Посещений:
PBXs Белки

Роль в Развитии и Органогенезе

PBX proteins: much more than Hox cofactors
AUDREY LAURENT, REJANE BIHAN, FRANCIS OMILLI, STEPHANE DESCHAMPS and ISABELLE PELLERIN
Int. J. Dev. Biol. 52: 9-20 (2008) doi: 10.1387/ijdb.072304al

Pre-B cell leukaemia transcription factors (PBXs) were originally identified as Hox cofactors, acting within transcriptional regulation complexes to regulate genetic programs during development. Increasing amount of evidence revealed that PBX function is not restricted to a partnership with Hox or homeodomain proteins. Indeed, PBXs are expressed throughout murine embryonic development and are involved in several developmental pathways including Hox-independent mechanisms. This review summarizes what is known about PBX partnerships and proposes to position PBXs as central developmental factors whose role consists of integrating transduction signals, in order to regulate gene expression programs during development.
PBX1 (pre-B-cell leukaemia transcription factor 1) был первоначально идентифицирован как протоонкоген лейкемии людей, индуцируемой с помощью экспрессии онкогенного слитого белка E2a-PBX1 (Kamps et al., 1990, Nourse et al., 1990). PBX1 классифицирован в особый субкласс гомеодоменовых белков, обозначаемых как семейство PBC, в соответствии с законсервированным PBC мотивом на N-конце их гомеодомена. Этот PBC субкласс принадлежит к сверхсемейству TALE, характеризующимся Three-Amino-Acid Loop Extension внутри гомеодомена у этих белков. Субкласс PBC представлен белками Pbx1, Pbx2, Pbx3 (Monica et al., 1991) и Pbx4 у млекопитающих (Wagner et al., 2001), Lazarus или Lzr у рыбок данио (Popperl et al., 2000, Waskiewicz et al., 2001), а также как Extradenticle (или Exd) у Drosophila и Ceh-20 у Caenorhabditis elegans (Shanmugam et al., 1999, Shen et al., 1999). Было продемонстрировано, что PBC белки способны взаимодействовать с субнабором Hox белков и в качестве таковых рассматриваются как важные Hox кофакторы, участвующие в регуляции генов онтогенеза (rev. Mann and Affolter, 1998, Moens and Selleri, 2006). Затем PBC белки были исследованы в отношении их взаимодействий в Hox белками. Однако, растет число доказательств, что Pbx функция не ограничена партнерством с Hox или гомеодоменовыми белками.
В самом деле, взаимодействующие с Pbx белки были в дальнейшем идентифицированы как участвующие в сборке и/или регуляции цитоскелета (Huang et al., 2003). В недавнем двугибридном скрининге, осуществленном в нашей лаб. только 6% предполагаемых Pbx1 партнеров соответствовало гомеодоменовым белкам и лишь 18% транскрипционным факторам (Fig. 1). Это увеличивающееся количество не-гомеодоменовых транскрипционных факторов среди Pbx1 партнеров подчеркивает, что Pbx белки выполняют более широкую роль во время развития, чем только как кофактор Hox. Мы полагаем, что позиция Pbx белков как центральных онтогенетических факторов согласуется с их интегрирующими трансдукционными сигналами за счет взаимодействия с многочисленными белками, чтобы регулировать программы генной экспрессии во время развития.

In the beginning, there were the Hox proteins


Hox белки образуют семейство транскрипционных факторов, которые специфицируют передне-задние характеристики во время развития во всем животном царстве и характеризуются очень высокой консервацией ДНК-связывающего мотива, наз. гомеодоменом. У млекопитающих 39 Hox генов классифицированы в 13 групп паралогов внутри 4-х отдельных кластеров (A, B, C и D). Хотя эти белки способны запускать очень специфические программы развития, все они соединяются in vitro со стержневой последовательностью TAAT, появляющейся приблизительно раз на каждые 500 пар оснований внутри генома (Galant et al., 2002). В самом деле, попытки идентифицировать in vivo гены мишени с помощью Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) экспериментов показали. что эти белки соединяются с ДНК широко, с TAAT последовательностями (Carr and Biggin, 1999, Walter et al., 1994, Williams et al., 2005). Чтобы объяснить этот кажущийся парадокс между низкой ДНК специфичностью этих белков и их способностью запускать определенные программы развития, было предположено, что уровень Hox белков более важен, чем их природа, т.е. эти белки были столь сходны, что они могли быть взаимозаменяемы (Duboule, 2000). Эта теория или "количественная модель" согласуется с некоторыми элегантными gene-swapping экспериментами, показавшими общую функциональную эквивалентность между Hoxa3 и Hoxd3 у мышей, у которых кодирующие последовательности двух генов паралогов были взаимозаменимы (Greer et al. , 2000). Т.к. эта функциональная эквивалентность подчеркивает критическую роль количественной модуляции экспрессии Hox генов, то др. данные четко демонстрируют, что биохимические свойства Hox белков имеют значение для их функции. Напр., мыши, у которых Hoxa11 homeobox был замещен на Hoxa13 homeobox, обнаруживают аномальное развитие зачатков конечностей и зародышевого тракта самок. В частности, гистология матки напоминает таковую cervix и vagina, т.е. приводит к фенотипу, который соответствует гомеозис-подобной задней трансформации (Zhao and Potter, 2001). Эти данные иллюстрируют, что некоторые отличия в гомеодомене, который является сильно консервативным мотивом, ведут тем не менее к регуляции разных генетических программ. Собственно говоря, даже легкие различия в аминокислотных последовательностях между Hox белками могут влиять на их нахождение генов и/или свойства регуляции транскрипции и/или может быть более важным их связь с кофакторами.
Чтобы идентифицировать кофакторы, вносящие вклад в специфичность Hox, различные исследователи изучали мутации Drosophila, которые затрагивают формирование эмбрионального паттерна. Используя генетический скрининг, было продемонстрировано, что продукт гена extradenticle (exd) кооперирует с Hox белками во время развития (Rauskolb et al., 1995, Rieckhof et al. , 1997). Гомологи этого гена Drosophila были исследованы у разных организмов и соотв. белки были помещены

Fig.1. Identification of Pbx1 partners. Using the full-length Pbx1b protein as bait in a yeast two-hybrid screen, positive clones were selected by their ability to activate reporter genes. True positive clones were then discriminated from false positives by GST-pull down analysis. Plasmid DNAs corresponding to putative Pbx1 partners were purified, sequenced and identified by Blast analysis. The different putative partners were classified according to their biological functions.

в PBC субкласс семейства TALE, который включает Pbx1, как лучше всего охарактеризованный у млекопитающих член. При исследовании мутантов Drosophila , которые фенокопируют exd мутантов, был окрыт ген homothorax (hth) и было продемонстрировано его участие в функции exd (Rauskolb et al., 1995, Rieckhof et al., 1997). Этот ген и его гомологи у позвоночных, Meis и Prep, кодируют белки, которые были классифицированы в др. субкласс белков TALE , обозначенный как Meis/Prep (=PKNOX1) субкласс (Burglin, 1997). Эти последние белки участвуют в ядерном таргетинге (Abu-Shaar et al., 1999, Berthelsen et al., 1999, Rieckhof et al., 1997) и стабильности (Waskiewicz et al., 2001) белков Pbx.
В то время как TALE кофакторы без сомнения увеличивали специфичность Hox ДНК связывания (Hox/Pbx ДНК сайты появляются каждые 420,000 пары оснований), их повсеместная экспрессия ставит два вопроса, которые лишь частично рассматривались в последнее время. Во-первых, необходимо знать, как эти белки участвуют в спецификации региональных характеристик и могут ли они сами по себе тонко регулироваться и/или ассоциировать с более специфически экспрессируемыми факторами. Во-вторых, необходимо выяснить их роль в эмбриональных регионах, которые не экспрессируют генов Hox.

Pbx and Hox partnership


Некоторые биохимические и генетические подходы показали, что Pbx1 и Exd взаимодействуют физически с Hox белками, формируя транскрипционные комплексы, которые модулируют регуляцию генов мишеней (rev. Moens and Selleri, 2006). Гетеродимер Hox/Pbx соединяется кооперативно с сайтами двухсоставной мишени на ДНК, увеличивая сродство связывания и специфичность каждого белка на промоторах генов. Точнее, PBC белки соединяются с Hox белками из групп паралогов с 1 по 10 (Chang et al., 1995, Mann and Chan, 1996). Это взаимодействие обеспечивается путем соединения небольшого tryptophan-содержащего мотива внутри Hox белка с гидрофобным карманом, образуемым PBC белками. Этот мотив известен как "hexapeptide", "pentapeptide" или "YPWM", недавно был обозначен как PID (PBC Interaction Domain) (In der Rieden et al., 2004). Однако, т.к. PID мотив определенно участвует в связывании Hox/Pbx, то возможно, что физическое взаимодействие более сложное, чем предполагалось ранее. В самом деле, недавний структурно-функциональный анализ показал, что Exd способен связывать Hox белки в отсутствие hexapeptide мотива (Galant et al., 2002, Merabet et al., 2003).
Сложность и разнообразие взаимодействия Pbx/Hox базируется не только на множественном партнерстве между Pbx и многочисленными членами семейства Hox,но и также на существовании различных изоформ Pbx белков. В самом деле,наиболее изученные Hox/Pbx взаимодействия выполнялись с Pbx1 или Exd белками, в то время как др. PBC белки, как предполагалось, ведут себя идентично. Однако, даже легкие отличия последовательностей между членами семейства Pbx могут приводить к крупным модуляциям in vivo экспрессии Hox/Pbx генов мишеней. Биохимическая характеристика Pbx белков, также как и анализ потери функции генов, могут предоставить определенные ключи для понимания генной регуляции, запускаемой с помощью этих гомеодоменовых белков.

Several Pbx proteins and isoforms


Гены Pbx1, Pbx2, Pbx3 и Pbx4 кодируют продукты, которые обладают значительной идентичностью последовательностей как внутри, так и на флангах своих ДНК-связывающих гомеодоменов (до 97% внутри гомеодоменов) (Monica et al., 1991). Некоторые из этих генов дают несколько изоформ за счет альтернативного сплайсинга. В самом деле, Pbx белки возникают из по разному сплайсированных транскриптов Pbx, давая большие (Pbx1a, Pbx2, Pbx3a and Pbx4) и короткие (Pbx1b, Pbx3b, Pbx3c and Pbx3d) формы соотв. белков (Monica et al., 1991, Wagner et al., 2001, Milech et al., 2001). Базируясь на биохимических исследованиях, возможно четко различать разные Pbx белки и изоформы. Во-первых, Pbx белки не обладают в точности теми же самыми ДНК связывающими свойствами. Хотя Pbx белки распознают те же самые консенсусные последовательности ДНК in vitro, Pbx1 не способен соединяться с ДНК сам по себе, в то время как Pbx2 и Pbx3 соединяются с ДНК без партнеров (Neuteboom and Murre, 1997). Во-вторых, когда была исследована способность Pbx белков гомодимеризоваться, используя подходы in vitro, то полученные данные оказались противоречивыми. Некоторые авт. продемонстрировали, что только Pbx3 способен гомодимеризоваться, будучи связанным с ДНК (Neuteboom and Murre, 1997), др. установили, что Pbx1a и Pbx1b эффективно гомодимеризуются как и Pbx3 (Calvo et al., 1999). Хотя этот аспект гомодимеризации Pbx не был исследован далее, он д. играть роль в генной регуляции благодаря конкуренции между разными партнерами. В самом деле, некоторые исследования, посвященные значению гомодимеризации для др. гомеодомен-содержащих транскрипционных факторов, таких как Oct1 (Poellinger and Roeder, 1989), Paired (Wilson et al., 1993), Cdx2 (Suh et al., 1994), Even-skipped (Hirsch and Aggarwal, 1995), Mix1 (Mead et al., 1996) и Pit1 (Jacobson et al., 1997). Гомодимеризация белков Pbx может быть способом предупреждения их взаимодействия с др. транскрипционными факторами и их связывания с определенными промоторами генов.
Хотя дифференциальный сплайсинг является свойством многих гомеобоксных транскриптов, функциональные значения возникающих в результате продуктов изучено недостаточно. Ferreti с сотр. продемонстрировали, что 4 изоформы Pbx3, транслируемые с разных транскриптов гена Pbx3, обладают отличающимися специфичностями взаимодействия (Ferretti et al., 1999). Изоформа полной длины, обозначена как Pbx3a, тогда как Pbx3b и Pbx3c соответствовали C и N-концевым укороченным изоформам белка, а Pbx3d соответствовал белку, укороченному с обоих концов. В качестве примера их различий по биохимическим свойствам, м. служить то, что две Pbx3c и Pbx3d изоформы (лишенные большей части двух консервативных PBC-A и PBC-B доменов) неспособны соединяться с Pbx-взаимодействующим фактором Prep1 и взаимодействуют очень слабо только с Meis, в то время как др. Pbx3 изоформы взаимодействуют сильно. Следовательно, Pbx3c и Pbx3d изоформы не способны транслоцироваться с Prep1 в ядро и как результат, др. транслокационная система необходима для импорта этих белков (Berthelsen et al., 1999). Исследования взаимодействия между Pbx1 и специфичным для поджелудочной железы гомеодоменовым фактором Pdx1 (Peers et al., 1995) предоставили убедительные доказательства расходящихся свойств межды разными изоформами Pbx. В самом деле, Pdx1/Pbx1b действует как активатор транскрипции посредством активационного домена, принадлежащего Pdx1, тогда как Pdx1/Pbx1a действует как транскрипционный репрессорный комплекс. Это расхождение обусловлено дифференциальным рекрутированием ко-репрессоров. Изоформа Pbx1a обладает C-терминальным доменом, который связывает корепрессорные белки SMRT и NcoR, в то время как изоформа Pbx1b лишена этой области и неспособна рекрутировать эти факторы (Asahara et al., 1999).
В дополнение к из различным биохимическим свойствам изоформы Pbx обладают некоторой специфичностью паттернов свой экспрессии. Pbx1a изоформа ограничивается головным мозгом, тогда как Pbx1b экспрессируется во всем теле. Более того, Pbx1b является основной эмбриональной изоформой, а Pbx1a обнаруживается в основном у взрослых (Schnabel et al. , 2001). Хотя некоторые Pbx транскрипты могут быть обнаружены в одном и том же развивающиеся органе, соотв. белки часто обнаруживают клеточно специфическое распределение. В эмбриональной поджелудочной железе Pbx1a не обнаруживается в ацинусах или клетках, тогда как Pbx1b присутствует исключительно в ядрах клеток ацинусов. Белок Pbx2 выявляется в ядерной и цитоплазматической фракциях эндокринных и ацинарных клеток, тогда как Pbx3b присутствует только в цитоплазматических фракциях обеих линий клеток (Swift et al., 1998). Эти исследования подчеркивают тот факт, что механизмы пост-трансляционной регуляции, в частности доставка в ядро, играют основную роль в функционировании Pbx (см. ниже). Более того, экспрессия некоторых изоформ Pbx, по-видимому, обнаруживают предпочтение в определенных патологических контекстах. В самом деле, экспрессия Pbx3d обнаруживается в нормальных клетках, в то время как экспрессия Pbx3c обнаруживается в основном в лейкемических клетках (Milech et al., 2001).
Сегодня возможно проведение функциональных исследований различных изоформ, кодируемых одним геном. недавно, Noro et al. показали различные функции гомеодомен-содержащих и гомеодомен не содержащих изоформ. кодируемых homothorax (Noro et al., 2006). Используя RNAi технологию на Drosophila, эти авт. показали, что многие функции Hth's, включая формирование паттерна проксимо-дистальной оси придатков и большинства связанных с Нох активностей, осуществляются изоформами, лишенными гомеодомена, тогда как развитие антенн зависит от изоформы Hth полной длины. Они предположили, что альтернативный сплайсинг транскриптов гомеобоксных генов законсервированный эволюционно механизм, который увеличивает архитектурное разнообразие Hth/Exd и Meis/Pbx транскрипционных комплексов.

Loss of function of Pbx genes


Pbx1-дефицитные мыши погибают на ст. E15.5, обладая тяжелой гипоплазией (легкие, печень, желудок, кишечник, почки и поджелудочная железа) , эктопией (тимус и почки) или аплазией (селезенка, надпочечники) множественных органов, а также распространенными дефектами осевого и аппендикулярного скелета (Selleri et al., 2001). Скелетные уродства наблюдаются в проксимальных элементах конечностей, в ребрах и позвонках и скелетных структурах второй бранхиальной дуги, подвергающихся передней гомеотической трансформации в в хрящи производные первой дуги. Pbx3-дефицитные мыши доживают до рождения, но затем гибнут в течение нескольких часов из-за центральной респираторной недостаточности, обусловленной аномальной активностью дыхательных нейронов в medulla, где этот ген экспрессируется на высоком уровне (Rhee et al., 2004). Pbx1 и Pbx3 имеют существенно перекрывающиеся паттерны эмбриональной экспрессии и эти два родственных белка могут обладать перекрывающимися функциями. В самом деле, мыши, лишенные каждого из этих генов обладают основными фенотипами в местах, где мутантный ген экспрессируется в единственном числе или преимущественно. Кроме того, т.к. мыши с отсутствием Pbx1 или Pbx3 обладают гомеозисными трансформациями, то это подчеркивает роль Pbx как кофакторов Hox, они не в точности фенокопируют одиночных или компаундных мутантов Hox или Hox-подобных генов. Т.о., мы можем предложить гипотезу, что любой из членов семейства PBC компенсирует один др. в некоторых тканях, где паттерны их экспрессии перекрываются, и/или что Pbx белки обладают Hox-независимыми функциями. В самом деле, в противоположность преждевременной гибели, возникающей при потере Pbx1 или Pbx3, Pbx2-дефицитные мыши жизнеспособны и не обнаруживают очевидных фенотипических отклонений, несмотря на широко распространенную экспрессию гена во время эмбриогенеза (Selleri et al., 2004); это указывает на то, что потеря Pbx2 компенсируется др. членами семейства PBC.
Как было предположено для Hox белков, молекулярные механизмы , запускаемые с помощью Pbx, могут быть представлены в терминах "количественной модели". В этой модели различные Pbx белки могут существенно перекрываться и критический порог концентрации Pbx необходим для нормального развития. Эта модель согласуется с экспериментами, осуществленными на рыбках данио, где белки Pbx функционально эквивалентны (Waskiewicz et al., 2002). Тем не менее для оценки этой модели необходимо проанализировать компаундных нулевых мышей, чтобы идентифицировать взаимоотношения и перекрывание функций белков PBC в разных онтогенетических путях органогенеза. Недавно, Capellini с сотр. (Capellini et al., 2006) показали, что снижение дозы Pbx2 в отсутствие Pbx1 затрагивает развитие конечностей более сильно, чем только потеря Pbx1 (Selleri et al., 2001). В самом деле, эти авт. продемонстрировали, что компаундные Pbx1/Pbx2 эмбрионы помимо дефектов в проксимальных частях конечностей, обладают новыми и тяжелыми аномалиями дистальных частей конечностей, так что Pbx1-/-/Pbx2+/- эмбрионы обнаруживают потерю дистальных элементов конечностей, в то время как Pbx1-/-/Pbx2-/- эмбрионы лишены совсем задних конечностей. Эти находки подчеркивают первичную роль Pbx1 и критическое воздействие паттернов пространственно-временной экспрессии Pbx1/Pbx2 на развитие конечностей. Они также согласуются с количественной моделью, в которой порог белков Pbx д. быть критическим для развития конечностей.

Pbx proteins meet more partners


Homeodomain-containing proteins


Хорошо охарактеризованные партнеры Pbx уже упоминались как белки, принадлежащие к семейству Meis/Prep (=PKNOX1). Белки Meis/Prep млекопитающих, как было показано, димеризуются с Pbx и независимо с Hox из группы паралогов с 9 по 13 (AbdB- подобные Нох белки). Взаимодействие между Pbx и Meis белками нуждается в их N-концах. Тримерные комплексы, соответствующие всем трем гомеопротеинам, Hox-Pbx-Meis/Prep, также были охарактеризованы (rev. Moens and Selleri, 2006). Т.к. большинство из Hox мономеров распознает TAAT стрежневой мотив ДНК (Gehring et al., 1994), то гетеродимеры Hox-Pbx, Hox-Meis и Pbx-Meis распознают крупные мотивы, что приводит к более высокому сродству и специфичности связывания ДНК для этих гомеопротеинов (Mann and Chan, 1996). Интересно. что недавние данные показали, что Hox/Meis взаимодействия могут распространяться на non-AbdB-like Hox белки и что Meis белки взаимодействуют с разными Hox группами, используя разные домены взаимодействия (Williams et al., 2005). Возможные пределы взаимодействий, продемонстрированные этими авт. с использованием дрожжевого двугибриднго подхода, как и ожидалось усиливают ещё больше сложность in vivo, особенно в тканях, которые экспрессируют множественные изоформы Meis. Кроме того, взаимодействие между Hox, Pbx и Meis не ограничивается взаимодействиями белков, связанных с ДНК. В самом деле, регуляция генной экспрессии д. зависеть от трех белков, не обязательно в связанном с ДНК тримерном комплексе, а также посредством межбелковых взаимодействий, где один или два члена из этих комплексов могли бы быть не связанными с ДНК партнерами. Механизм, с помощью которого гетеротример Hox/Pbx/Meis участвует в генной регуляции пока исследуется. Huang с коллегами недавно показали, что в то время как Hoxb1 и Pbx быстро рекрутируются на Hoxb1 ARE (Autoregulatory Response Element), Meis единственный регулирутся позднее, несмотря на его постоянную доступность (Huang et al., 2005). Эта находка указывает на то. что Meis не рекрутируется как часть заранее сформированного тримерного комплекса с Hox и Pbx. Более того, они картировали C-концевой домен внутри белка Meis1, который обеспечивает увеличение уровня транскрипции Hoxb1 посредством его ARE в ответ на стимуляцию с помощью TSA (trichostatin) или PKA (Protein Kinase A). Напротив, С-конец Prep1 не чувствителен к стимуляции TSA и PKA, это указывает на функциональные отличия между Meis и Prep1 белками, Наконец, множественные комбинации, возникающие между разными формами Pbx, Hox или Meis-Prep семейств на DNA или в растворе, по-видимому, играют важную роль не только в генном таргетинге, но и также в усилении регуляции транскрипции в ответ на специфические клеточные сигналы. Как уже упоминалось, PBC белки соединяются с Hox белками из групп паралогов от 1 до 10 (Chang et al., 1995, Mann and Chan, 1996) посредством своих PID мотивов. Фактически этот мотив был описан и в др. гомеодоменовых белках, таких как Engrailed (Peltenburg and Murre, 1996) и Pdx1 (Peers et al., 1995). Др. PID мотивы разыскивали в белках, используя in silico подход и предполагаемых Pbx партнеров, были найдены те, что принадлежат к extended Hox, NK, LIM и к paired-box содержащими гомеодомен классам белков (In der Rieden et al., 2004). Хотя относительное значение ряда PID-содержащих белков было идентифицировано с помощью этого подхода, лишь некоторые из этих предполагаемых партнеров обнаруживали физическое взаимодействие с Pbx1. Среди функционально охарактеризованных партнеров Pbx1 специфический для панкреас гомеодоменовый фактор Pdx1 регулирует гены, которые являются критическими для развития поджелудочной железы и для физиологии клеток, продуцирующих insulin или somatostatin (Leonard et al., 1993). Промотор гена somatostatin контролируется с помощью нескольких цис-регуляторных элементов: CRE элемент (распознается с помощью CREB фактора и др. родственных ядерных белков), двух TSEs (TSEI и TSEII for Tissue Specific Element I and II) и элемента, соседствующего с TSEI, обозначенного как UE-A (Goudet et al., 1999). Элемент TSEI распознается с помощью Pdx1, а элемент UE-A связывается с помощью димерного комплекса, состоящего из Pbx фактора и Prep1 белка. Было продемонстрировано, что Pbx1 и Prep1 белки способны соединяться кооперативно с UE-A сайтом, тогда как ни один из белков не может соединяться с этим сайтом сам по себе. Более того, Pbx1 и Prep1 не оказывают эффекта на интактный промотор somatostatin, но они вызывают радикальную активацию, если панкреатический гомеодоменовый фактор Pdx1 также ко-экспрессируется. Т.о., полная активация промотора somatostatin обеспечивается за счет кооперативного взаимодействия между Pbx1-Prep1 гетеродимерным комплексом и панкреатическим фактором Pdx1, связанным с соседним TSEI сайтом. Эти наблюдения указывают на то, что Pbx1-Prep1 гетеродимер обладает способностью активации, которая сильно зависит от пространственной организации. Было предположено, что в контексте промотора одной из функций Pdx1 является обеспечение функциональных взаимодействий между базовым аппаратом (machinery) и Pbx1-Prep1 гетеродимером. Кроме того, Peers с сотр. показали, что Pdx1 способствует экспрессии somatostatin в δ-клетках, связывая кооперативно Pbx1 с TSEII сайтом, т.к. он индуцирует экспрессию инсулина в β-клетках, действуя кооперативно с helix-loop-helix E47 белком (Peers et al., 1995). Это наблюдение указывает на то, что предопределение клеток внутри клона островков экспрессировать или инсулин или соматостатин может зависеть от относительной экспрессии E-box связывающего белка E47 в противовес Pbx1 белкам.
Регуляция др. гена мишени для Pdx1, панкреатического elastase 1 гена (ELA1), также использует специфических членов семейств PBC и MEIS. Эта регуляция обеспечивается посредством 10- bp элемента (обозначаемого как элемент B) внутри транскрипционного энхансера промотора гена ELA1 (Swift et al., 1998). Используя скоротечный трансфекционный подход, было продемонстрировано, что этот В элемент ответственен за клеточно-специфическую экспрессию гена ELA1. В самом деле, в экзокринных ацинарных клетках В элемент кооперирует с фланкирующими последовательностями энхансера ELA1, а активация гена обеспечивается комплексом, представленным Pdx1, Pbx1b и Meis2. Напротив в эндокринных β-клетках В элемент запускает экспрессию генов в отсутствие др. активированных энхансерных элементов. Т.о., т.к. активация В элемента может быть обеспечена с помощью Pdx1 без Pbx1b и Meis2 в ацинарных клетках, то она не способна функционировать в линиях β-клеток. Это исследование подтвердило, что Pbx и Meis регулируются клеточно-специфическим образом внутри органа, а их ассоциация с Pdx1 контролирует природу транскрипционной активности транскрипционного фактора в экзокринных в противовес эндокринным клетках. Последующее исследование показало, что активность панкреас-специфического ELA1 энхансера в ацинарных клетках нуждается в кооперации тример-связывающего В элемента с ближайшим элементом связывания с панкреатическим транскрипционным фактором (pancreatic transcription factor) PTF1 (Liu et al., 2001). Этот последний фактор представлен bHLH гетеромультимером, который минимум содержит ацинарный клеточно-специфичный белок p48 и повсеместный E-box связывающий белок (REB у крыс и HEB у людей, ALF1 у мышей). Когда все партнеры присутствуют в ядрах ацинарных клеток, то Pdx1 сначала рекрутирует Pbx1b и они вместе связываются в тендеме с соседними Pdx1 и Pbx half-sites. Pbx1b затем рекрутирует Meis2b на связанный с ДНК комплекс, чьё присутствие необходимо как для транскрипционной активности Pdx1/Pbx1b/Meis2 тримера, так и для его кооперации с PTF1. Хотя домен N-терминальной активации Pdx1 является существенным для увеличения транскрипционной активности тримера, механизм, с помощью которого он оперирует остается неизвестным. Кроме того, механизм кооперации между Pdx1 и p48 внутри комплекса неизвестен, но вполне возможно, что два белка взаимодействуют или, чтобы стабилизировать др. др., соединяясь с ДНК или чтобы рекрутировать ко-активаторы для облегчения активации транскрипции.

Non-homeodomain containing proteins


HPIP (Haematopoietic Pbx1 Interacting Protein) является не гомеодоменовым белком, который был идентифицирован как партнер PBC белков в гематопоэтических тканях (Abramovich et al., 2000). Этот белок не обладает каким-либо известным ДНК связывающим доменом, но модулирует функцию PBC транскрипционных факторов посредством межбелковых взаимодействий. Точнее, этот белок, как было установлено, предупреждает связывание ДНК Hox/Pbx комплексами in vitro и ингибирует активацию транскрипции, запускаемую с помощью E2a-PBX1 онкопротеина в подходе с временной трансфекцией. Биологическое значение способности HPIP's модулировать функцию Pbx ещё предстоит оценить в более физиологическом контексте. Недавно (Manavathi et al., 2006) было показано, что HPIP способен физически соединяться с estrogen receptor (ER) и что комплекс HPIP-microtubule может регулировать estradiol-ER реакции в клетках млекопитающих. К сожалению, участие Pbx белков в таком пути ещё не было исследовано. Недавно мы идентифицировали нового Pbx1 партнера, названного ZFPIP (Zinc Finger Pbx1 Interacting Protein), который способен ингибировать in vitro ДНК связывание Hox/Pbx. Этот белок обладает многочисленными C2H2 zinc-finger мотивами, NLS и высоко законсервированными доменами, возможно он участвует с Pbx1 в важном процессе генной регуляции (Laurent et al., 2007). Раттерн экспрессии ZFPIP перекрывается с таковым Pbx1 у эмбрионов, указывая тем самым, что он может действовать вместе с Pbx1 в ходе развития. Растут доказательства, указывающие на то. что глобальная сеть законсервированных C2H2 zinc finger транскрипционных факторов может вносить вклад в формирование паттерна эмбрионов в партнерстве с Hox белками (Mahaffey, 2005). Т.о., ZFPIP скорее всего воздействует на функцию Hox/Pbx in vivo, сейчас мы исследуем генетическое и физиологической взаимодействие между ZFPIP и Hox/Pbx белками.

Pbx proteins and cell signaling


Так, роль в Pbx в передаче клеточных сигналов зависит от Hox генов, но описаны и некоторые Нох независимые механизмы.

Pbx proteins interact with partners involved in cell signaling


Pbx and TGFβ signaling Члены семейства TGFβ family (activin и BMP) являются секретируемыми белками, которые регулируют широкий круг клеточных реакций во время развития. Они действуют посредством двух типов serine/threonine transmembrane receptor kinases (RTK), которые обеспечивают фосфорилирование внутриклеточных рецептор-специфических Smad белков (Smad2-3 и Smad1 фосфорилируются посредством передачи сигналов TGFβs и BMP, соотв.). Эти фосфорилированные Smad белки затем ассоциируют с общим партнером, Smad4 и транслоцируются в ядро (Attisano and Wrana, 2002). Некоторые данные подчеркивают связь между передачей сигналов TGFβ и Hox белками. Напр., ген osteoprotegerin регулируется с помощью комплекса Smads/HoxC-8 белков в ответ на BMP (Wan et al., 2001). Недавно всестороннее комплексное исследование осуществлено на нескольких разных паралогах Hox белков, показавшее, что они действуют как генеральные нижестоящие ДНК-связывающие белки пути передачи сигналов BMP и что их транскрипционные активности регулируются с помощью Smads (Li et al. , 2006). Тогда как мало можно привести примеров взаимодействия между этой передачей сигналов TGFβ и Pbx белками, они тем не менее информативны в отношении функции Pbx. В частности, Bailey с сотр. (Bailey et al., 2004) идентифицировали Pbx1 и Prep1 в качестве партнеров Smad внутри тримерных комплексов, участвующих в регуляции гена FSH с помощью activin. Промотор гена FSH, как было показано, связывается с помощью Prep1/Pbx1/Smad4 (Bailey et al., 2004) , а Pbx1/Prep1 способен физически взаимодействовать с Smad2, Smad3 и Smad4; эта кооперативная ассоциация Pbx1/Prep1 с белками Smad скорее всего увеличивает сродство связывания ДНК каждого из белков и модулирует их выбор сайтов мишеней. Предполагается, что Pbx1 и Prep1 белки соединяются с промотором FSH, рекрутируют Smad белки и/или стабилизируют их связывание с промотором после транслокации Smad в ядро в ответ на передачу сигнала activin. Эти исследования подтверждают важность связи между Pbx и Smad белками в регуляции генов мишеней идентифицируют Pbx1 в качестве нового медиатора действия activin.
Pbx and nuclear receptors Nuclear receptors (NR) являются транскрипционными факторами, которые регулируют активность сети сложных генов (Mangelsdorf et al., 1995). Это сверхсемейство обычно подразделяют на три семейства: steroid receptor (SR), thyroid/retinoid (TR/RXR) и семейство orphan рецепторов. Транскрипция гена malic энзима в гепатоцитах эмбрионов кур стимулируется с помощью тироидного гормона (T3) посредством кластера из 5 T3 чувствительных элементов. Эта активация существнно увеличивается посредством дополнительного элемента, фланкирующего кластер из T3 чувствительных элементов и обозначается как область E. Область E содержит четыре последовательных Pbx/Meis1 half-sites, которые могут быть связаны с помощью Pbx/Meis1 комплексов в несколько конфигураций, одна из которых способна обеспечить полную активацию гена malic энзима (Wang et al., 2001). Эти авт. продемонстрировали, что усиление транскрипции гена malic энзима обеспечивается физическим взаимодействием между Pbx1 и ядерным T3 receptor-α. Кроме того, это взаимодействие усиливается в присутствии T3. Хотя эти авт. не касались механизма усиления транскрипции, они предположили, что формирование комплекса между TR/RXR и Pbx/Meis1 может облегчать рекрутирование ко-активаторов на промотор декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (malic) . Это исследование и др. подтвердили, что комплексы, содержащие Pbx/Meis-Prep1 функционируют как дополнительные белки, которые усиливают др. более специфичные транскрипционные факторы (Berthelsen et al., 1998, Liu et al., 2001, Peers et al., 1995).
Транскрипция ген prolactin (PRL3) может быть активирована или с помощью Pit-1/GHF-1, который специфически экспрессируется в клетках гипофиза, или в меньшей степени с помощью Oct1 (POU-гомеодоен содержащего белка) и Pbx1 в не-гипофизарных клетках (Subramaniam et al., 1998). Промотор PRL3 содержит negative glucocorticoid response element (nGRE), который предупреждает экспрессию гена в не-гипофизарных клетках, если он связывается ядерными glucocorticoid receptor (GR). Эти авт. продемонстрировали, что ген может, несмотря на это экспрессироваться в этих клетках при некоторых физиологических условиях. В самом деле, не-гипофизарные клетки наделяют повышенной экспрессией ген благодаря связыванию повсеместно экспрессируемого Oct-1 с AT-богатой последовательностью, присутствующей в промоторе PRL. Далее они показали, что полная транскрипционная активность гена нуждается в связывании Pbx1. Интересно, что связывание как Oct-1 так и Pbx1 с PRL3 nGRE было обнаружено, как необходимое для glucocorticoid репрессии. Они предположили, что механизм GR-обусловленной репрессии транскрипции связано или со смещением этих активирующих факторов или с некоторым вмешательством в их потенциал активации. Вовлечение гомеобоксного белка Pbx1в репрессию glucocorticoid посредством nGRE подчеркивает новую роль этого белка во взаимодействии с передачей сигналов ядерными рецепторами. В противоположность репрессивному эффекту GR на Pbx1-связанный PRL3 nGRE, глюкокортикоиды, как было установлено, действуют синергично с retinoic acid (RA) усиливая активацию транскрипции репортерного



Fig. 2. Pbx is at the crossroads of several signaling pathways. Pbx is able to integrate TGFβ and nuclear hormone stimuli, as well as initiate transcription of genes involved in sonic hedgehog and Notch signaling. Due to various bridging properties, Pbx interacts physically with specific transcription factors and chromatin-remodeling enzymes and contributes to the assembly of transcriptional regulation machinery onto target genes.

гена, несущего Hoxb1-ARE. Это усиление, как было установлено, обеспечивается за счет связывания Pbx1/Hoxb1 гетеродимера (Subramaniam et al., 2003) и было предположено, что совместная деятельность GC/RA строится на физическом взаимодействии между GR и Pbx1 белками. Однако, согласно этим авт. неясно, действует ли GR как прямой активаторо или как фактор, позволяющий рекрутирование др. активаторов транскрипции на промотор. Т.к. GR и Pbx1 экспрессируются повсеместно, то многочисленные Pbx1-регулируемые гены могут быть важными мишенями для GC-обусловленных взаимных помех ("cross-talk"). Подтверждением этой гипотезы стало то, что , взаимодействия GR с гомеодоменовыми белками, как было показано, вмешиваются в процесс развития Xenopus laevis и рыбок данио (Gao et al., 1994, Wang et al., 1999).

Pbx proteins induce expression of factors involved in cell signaling


Если Pbx белки могут быть медиаторами определенных сигнальных путей, то они могут также инициировать экспрессию ключевых белков. участвующих в трансдукции клеточных сигналов. В кооперации с Hox, белки Pbx индуцируют транскрипцию sonic hedgehog во время развития зачатков конечностей (Capellini et al., 2006). Участие Hox белка Lin 39 и его Exd/Pbx-подобного кофактора Ceh-20 в Notch-обеспечиваемой передаче сигналов в развитии вульвы у Caenorhabditis elegans было изучено недавно (Takacs-Vellai et al., 2007). Авт. продемонстрировали, что как Lin-39, так и Ceh-20 необходимы для экспрессии Lin-12/Notch рецептор и одного из их лигандов в клетках предшественниках вульвы, наделяя их компетентностью к последующим Lin-12/Notch индукционным событиям. Эти результаты указывают на то, что транскрипционные факторы Lin-39 и Ceh-20, которые действуют в самом низу RTK/Ras и Wnt путей в индукции вульвы, служат в качестве основных сайтов интеграции в координации и передаче сигналовк каскаду Lin-12/Notch, чтобы регулировать судьбы клеток вульвы. Figure 2 представляет схематическую диаграмму центральной роли PBC белков в индукции и обеспечении путей клеточных сигналов во время развития.

Pbx proteins interact with chromatin-remodeling protein complexes


Дифференцировка мышечных клеток управляется с помощью 4-х миогенных регуляторных генов MyoD, Myogenin, Myf5 и Mrf4. Эти bHLH (basic Helix Loop Helix) факторы ассоциируют с E2a, связывая и активируя множественные E box элементы, содержащие специфичные для мышц промоторы (Arnold and Winter, 1998). В трансфекционных подходах соединение Pbx1-Meis1 с элементом, соседствующим с E box, усиливает транскрипционную активацию с помощью E2a-MyoD, указывая на синергичный эффект между MyoD/E2a и Pbx/Meis гетеродимерами. Т.к. миогенные bHLH белки обладают мотивом PID, то было предположено, что подобная совместная деятельность может обеспечиваться с помощью физического взаимодействия между Pbx1 и bHLH белками (Knoepfler et al., 1999). В самом деле, некоторые авт. приходят к заключению, что Pbx1/Meis комплекс постоянно связан с промотором myogenin, тогда как ассоциация MyoD с промотором myogenin усиливается во время дифференцировки (Bergstrom et al., 2002). Для лучшего понимания механизма транскрипционной активации Myogenin был осуществлен временной анализ событий связывания белка с его промотором с помощью ChIP экспериментов (Berkes et al., 2004). Эти авт. показали, что MyoD взаимодействует с промотором косвенно посредством Pbx1 и рекрутирует SWI/SNF энзимы хроматин-ремоделирующего комплекса, которые затем облегчают связывание MyoD и др. регуляторов и наконец приводит к транскрипционной активации гена Myogenin gene. Действительно, SWI/SNF энзимы физически взаимодействуют с histone acetyltransferases (HATs), histone deacetylases (HDACs) и methyltransferases и т.о., обладают потенциалом координировать хроматин-ремоделирующие активности; этот комплекс, как кроме того было показано, активирует или репрессирует субнабор генов (Martens and Winston, 2003, Sif, 2004). Рекрутирование SWI/SNF хроматин-ремоделирующих энзимов на промотор myogenin обеспечивается за счет физических взаимодействий между Brg1 (ATPase принадлежащая комплексу SWI/SNF) и Pbx1, а также между Brg1 и MyoD (de la Serna et al., 2005). Эти результаты согласуются с др. данными, подтверждающими, что SWI/SNF хроматин-ремоделирующие энзимы обычно рекрутируются во время поздних стадий процесса активации, после сборки факторов на промоторах (Martens and Winston, 2003, Salma et al., 2004, Soutoglou and Talianidis, 2002, Spilianakis et al., 2003). В то время как исследование Berkes et al. (2004) продемонстрировало прямое взаимодействие между Pbx1 и хроматин моделирующим аппаратом, то др. данные показали, что Pbx1 белки сцеплены с HDACsи HATs и тем самым обладают способностью репрессировать или активировать транскрипцию в ответ на специфические клеточные сигналы. Как уже упоминалось выше Pbx1/Pdx1 гетеродимер поочередно ингибировать или активировать транскрипцию панкреас-специфических генов. Комплекс Pbx1b/Pdx1 запускает транскрипционную активацию посредством рекрутирования CBP, histone acetylase, тогда как Pbx1a/Pdx1 репрессирует транскрипцию путем связывания NcoR и SMRT (Asahara et al., 1999). Хотя механизм, с помощью которого NCoR и SMRT репрессируют экспрессию генов мишеней не совсем ясен в этом случае, ими ранее было показана ассоциация с histone deacetylases посредством Sin3 комплексов (Alland et al., 1997, Heinzel et al., 1997, Nagy et al., 1997). Т.о., NCoR и SMRT могут блокировать активность Pdx1 с помощью противодествия CBP-обусловленному ацетилированию нуклеосом. Hoxb1 ауторегуляторный элемент представлен тремя Hox-Pbx связывающими сайтами. Хотя этот энхансер не способен активировать экспрессию репортерного гена в монослое клеток P19 , обработанных ретиноевой кислотой (RA), он оказывается функциональным, когда клетки культивируются в агрегатах в присутствии RA. В самом деле, гетеродимер Hoxb1/Pbx1 способен переключать с репрессора на net activator после агрегации клеток или передачи сигналов PKA (Saleh et al., 2000). Точный механизм этого превращения неясен, но было показано, что репрессивная активность обеспечивается за счет физического взаимодействия Pbx1a N-конца и ко-репрессорного комплекса, включая HDAC1, HDAC3, mSIN3B и N CoR/SMRT, тогда как активация обеспечивается за счет PKA-опосредованного рекрутирования CBP с помощью Hoxb1. Интересно. что Pbx1/Hoxb1 димер может быть переключен с репрессора на активатор в ответ на передачу сигналов PKA или агрегацию клеток, поэтому это подтверждает, что передача клеточных сигналов, обеспечиваемая с помощью внутриклеточных cAMP, может быть детерминантом для функции Hox/Pbx. Ряд исследований демонстрирует, что CBP взаимодействует с различными Pbx/partner комплексами и может модулировать транскрипцию генов с помощью этого взаимодействия (Asahara et al., 1999, Saleh et al., 2000, Shen et al., 2001). Shen et al., (2001) показали, что CBP способен также предупреждать Hox ДНК связывание in vitro и что взаимодействие между Hox и CBP ингибирует CBP histone acetylase активность. Следовательно, эти взаимные ингибирующие взаимодействия могут объяснить неспособность CBP усиливать низкий уровень генной активации, индуцированный Hox белками в рамках метода репортеров. До тех пор пока эти in vitro данные не будут изучены в более физиологическом контексте, мы может тем не менее предположить о важности этого CBP/Hox взаимодействия in vivo. Путем ингибирования Hox ДНК связывания взаимодействие CBP с Hox ками может быть переключено в некоторых онтогенетических генетических программах. В самом деле, взаимодействие между CBP и Hox белками д. приводить к высвобождению Hox белков с генов мишеней, также м к ингибированию активности CBP. В такой модели, возникает вопрос о роли не-гомеодоменовых форм Hox белков Вместе с др. авт. мы показали, что некоторые Hox гены продуцируют не-гомеодоменовые изоформы (Dintilhac et al., 2004,Komuves et al., 2000). Некоторые из этих укороченных Hox белков обладают способностью взаимодействовать с CBP столь же эффективно, как и изоформы полной длины. В частности, мы показали, что HoxA9T, лишенная гомеодомена форма HoxA9, способна связывать CBP и следовательно, может конкурировать с типичными Hox белками за CBP (Dintilhac et al., 2004). Такие укороченные формы гомеодоменовых белков возможно играют важную роль в секвестрировании специфических кофакторов и, следовательно, в генной регуляции специфических Hox генов мишеней.
Др. пример связи между Pbx1 и хроматин-ремоделирующим белковым комплексом предоставляется транскрипционным фактором FoxC1, членом семейства генов Forkhead Box (FOX) . FoxC1 обычно участвует в специфическом образовании множественных структур, таких как глаза, осевой скелет, сомиты, сердце и окружающая васкулатура, а также урогенитальная система (Kidson et al., 1999, Kume et al., 2000, Kume et al., 2001, Winnier et al., 1999). FoxC1 , как недавно было сообщено Berry and colleagues (2005), взаимодействует с Pbx1a в ядре, особенно в HP1-rich (heterochro-matin Protein 1) компартментах ядра. Будучи локализованным в этих регионах, FoxC1 не способне рекрутировать необходимые коактиваторы, важные для инициации транскрипции. Однако, всё ещё неясно, может ли локализация в FoxC1в богатых HP1 регионах вызывать или быть следствием FoxC1-Pbx1a-обусловленного ингибирования. Авт. полагают, что Pbx1a является компонентом ингибирующей транскрипцию сети, действующей на FoxC1 в клетках (Berry et al., 2005).

Pbx acts as a bridging protein within the transcriptional complex


Так, упомянутые выше Pbx белки взаимодействуют с широким набором белков на генах мишенях. of proteins on target genes. Эти взаимодействующие с Pbx партнеры соответствуют гомеодоменовым (Hox, Meis/Prep, Pdx1) и не-гомеодоменовым (FoxC1, HPIP, ZFPIP, Smad, NR, MyoD) белкам, обладают большей временной и/или пространственно ограниченной экспрессией во время развития, чем Pbx. Поэтому они д. рассматриваться, как кофакторы Pbx и они обозначены на figure 3 как XPIP (X Pbx Interacting Proteins, где X соответствует любому специфически экспрессируему фактору, взаимодействующему с Pbx). Эта концепция согласуется со сравнением фенотипов XPIPs и Pbx-нулевых мышей. Аномалии, наблюдаемые у мышей, лишенных Pbx1 более широко распространены, чем те, что наблюдаются у XPIP-нулевых мышей. Кроме того, Pbx белки взаимодействуют с Meis/Prep белками, формирующими гетеродимеры, которые в многочисленных временных трансфекционных испытаниях не обнаруживали радикальной транскрипционной активности. В самом деле, гетеродимеры, продуцируемые Pbx/Meis/XPIP являются более эффективными транскрипционными регуляторами, чем Pbx/Meis гетеродимеры, демонстрируя, что последние нуждаются в кооперации с др. транскрипционными факторами. Такая кооперация может происходить только на растянутых последовательностях промоторов, которые обычно не используются в испытаниях репортеров. В статьях данного номера сообщается о нескольких примерах такой кооперации, обусловленной физическими взаимодействиями с Pbx и др. специфическими транскрипционными факторами. Т.о., очевидно, что транскрипция Pbx генов мишеней может быть модулирована за счет динамической организации этих факторов в ответ на разные клеточные сигналы. Внутри комплекса каждый из партнеров способен рекрутировать хроматин-ремоделирующие энзимы, такие как CBP, HAT, HDAC и SWI/SNF белки. Транскрипционный эффект этих комплексов скорее всего соответствует сумме этих противоположных и/или синергичных ферментативных активностей и вытекает из интеграции нескольких сигнальных путей, таких как те. что используют Smad, PKA и ядерные рецепторы. Детальный анализ фенотипов Pbx1-нулевых мышей показал, что функция Pbx является критической для развития и особенно для органогенеза. В самом деле, хотя Pbx не является обязательным для инициальной ступени органогенеза, Pbx необходим для др. ступеней органного развития (Selleri et al., 2001, Brendolan et al., 2005, DiMartino et al., 2001, Schnabel et al., 2003, Manley et al., 2004, Dutta et al., 2001). У мышей. у которых отсутствует PID-кодирующая часть гена Pdx1, наблюдается содействие завершению панкреатической генетической программы. Было предположено, что Pdx1 мономеры и Pdx1/Pbx1 гетеродимеры запускают генетические программы, которые могут отличаться (Dutta et al., 2001). Эти результаты подтверждают гипотезу, что гомеопротеины могут регулировать энхансеры мишени без кофакторов путем связывания мономеров с сайтами (Galant et al., 2002).
В последнем цитированном исследовании, поиск генетических взаимодействий Pbx с онтогенетическими маркерами оказался неспособным показать участие Pbx в хорошо известных генетических путях. Согласно общим данным, нами предложена модель, в которой XPIP/Pbx гетеродимеры действуют как адапторы на промоторах, чтобы интегрировать информацию от нескольких сигнальных путей после инициации генетических программ органогенеза (Fig. 3). Мы полагаем, что во время инициации органогенза промоторы генов мишеней Pbx позиционно маркированы с помощью XPIP, которые затем кооперируют с Pbx и др. регуляторными факторами, чтобы активировать или репрессировать транскрипцию. На основании большинства примеров. найденных в литературе, мы могут предположить, что XPIP способны соединяться с некоторыми консенсусными сайтами в виде мономеров (Galant et al., 2002). После того как Pbx становится доступным в ядре в результате импорта в ядро, XPIP может быть частично смещен с помощью Pbx и вновь сформированные гетеродимеры будут соединяться с соседними димерными сайтами. Этот сдвиг XPIP с мономерных на димерные связывающие сайты д. происходить, т.к. взаимодействие между XPIP и мономерными сайтами более слабое, чем между XPIP/Pbx и димерными сайтами связывания. Таким путем, Meis/Prep д. рекрутироваться или как партнер, не связывающийся с ДНК, или как ДНК-связывающий партнер (в этом последнем случае комплекс соединяется с тримерным сайтом связывания) , чтобы стабилизировать сборку. Т.о., формирование XPIP/Pbx гетеродимеров (или гетеротримеров, если используется Meis/Prep) является ответственным за рекрутирование хроматин-ремоделирующих энзимов, которые скорее всего делают стабильным связывание ДНК с др. транскрипционными факторами. Рекрутирование возможно обусловлено Pbx свойствами связывания и объясняет кооперацию между соседними регуляторными сайтами, связанными с разными транскрипционными факторами, собранными вокруг Pbx. Транскрипционная регуляция генов мишеней д. соответствовать интеграции антагонистических и синергических сигнальных путей с помощью Pbx. Следовательно, генетические программы органогенеза д. соответствовать модуляции молчания, поддержания или усиления экспрессии ключевых генов с помощью Pbx белков и их различных партнеров.

Sub-cellular localization of Pbx proteins is tightly regulated


Представленные выше разделы подчеркивают роль Pbx белков в регуляции генов внутри транскрипционных комплексов. Присутствие Exd/Pbx белка в ядрах клеток является таким образом детерминантом установки соотв. генетических программ. Во время развития Drosophila Exd является цитоплазматическим в дистальных областях придатков, тогда как он является ядерным в проксимальных областях. Эктопическая экспрессия Exd в ядрах дистальных клеток блокирует развитие дистальных частей приводя к возникновению укороченных придатков (Gonzalez-Crespo et al., 1998, Gonzalez-Crespo and Morata, 1996). Локализация Pbx1 в ядре также является критической для корректного развития проксимальных структур конечностей у позвоночных. В самом деле, дефицитные по Pbx1 мыши, обнаруживают уродства с вовлечением только проксимальных скелетных элементов в регионах, где Pbx1 является ядерным. Напротив, дистальные элементы не затрагиваются у этих мышей (Selleri et al., 2001). Многочисленные др. исследования показали, что ядерное/цитоплазматическое распределение Pbx1 является предметом для сложных регуляторных

Fig. 3. Pbx proteins have a major role in integrating cell signaling and triggering subsequent developmental genetic programs. During development, differentiation genes are firstly bound by monomeric XPIP ("X" Pbx Interacting Protein) and Pbx/Meis (or Pbx/Prep) dimer. Then, XPIP is recruited by the Pbx/Meis dimer (Meis could be involved in the complex either as a non-DNA or DNA-binding partner). The XPIP/Pbx/Meis heterotrimer is subsequently able to recruit chromatin-remodeling enzymes that allow stable DNA binding of other transcription factors. The target gene is thus transcribed at a rate defined by the overall complex interaction with the basal transcriptional machinery. (Step 1) Developmental genetic program initiated by XPIP/Pbx proteins; (Step 2) Integration of cell signaling pathways; (Step 3) Modulation of developmental genetic programs by Pbx-containing transcription complex.

механизмов, которые возникают в результате взаимодействий между несколькими взаимодействующими с Pbx партнерами, соединяющимися с NLS (Nuclear Localization Signal) и NES (Nuclear Export Signal) в Pbx1. В самом деле, регион, соответствующий аминокислотам 45-90 в PBC-A , содержит два независимых NESs, способных обеспечивать экспорт в ядро Pbx1 посредством CRM1 (exportin 1) рецептора, экспортирующего в ядро (Kilstrup-Nielsen et al., 2003). Pbx1 содержит также два кооперативных NLSs внутри гомеодомена, которые ингибируются, когда замаскированы за счет внутримолекулярных взаимодействий между N-концом и гомеодоменом Pbx1 (Saleh et al., 2000). Более того, конкуренция между сигналами импорта и экспорта в ядро может испытывать влияние клеточно-специфическим образом. Напр., в клетках, экспрессирующих PBX партнеров, Meis/Prep белки, соединение Pbx1с Meis/Prep белками ведет к конформационным изменениям, открывающим Pbx1 NLS, который затем направляется в ядро (Berthelsen et al. , 1999, Saleh et al., 2000). Субклеточная локализация Pbx1 регулируется также с помощью пост-трансляционного механизма. В самом деле, активация protein kinase A ведет к фосфорилированию Pbx1 и это усиливает его ядерную локализацию (Kilstrup-Nielsen et al., 2003). Недавно было предположено, что актин-связывающий белок Filamin A (FLNA) может обеспечивать ядерную локализацию Pbx1a или за счет влияние на его статус фосфорилирования или за счет участия в сборке Pbx1-Meis/Prep. Однако, пока неизвестно, связывается ли FLNA непосредственно с Pbx1 или Meis/Prep белками и как он регулирует правильную ядерную локализацию Pbx1 (Berry et al., 2005). Было продемонстрировано, что NMHCB (non-muscle myosin heavy-chain B) обладает функцией удержания в цитоплазме Pbx1. Более того, область Pbx1, участвующая во взаимодействии с NMHCB перекрывает область, необходимую для связывания Meis1a, указывая тем самым, что субклеточная локализация Pbx1 может быть результатом конкуренции между несколькими путями (Huang et al., 2003). Взаимодействие Pbx1/NMHCB подтверждает также гипотезу, что актиновый цитоскелет может играть роль в аккуратной регуляции импорта в ядро Pbx1. В согласии с этой идеей то, что Haematopoietic Pbx1 Interacting Protein (HPIP), впервые идентифицированный как партнер PBX (Abramovich et al., 2000), обладает потенциалом челночного белка между цитоплазмой и ядром, т.к. он содержит NLS, NES и цитоскелетный связывающий домен (Abramovich et al., 2002). Т.о., ассоциация HPIP с цитоскелетом может обеспечивать регуляторный механизм, контролирующий доступность функциональных ядерных Pbx белков. Кроме того, др. компоненты цитоскелета, такие как tubulin, и были идентифицированы в нашем двугибридном скрининге на белки, взаимодействующие с Pbx1b (Fig. 1). Эти взаимодействия, как ожидалось, д. способствовать удержанию Pbx1 в цитоплазме.
Хотя многочисленные исследования были предприняты для изучения регуляции субклеточной локализации Pbx, некоторые вопросы остались нерешенными. В частности, как разные Pbx белки и/или изоформы, присутствующие в том же самом типе клеток, обладают разным субклеточным распределением. Это иллюстрируется локализацией Pbx1a в ядрах панкреатических ацинарных клеток, тогда как Pbx2 является ядерно-цитоплазматическим, а Pbx3b исключительно цитоплазматическим в тех же самых клетках. Регуляция локализации Pbx безусловно более сложная, чем первоначально предполагалось после идентификации Meis/Prep белка в качестве уникального ядерно/цитоплазматического челнока для Pbx (Fig. 2). Более того, присутствие разных изоформ, в семействе Meis/Prep предотвращает множественные партнерства и множественные пути регуляции локализации Pbx

Conclusion


This review highlights the fundamental role of Pbx proteins in initiating, mediating and integrating physiological and cellular contexts during development (Fig. 2). In their position downstream of crucial signaling pathways, Pbx proteins are able to initiate developmental programs and, by interacting with cell- signaling effectors, they can also adapt new genetic networks. This functional plasticity might explain the localisation of the proteins in critical areas of developing organs. Indeed, the detailed description of Pbx1 expression in mice clearly demonstrates the presence of this protein not only in proliferating zones, but also in non-cycling cells of the developing embryo (Schnabel et al., 2001). As suggested by these authors, Pbx1 expression during organogenesis indicates a potential function in determining cell fate in a variety of tissues that depend on mesenchymal-epithelial interactions for their coordinated morphogenesis. We can thus imagine that Pbx proteins are able to switch from one gene regulatory network to another, allowing proliferating cells to go through a genetic differentiation program necessary to obtain specialized cell types in functional organs. The overall results of studies in the literature indicate that Pbx proteins functionally interact with a wide variety of transcription factors, thus forming heterodimers, heterotrimers or multimers on promoter target genes that play key roles in cell fate. These Pbx-associated factors often possess a PID that is an imperfectly conserved motif, indicating that competition between these PID-bearing proteins could occur under certain conditions. The positive or negative effects of Pbx- containing complexes on target-gene transcription depend on their composition, with each component participating directly or indirectly in the recruitment of chromatin-remodeling enzymes such as HAT, HDAC, CBP or the whole SWI/SNF complex. The level of transcriptional regulation mediated by Pbx/partners seems to be a balance between the opposite activities of chromatin-remodeling enzymes that they recruit. This overall assembly of transcriptional complexes onto gene promoters would result in the expression of specific gene networks, integrated by cells to ultimately undergo mitosis or specific differentiation programs.
Сайт создан в системе uCoz