но показано, что MLK3 ингибирует Rac-обусловленную клеточную трансформацию. Потенциальная роль, если такая есть, MLKs в канцепрогенезе пока не установлена. Ингибиторы MLKs м. помочь решить этот вопрос на моделях опухолей человека у .
MLK3 and nuclear factor κB.
Избыточная экспрессия MLK3 в стимулирует транскрипцию цитокина tumour necrosis factor α () и interleukin-2 (IL-2). Каталитически неактивная MLK3 не стимулирует активность промотора TNFα или IL-2, а ингибирует -стимулированную продукцию IL-4. Ядерный фактор κB (NF-κB) активируется также в Jurkat cells, которые избыточно продуцируют MLK3. Каталитически неактивная MLK3 осбабляет frnbdyjcnm NF-κB
репортерного гена в ответ на T-клеточную стимуляцию, но не в ответ на TNFα или IL-1. Эндогенная MLK3 фосфорилируется в ответ на T-клеточную стимуляцию, но не меняет активности репортерной MLK3. Все это указывает на то, что MLK3 м.б. вовлечена в T-клеточную активацию в ответ на поступление антигена.
Др. MKKKs, которые регулируют JNK путь (включая MEKK1, MEKK2, MEKK3 и TAK1), активируют NF-κB. TAK1? по-видимому, играет превалирующую роль в активации с помощью IL-1 NF-κB. Неясно, имеют ли MEKKs или MLKs отношение к физиологическим регуляторам NF-κB.
Neuronal apoptosis.
Подавление ростовых факторов ведет к апоптозу нейронов in vivo и in vitro. Показано, что c-Jun необходим для neuronal growth factor (NGF)-deprivation-induced апоптоза нейронов. Ингибирование функции c-Jun с помощью c-Jun или ядерных инъекций анти-c-Jun антител защищает нейроны от NGF-deprivation-индуцированной гибели. Помимо регуляции c-Jun, JNKs, по-виимому, регулируют активность специфического -семейства белков, которые контролируют интеграцию митохондрий и высвобождение цитохрома c.
Исследования нервной системы показали, что MLK2, MLK3 и DLK м.б. важными MKKKs, которые обеспечивают индуцированный депривацией трофического фактора нейрональный апоптоз. Избыточная экспрессия MLK2, MLK3 или DLK в PC12 клетках индуцируют апоптоз. NGF-удалением-индуцированный апоптоз симпатических нейронов superior cervical ganglion (SCG) нуждается в функциональной активности Cdc42 и активации JNK. Если нейроны SCG лишены NGF, то обнаруживается повышенная активность MLK3 киназы и активация JNK, но неясно, может ли удаление NGF влиять на уровень MLK3 белка. Избыточная экспрессия MLK3 в нейронах SCG активирует JNK и индуцирует апоптоз. Напротив, каталитически неактивная мутантная MLK3 блокирует апоптоз нейронов SCGв ответ на удаление NGF. Очевидно, что MLK3 активируется в ответ на удаление NGF и что MLK3 — или родственная MKKK — участвует в активации JNK в ответ на удаление NGF withdrawal.
Jnk3-нокаутные мыши обнаруживают снижение чувствительности к kainate-индуцированным эпилептическим судорогам и нейрональному апоптозу, это напоминает фенотип у мышей, у которых отсутствует рецептора kainate glutamate-receptor 6 () субъединица. Устойчивость к нейрональной excitotoxicity у GluR6-deficient и Jnk3-/- мышей указывает на потенциальную связь между активацией GluR6 и Jnk3. Избыточная экспрессия или MLK2 или MLK3 у крыс в линии клеток гиппокампа HN33 индуцирует апоптоз, тогда как каталитически неактивный мутант MLK2 или MLK3 супрессирует GluR6-индуцированный апоптоз таких клеток. Белок пост-синаптических уплотнений PSD-95 соединяет MLK2 и/или MLK3 с GluR6 рецепторным комплексом в HN33 клетках. MLK2 и MLK3 м.б. ко-иммунопреципитированы с PSD-95 из HN33 клеток и лизатов головного мозга крыс, это указывает на то, что они существуют в комплексах в клетках. PSD-95 — благодаря своему SH3 домену — связывает MLK2 и MLK3,а делеция PSD-95 SH3 домена устраняет PSD-95 ассоциацию с MLK2 и MLK3. Наконец, делеция PSD-95-связывающего сайта GluR6 ингибирует GluR6-индуцируемую JNK активацию и апоптоз HN33 клеток. Все это указывает на то, что PSD-95 связан через JNK путь с GluR6 за счет связывания MLK2 и/или MLK3. MLK2 и MLK3 регуляция активации JNK в нейронах определенно функционирует независимо от индукции апоптоза. Передача сигналов JNK очевидно выполняет множество функций, которые связаны с контролем нейронального гомеостаза. В случае удаления NGF апоптическая реакция, по-видимому, доминирует частично из-за того, что потеря pro-survival сигналов ведет к активации Akt, pro-survival фактора.
Polyglutamine-expanded huntingtin.
Болезнь Huntington's это нейродегенеративное нарушение, характеризующееся умственной отсталостью, choreiform движениями и нарушением познавательнос способности. Ген, отвечающий за б-нь Huntington's повсеместно экспрессируется и кодирует в 350-kDa
цитоплазматический белок . Белок huntingtin обнаруживается в телах нейронов,дендритах и нервных окончаниях в ассоциации с синаптическими пузырьками и микротрубочками. Измененияе в гене HUNTINGTIN, ассоциированные с болезнью, затрагивают экспансию полюглютаминовых участков вблизи N-конца гена huntingtin и длина полиглютаминового расширения коррелирует с тяжестью болезни.
Белок huntingtin иммунопреципитируется с MLK2 в ко-трансфицированных 293T клетках и HN33 клетках. Домен SH3 MLK2 соединяется с богатым пролином N-концом huntingtin. Рolyglutamine-expanded версия huntingtin, однако, неспособна связывать MLK2 и активировать JNK и индуцировать апоптоз. Однако, каталитически неактиная форма MLK2, MKK4 или MKK7 снижает активность JNK и апоптоз, индуцируемый этим вариантом huntingtin. Предполагается, что в нормальных нейронах MLK2 секвестрируется в неактивной форме за счет связывания ее SH3 домена на N-конце huntingtin, и что при б-ни Huntington's неспособность polyglutamine-expanded huntingtin взаимодействовать с MLK2 высвобождает MLK2, которая активируется и индуцирует JNK-обусловленный апоптоз (Рис. 5). В подтверждение этой модели, экспрессия N-конца нормального huntingtin защищает HN33 клетки от токсичности, индуцируемой MLK2, и мутантной формы huntingtin. содержащей 48 полиглютаминовых повторов. Эти находки согласуются с предположением, что huntingtin's является негативным регцлятором MLK2. Однако, неспособность MLK2 взаимодействовать с polyglutamine-expanded huntingtin м.б. просто обусловлена агрегацией disease-associated формы huntingtin. Polyglutamine-expanded huntingtin возможно оказывает и др. доминантные эффекты, ведущие к патологии б-ни Гентингтона.
Future directions
MLKs является важным семейством MKKKs. MLKs регулирует JNK путь, а некоторые MLKs, такие как DLK и MLK3, регулируют и p38 путь. MLKs м. рассматриваться как привлекательные мишени для терапии болезней, таких как Huntington's. Однако, остается много нерешенных вопросов. Почему существует 7 членов семейства MLK, также как и MEKKs, ASK1 и TAK1, регулирующие JNK и p38 пути? Разлдичия в регуляторных доменах, имеющиеся в MLKs. указывают на то, что эти белки, по-видимому, регулируются по-разному, разными вышестоящими стимулами и участвуют в избирательных взаимодействиях с др. белками, которые направляют MLKs в разные субклеточные компартменты.
Судя по гену Slpr важного для экспрессии гена dpp и эмбрионального морфогенеза у дрозофилы, MLKs д. выполнять сходную рольи в клетках млекопитающих, т.е. участвовать в контроле экспресси генов в ответ на действие цитокинов в разных типах клеток. MLK1–MLK4 регулируются с помощью Cdc42/Rac и их активация, по-видимоу, скоррдинирована с регуляцией цитоскелета; для DLK и ZAK подсемейств это менее очевидно. Некоторые члены MLK, по-видимоу, участвуют в эмбриональном развитии, тогда как др. возможно функционируют в первую очередь в дифференцированных типах клеток. Необходим таргетинг генов для каждого MLK.
Ассоциация MLK белков, но не др. MKKKs, с JIPs очень важна. JIPs взаимодействуют с белками, такими как kinesin motor комплексы, рецепторы и регуляторы Rho GTPases, которые указывают на то, что MLKs м.б. вовлечены в регуляцию передачи сигналов JNK и p38 во время везикулярного транспорта, эндоцитоза и сборки цитоскелета. MLK2 кроме того взаимодействуют с клатрином ивлияют на транспорт клатрином покрытых пузырьков. Могут ли MLKs функционировать, регулируя MAPK пути, только если они в комплексах с или вблизи JIPs, или они м. также передавать сигналы независимо от JIPs. Низкомолекулярные ингибиторы JNKs, p38 и MLKs поступили на клиническое исследование при разных заболеваниях: JNKs и p38 в первую очередь при опухолях и воспалениях, a MLKs при нейродегенеративных заболеваниях.
