Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling
Andrea Page-McCaw, Andrew J. Ewald and Zena Werb Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 221-233 (March 2007) | doi:10.1038/nrm2125
Matrix metalloproteinases (MMPs) were discovered because of their role in amphibian metamorphosis, yet they have attracted more attention because of their roles in disease. Despite intensive scrutiny in vitro, in cell culture and in animal models, the normal physiological roles of these extracellular proteases have been elusive. Recent studies in mice and flies point to essential roles of MMPs as mediators of change and physical adaptation in tissues, whether developmentally regulated, environmentally induced or disease associated.
Обнаружение члена семейства matrix metalloproteinase (MMP), collagenase произошло в 1962 Gross and Lapiere, которые установили, что хвосты головастиков во время метаморфоза содержат энзим, который д.деградировать 1,2. Затем была найдена interstitial collagenase, collagenase-1 или в больной коже и синовиальной оболочке3. In vitro, MMP1 вызывает деградацию нативных фибриллярных коллагенов, критических компонентов (ECM) позвоночных, путем расщепления пептидных мостиков между Gly775-Ile776 или Gly775-Lys776 в нативных типа I, II или III молекулах коллагена3,4. Дальнейшие исследования привели к открытию семейства структурно родственных proteinases (23 у человека, 24 у мышей), сегодня обозначенных как семейство MMP.
Интерес к MMPs возрос в конце 1960s и начале 1970s после наблюдения, что MMPs позитивно регулируются при разных болезнях людей, включая rheumatoid arthritis и рак. Важно, что высокие уровни MMPs часто коррелируют с плохим прогнозом у пациентов (rev. Ref. 5). Однако, недавние клинические данные показали, что взаимоотношения между MMPs и болезнями не простые; напр., повышенная активность MMP может усиливать прогрессирование опухолевого роста или может ингибировать его (rev. Ref. 6). Эти сложные взаимоотношения между экспрессией MMP и раком усилили интерес к пониманию функции MMP in vivo, и сфокусировали также внимание на MMPs и патологии и значительно меньше внимания было уделено нормальным ролям этих энзимов.
MMPs in vivo: analysis of MMP mutants
Анализ генетических нокаутов MMPs открыл возможности идентифицировать существенные функции MMP и оценить кандидаты субстраты благодаря анализу продуктов расщепления в контроле и нерасщепленных белков у мутантных животных. Получено по меньшей мере 14 MMP мутантов у мышей. Инициальные характеристики выявили неожиданно довольно слабые фенотипы, все MMP-нокаутные линии доживали до рождения (Table 1). Возможным объяснением этой кажущейся необязательности MMPs во время эмбрионального развития может быть , и , хотя возможно, что MMPs вообще не важны вплоть до окончания эмбрионального развития. MMPs имеют множество перекрывающихся субстратов in vitro5, указывая тем самым на возможное генетическое перекрывание in vivo. В самом деле, избыточность была продемонстрирована и недавней генерацией двойных мутантов MMP7,8. Компенсация была продемонстрирована также в семействе MMP9,10.
MMPs являются членами metzincin группы proteases, которые названы из-за иона цинка и законсервированного остатки Met в активном сайте11,12. В недавней работе предложена унифицированная номенклатура peptidase13, согласно которой MMPs включают M10A подсемейство, M10 семейство и MA клан metallopeptidases. MMPs млекопитающих обладают общей законсервированной доменовой структурой (Fig. 1), которая состоит из и аутоингибирующего . Про-домен содержит законсервированный остаток Cys, который координирует цинк активного сайта, чтобы ингибировать катализ. Когда про-домен или дестабилизируется или удаляется, то активный сайт становится способным расщеплять субстрат. Большинство членов семейства MMP содержат также hemopexin домен, прикрепленный к их С концам с помощью гибкого шарнира. кодирует четырех-лопастную β-пропеллерную структуру, которая обеспечивает межбелковые взаимодействия. Этот домен вносит также вклад в распознавание собственного субстрата, активацию энзима, локализацию protease localization, интернализацию и деградацию14. Структуры каталитического и hemopexin доменов некоторых MMPs, включая MMP1, , и (известно также как membrane type 1 MMP (MT1-MMP)), выяснены (rev. Refs 13, 15). MMP2 и MMP9 имеют также fibronectin type II повторы, которые обеспечивают связывание с коллагенами, они вставлены в каталитический домен. Большинство MMPs являются секретируемыми белками; однако, имеются 6 MT-MMPs: MMP14, , и , имеющие трансмембранные домены и короткие цитоплазматические хвосты; и , имеющие glycosylphosphatidylinositol (GPI) сцепления. Также является type II трансмембранным белком. Активность MMPs контролируется на многих уровнях (Box 1).
Functions of MMP proteolysis. Исторически считалось, что MMPs функционируют в основном как энзимы. которые деградируют структурные компоненты ECM. Однако, MMP протеолиз может создавать пространства для миграции клеток, может продуцировать специфические фрагменты после расщепления субстрата с независимой биологической активностью, может регулировать тканевую архитектуру благодаря эффектам на ECM и межклеточные соединения, и может активировать, деактивировать или модифицировать активность сигнальных молекул как непосредственно, так и опосредованно16 (Fig. 2). Т.к. клетки обладают рецепторами (напр., integrins) для структурных компонент ECM, то MMPs могут также влиять на клеточные функции по регуляции ECM белков, с которыми клетки взаимодействуют17. Во многих случаях MMP расщепление ECM субстратов генерирует фрагменты, которые обладают др. биологическими активностями в отличие от предшественников. Напр., расщепление laminin-5 или collagen IV приводит к экспозиции скрытых сайтов, которые способствуют миграции18,19. Деградация типа I collagen, которая осуществляется с помощью MMP1 необходима для миграции эпителиальных клеток и заживления ран в культуральных моделях20. Расщепление белков ECM с помощью MMPs может также высвобождать ECM-связанные факторы роста, включая insulin growth factors и fibroblast growth factors21,22. Наблюдаются и альтернативные механизмы действия, включая функциональные межмолекулярные MMP комплексы: MMP14 соединяется с (TIMP2), который соединяется с pro-MMP2, позиционируя тем самым её для активации с помощью второй молекулы MMP14 (Ref. 23). Более того, MMP11 человека обладает альтернативной сплайс-изоформой, которая функционирует как внутриклеточная proteinase и вступает в ядро24.
MMP субстратами являются пептиды ростовых факторов, tyrosine kinase рецепторы, молекулы клеточной адгезии, цитокины, хемокины, а также др. MMPs и неродственные proteases (Box 2). MMPs и родственное семейство proteinases, ADAMs (a disintegrin and metalloproteases) и ADAM-TSs (ADAMs with thrombospondin repeats), являются важными для сбрасывания белков. связанных с плазматической мембраной. ADAMs и ADAM-TSs участвуют в удалении ростовых факторов, которые синтезируются как формы предшественников, связанных с клеточной мембраной, включая heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF), neuregulin, amphiregulin и transforming growth factor-α (TGFα)25-28. Расщепление др. мембранных белков, таких как E-cadherin и CD44, приводит к высвобождению специфических, биологически активных фрагментов их внеклеточных доменов и к усилению инвазивного поведения29,30. Адгезивные молекулы клеточной поверхности, такие как syndecan-1, также теряются с помощью растворимых и мембранных MMPs31,32. MMP9 и MMP12 вносят вклад в протеолитическое удаление lipopolysaccharide (LPS) рецептора CD14, и, следовательно, влияют врожденную защиту хозяина33. TGFβ является ещё одним важным MMP субстратом, активация которого часто меняет миграцию клеток; напр., MMP9 ограничивает миграцию роговичного эпителия путем активации TGFβ34. MMP2 и MMP9 могут высвобождать TGFβ из неактивного внеклеточного комплекса, который состоит из TGFβ, TGFβ latency-associated protein (который является про-доменом TGFβ) и латентного TGFβ-связывающего белка35.
Техническое ограничение недавних подходов таково, что MMPs часто экспрессируются как изолированные каталитические домны бел своих субстрат-распознающих hemopexin доменов. Такие каталитические домены способны расщеплять сотни субстратов in vitro, включая почти все компоненты ECM.
MMPs in bone modelling and remodelling
Кости являются важным местом, испытывающим тканевое ремоделирование во время развития, гомеостаза и репарации. Кости развиваются в соответствие с одним из трех самостоятельных процессов: , (Fig. 3a) или . Ключица и некоторые кости свода черепа развиваются с помощью интрамембранозной оссификации, при которой мезенхимные предшественники дифференцируются непосредственно в . Аппендикулярный и осевой скелет, включая длинные кости, развиваются с помощью эндохондральной оссификации, при этом хрящевая матрица формируется первой и затем резорбируется и замещается минерализованной костью. Хрящевые клетки или хондроциты дифференцируются и замещаются в , где они следуют стереотипической прогрессии пролиферации, дифференциации, гипертрофии, ангиогенной инвазии и апоптозу. При pseudo-metamorphic оссификации хрящевая матрица функционирует в качестве временной формы для придания формы откладывающейся кости. Даже после того, как кости сформированы они постоянно ремоделируются в течение всей жизни.
Loss of MMP9 is associated with growth-plate defects. Первым онтогенетическим фенотипом у MMP-нокаутных мышей был дефект эндохондральной оссификации длинных костей36. Делеция Mmp9 приводит к экспансии зоны гипертрофических хондроцитов в ростовой пластинке36 из-за неспособности к апоптозу (Fig. 3b). Соотв. MMP9 субстратом, по-видимому, является galectin-3, lectin с анти-апоптической активностью, которые может секретироваться и локализуется в ECM. MMP9 расщепляет и инактивирует galectin-3. В самом деле, galectin-3-мутантные мыши обладают дефектами ростовой пластинки, которые противоположны дефектам у Mmp9-дефицитных мышей, с преждевременным апоптозом гипертрофических хондроцитов37. Нерасщепленный galectin-3 также специфически обогащен в ростовой пластинке Mmp9 мутантов. Нерасщепленный galectin-3, добавленный экзогенно к эксплантам костей дикого типа. вызывает экспансию ростовых пластинок, которая сходна с фенотипом Mmp9 мутантов, тогда как расщепленный galectin-3 не оказывает эффекта38.
MMP9 экспрессируется также на высоком уровне во время заживления кости после переломов, а переломы костей у Mmp9-мутантных мышей залечиваются более медленно. Экзогенный vascular endothelial growth factor (VEGF) устраняет дефекты репарации, указывая тем самым, что процессинг с помощью MMP9 фактора VEGF может быть скорость ограничивающим при репарации кости39. Mmp9-нулевые животные залечивают стабилизированные переломы посредством эндохондральной оссификации скорее, чем посредством интрамембранозной оссификации как у дикого типа мышей39, указывая тем самым, что разные механизмы используются для заживления переломов в отсутствие MMP9.
MMP13 functions in bone formation and remodelling.Mmp13 мутанты обнаруживают экспансию зоны гипертрофических хондроцитов и задержку апоптоза, указывая тем самым, что MMP13 необходим для перехода от хряща к кости в ростовых пластинках длинных костей7,40 (Fig. 3b). MMP13 расщепляет type II collagen и in vivo, а продукты этого расщепления могут быть распознаны в плотной зоне, которая находится непосредственно дистальнее зоны оссификации и ангиогенеза. Первычный дефект у Mmp13 мутантов связан с неспособностью хондроцитов ремоделировать ECM, который богат type II collagen и aggrecan. Расщепление коллагена не происходит в отсутствие MMP13, тогда как MMP13 и MMP9 расщепляют aggrecan. Продукт расщепления aggrecan отсутствует у двойных Mmp9 Mmp13 мутантов7. Ничего не значит, что нет фенотипических проявлений замещения эндогенного aggrecan аггреканом, который устойчив к расщеплению с помощью MMP cleavage, это указывает на то, что существуют др. механизмы удаления aggrecan при переходе от хряща к кости41.
Вторая функция MMP13 в развитии длинных костей проявляется во время оссификации. Хрящевой ECM становится каркасом для минерализации, формирования скелетных игл (spicules) или . Mmp13 мутанты обладают нерегулярно оформленными трабекулами, демонстрируя, что MMP13 необходима для их инициального моделирования7. MMP13 участвует также в постоянном ремоделировании трабекул; Mmp13 мутантны обнаруживают аномальное увеличение трабекулярной костной массы, которая сохраняется во взрослом состоянии. Условные Mmp13 мутации в костях или хрящах обнаруживают, что регуляция апоптоза гипертрофических хондроцитов с помощью MMP13 и инициальная MMP13-обусловленная трабекулы-моделирующая функция проявляется в хондроцитах. MMP13-обусловленная ремоделирующая функция, которая регулирует костную массу располагается в остеобластах. Следовательно, MMP13 участвует в формировании кости как в ростовой пластинке, так и трабекулах, и в ремоделировании кости.
MMP14 deficiency results in lethality. MMP14 выполняет различные роли в развитии скелета. Mmp14 нокауты не только летальны для MMP-мутантных мышей; мыши нормальны при рождении, но у них развиваются множественные аномалии и они погибают в течении 3-12 недель42,43. Mmp14 мутантны в основном дефектны по ремоделированию соединительной ткани. Потеря ECM-деградирующего энзима, как и ожидалось, д.вызывать повышенное отложение кости; парадоксально, но Mmp14 мутанты вместо этого обнаруживают вторичные эффекты повышенную резорбцию кости и дефектные центры вторичной оссификации42,43. Остеогенные клетки от Mmp14-мутантных мышей не могут деградировать коллаген и не формируют кость, будучи трансплантированными подкожно иммунодефицитным мышам42. Всё это строго подтверждает физиологическое значение данных in vitro, которые показали. что коллаген типов I, II и III являются субстратами для MMP14 (Ref. 44).
Some initial bone modelling is also dependent on MMP14. Псевдо-метаморфная форма развития кости была открыта только после обнаружения аберрантной резидуальной хрящевой ткани у Mmp14 мутантов45. У мышей дикого типа некоторые кости свода черепа и диафизы длинных костей формируются остеобластами, которые откладывают минерализованную кость в тесной близости к пред-существующему хрящу, который функционирует как форма и позднее подвергается апоптозу. Такое развитие кости путем замещения ювенильной ткани взрослой тканью, процесс сравнимый с метаморфозом. В отсутствие MMP14, такие хрящевые матрицы сохраняются.
Mmp2- Mmp14-нулевые мыши погибают при рождении8. Такие двойные мутанты напоминают значительно более старых Mmp14 одиночных мутантов, указывая тем самым, что MMP2 и MMP14 функции перекрываются. Ясно, что MMP14 активирует MMP2, т.к. активность MMP2 редуцируется, но не элиминируется у Mmp14-нулевых мышей43,46. Однако, др.активаторы также существуют, возможно включая MMP15 и MMP16. Наконец, MMP14 выполняет MMP2-независимые роли в ремоделировании кости и соединительной ткани и во время ангиогенеза8,43,46.
Human MMP mutations lead to defects in bone development. Три болезни скелета у людей связаны с мутациями потери функции MMP. Это редкий остеолитический синдром, вызываемый мутациями MMP247, Missouri вариант spondyloepimetaphyseal dysplasia (SEMD), который вызывается точковыми мутациями в MMP13 (Ref. 48) и дефект зубной эмали amelogenesis imperfecta, вызываемый мутациями splice-акцептора в MMP20 (Ref. 49).
Хотя Mmp2-нокаутные мыши имеют слабые дефекты скелета50, человеческие MMP2 мутанты имеют osteolytic (vanishing bone) синдром, который связан с прогрессивной деструкцией и резорбцией кости, а также с карликовостью и артритами47. Дефекты при этом синдроме сходны с фенотипом Mmp14-мутантных мышей. Т.к. у мышей Mmp14 наблюдается парадокс, мутация потери функции в ECM-деградирующей protease вызывает скорее, чем ингибирует деградацию кости. Этот фенотип коррелирует с избыточным количеством , которые могут компенсировать первичную неспособность к др. типа деградации ECM.
Сходство между болезнью у людей, вызываемой MMP2 мутациями, и Mmp14-нокаутными мышами чрезвычайно интересно в свете биохимического взаимодействия между этими двумя протеазами. Связанная с мембраной MMP14 активирует секретируемую MMP2 путем расщепления её про-домена51,52. В самом деле активная MMP2 существенно снижена у Mmp14-нулевых мышей, это строго указывает на то, что MMP2 является in vivo субстратом для MMP14 (Ref. 43). Следовательно, ясно, что MMPs выполняют множество разных ролей в развитии костей.
MMP2 and MMP3 in mammary development
Сеть эпителиальных протоков молочных желез значительно расширяется во время полового созревания в ответ как на локальные, так и системные сигналы53 (Fig. 4a). Этот процесс нуждается в деградации базальной мембраны и ECM, реструктуировании эндогенной сосудистой сети и крупно-масштабном эпителиальном морфогенезе - все эти процессы предполагают участие MMP.
Комбинированный фармакологический и генетический анализ MMP2 и MMP3 выявил роль MMP активности во время развития молочных желез54. Морфогенез ветвления в молочных железах происходит с помощью двух разделенных в пространстве и времени механизмов: элонгации (TEB) и . Длина сети молочных протоков устанавливается посредством инвазии TEBs в жировые подушечки молочных желез. Вторичные веточки инициируются с боков от основных протоков. Mmp2- и Mmp3-нулевые молочные железы дают реципрокные фенотипы в морфогенезе ветвления. Mmp2-нулевые молочные железы дефицитны по инвазии TEB, но дают избыток вторичных веточек, тогда как Mmp3-нулевые молочные железы имеют нормальную инвазию, но характеризуются дефицитом вторичного ветвления54 (Fig. 4b). Ингибирование MMP функции с помощью химического ингибитора (GM6001) приводит к дефициту первичной инвазии и избытку вторичных веточек. Избыточная же экспрессия дефектной первичной инвазии сопровождается избытком вторичных веточек. Избыточная экспрессия эндогенного MMP ингибитора TIMP1 ограничивает TEB инвазию, но оказывает минорный эффект на вторичное ветвление54. Эти наблюдения ведут к модели, согласно которой MMP2 способствует инвазии протоков и ингибирует вторичное ветвление, тогда как MMP3 способствует инициации вторичного ветвления.
MMPs in blood-vessel remodelling
Анализ широкого ранга мутаций MMP показал, что развитие эмбриональных сосудов протекает нормально, а дефекты обнаруживаются при нормальном и патологическом постнатальном ремоделировании сосудов и ангиогенезе (Table 1). Эти данные указывают на то, что MMPs могут играть специфическую роль в постнатальной обработке, ремоделировании и неоангиогенезе, но не в исходном конструиировании эмбриональной сосудистой сети.
Mmp9-мутантные мыши обнаруживают дефекты ангиогенеза в ростовых пластинках длинных костей36. Сходным образом Mmp14-мутантные мыши, лишенные соотв. сосудистой инвазии во вторичные центры оссификации, несмотря на нормальные уровни VEGF и его рецептора VEGFR2 (известного также как FLK1) (Ref. 43). Это отсутствие сосудистого роста воспроизводится в экспериментально индуцированном 43, который вызывает рост новых кровеносных сосудов у контрольных мышей. Но рост кровеносных сосудов не наблюдается у Mmp14 мутантов43, он редуцируется, но не элиминируется у Mmp2-мутантных животных55. В модели вызванных лазером повреждений, дегенерации сетчатки, неоваскуляризация редуцируется у одиночных Mmp2 и Mmp9 мутантов и строго редуцируется у двойных Mmp2 Mmp9 мутантов, указывая тем самым, что эти MMPs обладают перекрывающим действием56. Mmp2 Mmp14 двойные мутанты также обнаруживают дефекты развития сосудов, сключая капилляры с чрезвычайно малыми просветами. Эти дефектные кровеносные сосуды достаточны для поддержания эмбрионального роста и развития, но не для постнатального выживания.
Как MMPs участвуют в ремоделировании сосудов? Возможные механизмы включают протеолиз типа I collagen, модификацию передачи сигналов platelet-derived growth factor (PDGF), регуляцию и процессинг VEGF. Инвазирующие кровеносные сосуды в постнатальных тканях наталкиваются на ECM, который богат type I collagen, белком, который слабо экспрессируется у эмбрионов. Когда контрольные экспланты аорты помещали в трехмерный коллагеновый матрикс57, то они давали ответвления новых сосудиков и проникали в коллагеновый матрикс зависимым от ростового фактора способом. Mmp14-нулевые экспланты не давали отростков новых сосудиков и не проникали в коллагеновый матрикс, в то время как экспланты от Mmp2- и Mmp9-нулевых мышей были неотличимы от контрольных эксплантов. Однако, когда Mmp14-нулевые экспланты помещали в фибриновый матрикс (сходный с временным ECM в ране), то они формировали капилляры, демонстрируя матричную специфичность. Итак, MMP14 вносит вклад в постнатальное сосудистое развитие путем расщепления type I collagen; относительное отсутствие type I collagen у эмбрионов может частично объяснить отсутствие дефектов эмбриональных сосудов.
MMP9 и MMP14 оказывают и др. эффект на васкулатуру: периваскулярные (или гладкомышечные) клетки, которые покрывают эндотелиальные клетки кровеносных сосудов отсутствуют или их плотность существенно снижена в нормальных сосудах и во время опухолевого неоангиогенеза57-59. Этот дефект особенно очевиден в малых артериолах головного мозга, а многие из оставшихся периваскулярных клеток имеют нерегулярную морфологию. Этот фенотип сходен с тем, который имеют мыши со слабыми PDGF-B аллелями. Передача сигналов, которая происходит ниже PDGF, ослаблена у Mmp14-нулевых мышей, a PDGF receptor-β (PDGFRβ) ко-иммунопреципитируется с MMP14, демонстрируя, что они формируют физический комплекс60. Эти данные указывают на новую и прямую функцию MMP14 в передаче сигналов PDGF.
MMPs and VEGF signalling. MMP процессинг VEGF может играть важную роль в физиологическом и опухолевом ангиогенезе. VEGF хранится внеклеточно: после секреции VEGF соединяется с ECM, откуда он д.быть высвобожден, чтобы инициировать ангиогенез61. Малые insulinomas формируются постоянно в RIP1-Tag (rat insulin promoter 1-T-antigen) панкреатических островках мышей, моделирующих рак, но только 1-2% из них развивается в ангиогенные аденомы и карциномы62. Несмотря на непрерывную экспрессию VEGF и его рецептора, VEGFR2, пригодность VEGF ограничена, он не может связаться со своим рецептором в pre-angiogenic опухолях. MMP9 мобилизует VEGF и инициирует ангиогенез. Важно, когда мутации Mmp9 попадают на RIP1-Tag фон, то немногие опухоли становятся ангиогенными, подтверждая тем самым роль MMP9 в мобилизации VEGF63.
MMPs могут расщеплять VEGF, отделяя макрикс-связывающий домен от рецептор-связывающего домена. Нерасщепленный VEGF обнаруживается на высоком уровне, по крайней мере, в одной MMP9-мутантной постнатальной ткани, в зоне гипертрофических хондроцитов38, это указывает на то, что VEGF является важным нижестоящим эффектором и возможно субстратом для MMP9. Укороченный VEGF оказывает др. эффекты на кровеносные сосуды опухолей по сравнению с нерасщепленным VEGF; укороченный VEGF увеличивает диаметр сосудов, тогда как неспособный к расщеплению VEGF усиливает прорастание восудов64. Mmp9-нулевые мыши обладают дефектной пост-эмбриональной новой васкулаторой, это указывает на то, что у мышей дикого типа постнатальные кровеносные сосуды реагируют по-разному на расщепленную и нерасщепленную форму VEGF. Вообще-то функция иницииации прорастания сосудов для нерасщепленного VEGF является единственной функцией VEGF, необходимой у эмбрионов; однако, эта функция VEGF не затрагивается у Mmp9-мутантных эмбрионов.
MMPs regulate tissue remodelling in flies
Хотя двойные мутанты у мышей доживают до рождения7,8,56, невозможно нокаутировть все MMPs у мышей, чтобы проверить роль семейства MMP в целом. Экспрессия и ингибирование MMP были исследованы во многих др. модельных системах, включая Xenopus laevis65,66, гидр67, рыбок данио68-70 и Caenorhabditis elegans71,72; у C. elegans генетический анализ показал, что MMP червя вносит вклад в онтогенетически регулируемые события клеточной инвазии71. D. melanogaster имеет меньше всего MMPs по сравнению с др. изученными модельными системами, только две MMPs73,74, и были получены мутанты, которые лишены обоих генов75. D. melanogaster MMP двойные мутанты устранили мнение о перекрывании и компенсации.
D. melanogaster MMP гены, и , сохраняют законсервированную MMP доменовую структуру, а DmMmp2 кодирует также предсказанный GPI мембранный якорь73,74 (Fig. 1). Хотя ни один из генов мух не имеет ни единого ортолога среди MMPs млекопитающих (несмотря на номенклатуру), TIMP мух может ингибировть MMPs млекопитающих76 и TIMPs млекопитающих могут ингибировать MMPs мух74, указывая на консервативность этих систем. Двойные мутанты по нулевым аллелям могут заканчивать эмбриональное развитие и могут частично проходить через личиночные стадии, время сильного роста. Даже если материнский вклад обоих MMP генов устранен у двойных мутантных эмбрионов, то MMPs не нужны для жизнеспособности и морфогенеза до средины личиночного развития75. Следовательно, эксперименты на мухах подтверждают и расширяют результаты с MMP-мутантами млекопитающих, они указывают, что семейство MMP специализируется на ремоделировании скорее, чем на регуляции инициальных клеточных и тканевых миграций, необходимых во время эмбриогенеза. Ничего не стоят, однако, эксперименты по morpholino-ингибированию, показавшие, что MMPs существенны для формирования осей у рыбок данио70.
Потеря DmMmp1 ведет к дефектам ремоделирования трахей. Каковы же фундаментальные роли MMPs, если организм, который лишен MMPs может завершать эмбриогенез? Хотя одиночные и двойные мутанты мух могут расти до личиночных стадий, их фенотипы показывают, что даже у насекомых MMPs участвуют в ремоделировании тканей. DmMmp1 мутанты неспособны ремоделировать дыхательные трубочки, известные как трахеи. Трахеи являются системой разветвленных взаимосвязанных трубочек, которые делают возможной диффузию кислорода ко всем внутренним тканям; во время нормального личиночного роста трахейные трубки вырастают в 14 раз в длину и в7-40 раз в диаметре77. У DmMmp1 мутантов по мере роста личинок трубочки трахей не могут расти соответственно, они несоответственно растягиваются в течение нескольких дней, они рвутся из-за натяжения (Fig. 5a). Эти трубочки не могут также соответственно расширяться и обнаруживают нехарактерные сужения. На клеточном уровне видно. что эпителиальные клетки, которые составляют трубочки не могут высвободить свое прикрепление к ECM, что и заставляет трубочки вытягиваться75.
Недавно идентифицирован новый сигнальный белок, который возможно участвует в нормальном ремоделировании трубочек трахей78. Этот сигнальный белок, Ninjurin A, физически ассоциирует с DmMMP1 и ко-локализуется с ним на поверхности клеточек трахей. В клеточной культуре эктодомен Ninjurin A ectodomain расщепляется белком DmMMP1 и клетки с высвобожденными эктодоменовыми сигналами теряют слипчивость. Скорее всего, что у личинок DmMMP1 высвобождает эктодомен Ninjurin A, это служит сигналом для потери клетками слипчивости с кутикулой трахей78. Семейство белков Ninjurin было идентифицировано впервые благодаря своей позитивной регуляции в поврежденных нейронах крыс. Следовательно, возможно, что этот новый субстрат для MMP, эктодомен которого функционирует в качестве ранее не предполагаемого межклеточного сигнала, законсервирован у насекомых и млекопитающих.
DmMmp2 is required for tissue histolysis. Потребность в DmMmp2 у D. melanogaster напоминает оригинальное участие MMP в метаморфном гистолизе хвоста головастиков. Подобно лягушкам, метаморфоз насекомых нуждается в значительном гистолизе ткани и этот гистолиз нуждается в MMP: у DmMmp2 мутантов ткани, которые обычно предназначены для гистолиза сохраняются. DmMmp2 необходим также для слияния двух эпителиальных слоев, которые встречаются по срединной линии мух во время метаморфоза, т.к. мутантны обнаруживают щель в тораксе75 (Fig. 5b). Дальнейшие исследования по идентификации клеточных дефектов у таких мутантов могут пролить свет на роль MMPs в др. событиях слияния эпителиев, таких как образование нёба.
То что эмбриональное развитие может успешно завершаться без функции MMP не устраняет возможности, что MMPs обычно участвуют в эмбриогенезе. Дальнейший анализ поможет выявить специфические функции MMP, которые не существенны или которые могут быть затемнены адаптивным развитием. Напр., DmMMP2 экспрессируется в ЦНС во время развития и во время выроста моторных нейронов, DmMmp2-мутантные аксоны некстати теряют слипчивость др. с др. Эти данные указывают на то, что MMPs расщепляют субстрат, который важен для наведения аксонов(A.P.-M. and H. Broihier, unpublished results).
Недавние исследования на мухах были сфокусированы на роли MMPs в метастазировании опухолей и было установлено, что DmMmp1 вносит существенный вклад в инвазивность опухолей79,80. Кроме того, плодовые мушки открывают возможности для дальнейшего генетического скрининга в качестве метода для дальнейшей идентификации новых субстратов и путей, метода, недоступного в системах млекопитающих. Уже сегодня эксперименты на мухах генетически идентифицировали ограниченную роль семейства MMP в эмбриогенезе, они проливают свет на критическую роль MMPs в тканевом ремоделировании и открывают новые консервативные субстраты, напр., Ninjurin сигнальный белок.
MMPs in inflammation and wounding
Роль MMPs не ограничивается процессами развития и эксперименты с мутантными мышами начинают обнаруживать, что MMPs необходимы также для поддержания гомеостаза в ответ внешнесредовые воздействия, такие как ранения и инфекция81.
MMP7 is involved in innate immunity and wound healing. MMP7 (или matrilysin) по-видимому, не участвует в развитии и не экспрессируется на высоких уровнях во время эмбрионального развития. В здоровых тканях взрослых MMP7 экспрессируется только в слизистом эпителии и позитивно регулируется и протеолитически активируется в ответ на бактериальные воздействия в эпителии82. В согласии с этим паттерном экспрессии мутантные Mmp7 мыши более легко инфицируются кишечными бактериями. Эта чувствительность частично вызывается неспособностью Mmp7 мутантов протеолитически активировать эндогенный антибиотический пептид, pro-cryptdin. In vivo, предшественник, но не зрелые формы cryptdin обнаруживаются в выборках кишечного эпителия Mmp7-мутантных мышей83.
MMP7 is also required for wound healing. Эпителиальные клетки по краям раневых трахейных эксплантов мигрируют навстречу др. др. и сливаются. MMP7, по-видимому, обеспечивает индуцированную ранением миграцию эпителия путем расщепления E-cadherin84. MMP7 ко-локализуется с E-cadherin и отщепляет его внеклеточный домен в раневом эпителии, это приводит к разрыхлению межклеточных соединений. У пораненных Mmp7-мутантных мышей эпителиальные клетки не мигрируют и не происходит расщепления E-cadherin85. MMP3 также участвует в заживлении эпидермальных ран, кожные раны у Mmp3-мутантных мышей заживают более медленно, чем у контрольных мышей из-за дефицита формирования actin purse-string86.
Pro-inflammatory and anti-inflammatory MMP functions. Повреждения и инфекция индуцируют воспаление, др. физиологическую реакцию в ответ на средовые воздействия, которое нуждается в MMPs. Легочный эпителий контролирует рекрутирование воспалительных клеток в альвеолы благодаря продукции хемоаттрактантов, после повреждения, инфекции или воздействия аллергенов или химикалий. Повреждения заставляют лейкоциты мигрировать через эпителий в альвеолярные воздушные пространства в ответ на градиент хемоаттрактанта. Трансмембранный heparan sulphate proteoglycan syndecan-1 секвестрирует многие хемокины. Образование градиента хемоаттрактантов нуждается в MMP-обусловленном отщеплении эктодомена syndecan-1. Последующее высвобождение хемокина и обусловливает миграцию лейкоцитов в воздушные пространства и заживление эпителия. В отсутствие MMP7, нейтрофилы остаются вне эпителия в поврежденном легком и последующее обусловленное воспалением легочное повреждение затухает32. Миграция нейтрофилом дефектна у мутантов Mmp7 из-за отсутствия neutrophil attractant CXC-motif ligand-1 (CXCL1; известного также как keratinocyte-derived chemokine (KC); или GROα у людей) в жидкости просветов альвеол. Итак, повреждения способствуют экспрессии MMP7, а MMP7 расщепляет syndecan-1, а syndecan-1 фрагмент высвобождает CXCL1, который рекрутирует нейтрофилы.
MMPs can be both pro-inflammatory and anti-inflammatory. MMPs облегчают рекрутирование воспалительных клеток87, 88 and clearance of inflammatory cells89-91 путем расщепления воспалительных медиаторов, вызывающих тонко регулируемую воспалительную реакцию92. Несколько хемокинов, включая C-C motif ligand-7 (CCL7) и CXCL12 (Ref. 92), являются субстратами для MMP2. MMP9 расщепляет и активирует CXCL6 и CXCL8 (известен также как interleukin-8 (IL8)), в то же время он инактивирует CXCL1 и CXCL4 (Refs 93, 94). В моделях астмы эозинофилы от Mmp2- или Mmp9-дефицитных мышей неспособны мигрировать в воздушные пути и накапливаются в интерстициуме, тем самым обусловливая предрасположенность животных к асфиксии95,96. MMP2 и MMP9 участвуют в регуляторной петле, которая препятствует аллергическому воспалению. Накопление эозинофилов в интерстиции может быть обяснено нарушениями трансэпителиальных градиентов хемокинов, что влияет на CCL7 (известен также как MCP3 или MARC), CCL11 (известен также как eotaxin) и CCL17 (известен также как TARC). MMP2 и MMP9 вызывают также процессинг S100A8 и S100A9, двух neutrophil- и macrophage-специфических хемоаттрактантов, которые обнаруживаются в бронхоальвеолярной жидкости астматических мышей97. Эти MMPs устанавливют градиент хемоаттрактантов, который необходим для очистки легких от воспалительных клеток и для предупреждения летальной асфиксии. У мышей, моделирующих аутоиммунное пузырчатое (blistering) заболевание кожи, bullous pemphigoid, Mmp9-нулевые мыши обнаруживают снижение рекрутирования нейтрофилов и неспособность давать эпидермальные пузыри
Этот дефект обусловлен отсутствием инактивации ингибитора α1-proteinase с помощью MMP9, это не позволяет функционировать elastase нейторофилов98.
Укорочение происходящего из макрофагов CCL7 с помощью MMP2 и MMP14 приводит к образованию пептидов, которые могут соединяться с CC хемокиновым рецептором и функционировать как антагонисты99-101. Ограниченный N-терминальный протеолитический процессинг CXCL8 и CXC хемокина LIX (мышиный эквивалент CXCL5 и CXCL6)с помощью MMP9 и MMP8, соотв., вызывает генерацию хемоаттрактантов, которые более мощные, чем молекулы полной длины102,103. Соотв., Mmp8-нулевые животные104 защищены от tumour necrosis factor-α (TNFα)-индуцируемого летального гепатита из-за нарушения высвобождения LIX и нарушения притока лейкоцитов в печень103. Трипептидные хемоаттрактант нейтрофилов N-acetyl Pro-Gly-Pro, происходящий из разрушенного ECM, обладает общими последовательностями и структурной гомологией с важным доменом в α-chemokines и вызывает хемотаксис посредством CXCR2 (Ref. 105).
MMPs in human inflammatory disease models. Многие патологии человека имеют воспалительный компонент, как это имеет место у модельных мышей. Один и тот же MMP может выполнять разыне роли в разных условиях. Напр., MMP9 вносит вклад в воспаление у мышей, моделирующих инсульты, сердечные атаки, б-нь Алцгеймера и некоторые аспекты астмы и др. легочных воспалительных болезней, аневризмы аорты, и аутоиммунных энцефаломиэлитов9,106-110; однако, она действует как противовоспалительные агент в моделях воспалительных заболеваний кожи и почек89,111,112. Имеющиеся данные показывают, что MMP12 вносит вклад в эмфизему113,114, в то время как MMP3 и MMP9 вносят вклад в кожные воспалительные заболевания89,115. Напротив, MMP8 защищает от кожных воспалительных реакций104, а MMP2 защищает от воспаления головной и спинной мозг116. Всё это указывает на то, что MMPs действуют не перекрываясь, чтобы регулировать воспаление, это может иметь большое значение для медицины. В самом деле, прогрессирование опухолей также запускает воспаление и согласно клиническим наблюдениям MMPs позитивно регулируются в раковых опухолях5 это может отражать роли MMPs в запуске и контроле воспаления.
Conclusions and future directions
The MMP family of extracellular proteinases is present in most multicellular organisms, including plants and animals13. MMP function can be most simply analysed in D. melanogaster, which has only two MMP genes. The fly mutants demonstrate that MMPs are dispensable, both individually and together, for embryonic fly development, but are crucial for tissue growth and tissue–ECM remodelling in the larvae and during larval development. In mammals, the 24 MMP genes seem to share redundant functions. Analysis of single-MMP-mutant mice (Table 1) has identified developmental phenotypes in postnatal mammary, skeletal and circulatory development, three prominent sites of postnatal tissue and ECM remodelling. A particularly striking aspect of these phenotypes is that MMPs are not required to build blood vessels or bones in the embryo, but are required for their postnatal development and tissue remodelling. Examination of mouse mutants also reveals an important function of MMPs in regulating tissue response to environmental challenges, such as wounding, infection and inflammation. The genetic analysis from humans and model systems argues for a crucial role for MMPs as active regulators of postnatal tissue development, tissue remodelling and tissue repair in response to injury, infection or disease.
Current efforts to delete the remaining mouse MMPs and continuing analyses of existing mutants will reveal how MMPs are deployed in development and disease. Further studies with compound knockouts might yield lethal phenotypes, thereby revealing essential roles in development. Complementing the analysis of compound mouse mutants will be experiments that use pharmacological manipulations of both individual and classes of MMPs, as well as analyses in other genetically tractable model systems. Biochemical challenges include the visualization of MMP activity in living cells and tissues, the development of non-cleavable substrates and the determination of the complete in vitro MMP 117. An important question is the extent to which MMPs have a structural role in remodelling tissues versus a role in regulating access to signalling molecules.
Another challenge is to determine the relative importance of extracellular proteolysis in general, and MMP-mediated proteolysis in particular, as a post-translational regulatory mechanism in development and disease. Which stages in normal development, which cellular processes and which signalling pathways are strongly influenced by MMPs? A key to answering these questions will be to increase our understanding of the relevant in vivo substrates for specific MMPs. The challenge is to link our in vitro understanding of potential functions of MMPs with an in vivo understanding of how MMPs function in a given cellular process. Joining together biochemical approaches and MMP genetics with mutant substrates should make it possible to make progress on this important problem.
Conceptually, one of the main advances in MMP biology has been the realization that extracellular proteolysis need not simply be a mechanism of destroying structure or information. Instead, diverse studies demonstrate that MMPs can release growth factors from the ECM and cell surface, activating latent proteins and generating new bioactive molecules through proteolysis (Box 2). We view extracellular proteolysis as another form of post-translational modification. From this perspective, proteolysis can function to destroy a protein, but it can equally provide a mechanism to grant cells conditional access to a particular signalling molecule. Significantly, the products of MMP cleavage can function locally (for example, cleavage of E-cadherin) or at a long distance from the site of proteolysis (for example, chemokine activation). Given that many MMP phenotypes have been observed in the remodelling of tissues that do not require MMPs for their initial formation, it is tempting to speculate that MMPs might function specifically as regulators of post-embryonic cell motility and tissue architecture.
