Посещений:
Phosphoinositide (PI) 3-kinase

The phosphoinositide (PI) 3-kinase family
Fiona M. Foster, Colin J. Traer, Siemon M. Abraham и Michael J. Fry (m.j.fry@reading.ac.uk)

Journal of Cell Science 116, 3037-3040 (2003)


Рис.1.

Phosphoinositide (PI) 3-kinase впервые обнаружена в 1984 благодаря минорной inositol lipid kinase активности, ассоциированной с иммунопреципитируемыми онкогенными продуктами (напр., Src, Abl и polyoma mT антиген) и присутствует в активированных комплексах рецепторов факторов роста (напр., PDGF рецепторы). В 1988 энзим, ассоциированный с этой активностью обнаружил новую способность фосфорилировать в положении 3 гидроксильную группу кольца инозитола (см. poster) phosphatidylinositol (PtdIns). PI 3-kinase была выявлена затем во всех изученных типах клеток эукариот (Fry, 1994; Katso et al., 2001) и оказалась связанной с невероятно разнообразными наборами ключевых клеточных функций, включая рост клеток, подвижность, дифференцировку, и внутриклеточный перенос (Fry, 1994; Rameh и Cantley, 1999; Fry, 2001; Katso et al., 2001). Обнаружившиеся связи PI 3-kinase активности со многими расстройствами у людей, включая аллергию, воспаление, болезни сердца и рак, сделали её фокусом интенсивных исследований, а ингибиторы этого энзима стали рассматриваться как потенциальные терапевтические агенты (Stein и Waterfield, 2000).
Хотя большинство исследований было сфокусировано на классических p110-p85 (ныне известнных как класс I) PI 3-kinases, однако в последние 10 лет было установлено, что сверхсемейство PI 3-kinase (EC 2.7.1.137) представляет собой очень большое семество структурно родственных белков, которые отличаются по потребностям в PI субстрате и способу регуляции, которые, по-видимому, и объясняют наблюдаемое разнообразие функций (Rameh и Cantley, 1999; Fry, 2001; Katso et al., 2001). Стратегии PCR клонирования и данные проектов геномного секвенирования генома позволили определить границы семейства восемью PI 3-kinase каталитическими субъединицами, которые способны фосфорилировать inositol липиды. Эти 8 изофофрм были подразделены на 3 функциональных класса на базе структуры их белковых доменов, специфичности к липидным субстратам и ассоциируемых регуляторных субъединиц: а именно, класс I энзимов, p110α, p110β, p110δ и p110γ; класс II энзимов, PI3K-C2α, PI3K-C2β и PI3K-C2γ; и сольный класс III энзимов, Vps34 (Fry, 2001 ; Katso et al., 2001).
Взаимоотноешния между киназными доменами разных энзимов, идентифицированные в геномах людей, мух, червей и дрожжей, показаны на Рис. с помощью non-rooted филогенетического древа, которое подготовлено с использованием ClustalX (hs, Homo sapien; dm, Drosophila melanogaster; ce, Caenorhabditis elegans; sp, Schizosaccharomyces pombe; sc, Saccharomyces cerivisiae). Простейшие эукариоты, такие как дрожжи и все изученные растительные виды, как оказалось, обладают только единственным классом III PI 3-kinase. Многоклеточные беспозвоночные организмы, представленные C. elegans и D. melanogaster, имеют по единственному представительному члену от каждого из трёх функциональных классов. Геномы позвоночных (человек, мышь) содержат 8 самостоятельных генов PI 3-kinase, при этом некоторые из членов семейства широко или посеместно экспрессируются (напр., p110α, p110β, PI3K-C2α, PI3K-C2β и Vps34), тогда как др. более ограничены специфическими типами клеток и тканей (напр., p110δ, p110γ и PI3K-C2γ). Увеличивает сложность имеющийся класс IV из группы PI-3-kinase-родственных белков serine/threonine kinases, обнаружиенных у всех эукариот (Kastan и Lim, 2000). Млекопитающие имеют 4 такие протеин киназы: TOR (the target of the drug rapamycin), ATM (Ataxia telangiectasia mutated), ATR (Ataxia telangiectasia mutated related) и DNA-PK (DNA-dependent protein kinase).
Различные 3-фосфорилировнгные липидные продукты, которые продуцируются с помощью этих энзимов [PtdIns(3)P, PtdIns(3,4)P2, PtdIns(3,5)P2 и PtdIns(3,4,5)P3] функционируют как части механизма, с помощью которого разнообразные наборы сигнальных молекул, содержащие pleckstrin homology (PH), FYVE, Phox (PX) и др. связывающие липиды домены, рекрутируются в различные клеточные мембраны (Rameh и Cantley, 1999; Wurmser et al., 1999; Ellson et al., 2002). Клеточные PI 3-kinase активности сбалансированы с помощью phosphoinositide 3-phosphatase активности, найденной в tumour suppressor белке PTEN и в членах семейства myotubularin (MTM)(Maehama et al., 2001 13"> ).

Functional analysis of PI 3-kinases


Два избирательных, химически нероственных PI 3-kinase ингибитора используются широко: а именно, wortmannin и LY294002. К несчастью использование этих ингибиторов ограничено тем фактом, что они ингибируют все известные изоформы PI 3-kinase, включая и энзимы класса IV PI-3-kinase-like. Это ведет к тому, что многие клеточные процессы, связанные с активностью PI 3-kinase, существенно нарушаются, т.к. изоформы PI 3-kinase контролируют специфические клеточные процессы. В клетках млекопитающих wortmannin супрессирует класс I, класса II PI3K-C2β и PI3K-C2γ, и класса III PI 3-kinase активность с IC50 в пределах 1-10 nM, тогда как он ингибирует класса II PI3K-C2α изоформу с приблизительным IC50 в 400 nM, и класса IV PI-3-kinase-related энзимы в пределах 100-300 nM (данные суммированы по многим источникам). Сходным образом, LY294002 ингибирует все PI 3-kinases с IC50 в пределах 1-50 µM. Т.о., при низких концентрациях эти два ингибитора (преимущественно используются параллельно) м. разрешать PI 3-kinase активность для определенных интересующих клеточных процессов, но они не пригодны для выявления участия индивидуальных видов PI 3-kinase. Многие фармацефтические компании работают над изоформ-специфическими PI 3-kinase ингибиторами и надеются, что со временем это удастся. Совремнными альтернативными подходами является использование доминантно негативных мутаций, нокаутных мышей или RNA interference.

Class I PI 3-kinases


Класс I семейства PI 3-kinase энзимов у позвоночных представлен 4 самостоятельными видами белков примернов 110 kDa (p110α, p110β, p110δ и p110γ). Все энзимы класса I обладают многими сходными структурными свойствами и общей субстратной специфичностью (Rameh и Cantley, 1999; Fry, 2001; Katso et al., 2001). In vitro, все класса I PI 3-kinases способны фосфорилировать PtdIns в PtdIns(3)P, PtdIns(4)P в PtdIns(3,4)P2 и PtdIns(4,5)P2 в PtdIns(3,4,5)P3, при этом PtdIns(4,5)P2 является предпочтительным липидным субстратом in vivo. Класса I PI 3-kinases являются в основном цитозольными в покоящихся клетках, но после стимуляции они рекрутируются в мембраны посредством взаимодействий с рецепторами или адапторными белками. Они, как полагают, функционируют прежде всего на плазматической мембране, но имеются сообщения о случаях ассоцииации класса I PI 3-kinases с везикулярными и ядерными мембранами (Rameh и Cantley, 1999; Fry, 2001; Katso et al., 2001). Клеточные роли класса I PI 3-kinases разнообразны, имеются доказательства связи их в размерами, подвижностью, выживаюемостью и пролиферацией клеток в ответ на многочисленные сигнальные системы во многих отличающихся типах клеток (Fry, 2001; Katso et al., 2001). Семейство класса I ещё подразделено на 2 группы на базе их регуляторных партнёров и механизмов активации.

Class IA


Имеется три класса IA каталитических субъединиц: p110α (ген человека обозначен PIK3CA – все последующие названия генов и хромосомные локализации приводятся сравнительно с человеческими), которые картированы в хромосоме 3 в 3q26.3; p110β (PIK3CB в 3q23); и p110δ (PIK3CD в 1p36.2). Все эти PI 3-kinases физически взаимодействуют с семейством Src homology 2 (SH2)-домен-содержащими регуляторными адпторными белками. Три отдельных гена кодирут адапторы p85α (PIK3R1 на 5q12-q13), p85β (PIK3R2 на 19q13.2q13.4) и p55γ (PIK3R3 на 1p34.1), каждый с несколькими возможными сплайс-вариантми. Все члены этого семейства `p85' адапторов соединяются с N-терминальными 100 аминокислотами (показаны пурпурным) класса IA PI 3-kinases и обеспечивают их активацию с помощью рецепторов ростовых факторов (главным образом семейство protein-tyrosine kinase) посредством двух SH2 доменов, которые соединяются с сиквенс-специфическими фосфорилированными тирозиновыми остатками или на аутофосфорилированных рецепторах или на субстрате адапторных белков. Некоторые из p85α и p85β сплайс-форм адапторов обладают также SH3 доменом, который м. соединяться с богатыми пролином лигандами др. белков или в дополнение к SH2-domain-обусловленному рекрутированию (Fry, 1994; Katso et al., 2001). Класс IA PI 3-kinase был первым идентифицирован и клонирован, поэтому он лучше изучен. Предполагается, что индивидуальные изоформы играют самостоятельные, но возможо перекрывающиеся роли, которые м. варьировать в разных типах клеток. Класс I PI 3-kinases связан с клеточными размерами у Drosophila, а у млекопитающих изоформа p110α, как было показано, регулирует размер взрослого сердца (Crackower et al., 2002). Мыши, нокаутные по p110α и p110β генам, вызывают эмбриональную гибель, подчеркивая их важность. Сообщения подтверждаеют, что p110α м. играть роль в жизнеспособности клеток, тогда как p110β м.б. более важным в обеспечении клеточной пролиферации (Benistant et al., 2000). Данных об участии p110α в многочисленных типах рака горы (Fry, 2001), исследования на нокаутных мышах с каталитически неактивной p110δ указывают на то, что эта изоформа является критической для передачи сигналов рецепторов полных B- и T-cell антигенов (Okkenhaug et al., 2002).

Class IB


Каталитическая субъединица p110γ (PIK3CG на 7q21.11) единственный член класса IB member и отличается он от энзимов класса IA своим характерным N-концом (лишен сайта связывания р85 адаптров) и по своему партнёру-адаптору, p101 (ген регуляторной субъедницы PI 3-kinase в 17p13.1), который лишен доменов, найденых у любых др. белков. В то время как энзимы класса IA преимущественно активируются с помощью tyrosine-kinase-обеспечиваемых сигналов, энзим класса IB связан с системой G-protein-coupled receptor (GPCR). Активация класса IB, по-видимому, осуществляется преимущественно за счёт использования взаимодействий с Gβγ субъединицами и возможно также с Gα субъединицами (Katso et al., 2001). Результаты исследований нокаутных мышей указывают на то, что p110γ играет ключевую роль в качестве модулятора воспаления и аллергии (Wymann et al., 2003), и участвует также в регуляции сократимости сердца (Crackower et al., 2002).

PI 3-kinase core structure


Классификация семейства PI 3-kinase в основном базируется на расположении последовательностей, которые определяют 4 главных блока сходных последовательностей у членов семейства класса I, названных homology regions (HR) 1-4. Определена рентгеновская кристаллическая структура этих 4-х доменов у p110γ в отдельности и в комплексе с Ras или PI 3-kinase ингибиторами. Это составило основу нашего понимания семейства этих киназ на молекулярном уровне (Walker et al., 1999; Djordjevic и Driscoll, 2002). HR1 (показан серым) является стержневым киназным доменом и это единственный домен, обнаруженный во всех 4-х классах PI 3-kinase. Этот домен обладает слабой гомологией с протеин киназами. HR2 (известный также как PIK домен – показан зеленым), по-видимому, исходя из струткурных данных, играет роль поддержки для остальных доменов. HR3 является C2-подобным доменом (небольшой голубой круг). C2 домены у др. белков обеспечивают взаимодействия с липидами или др. белками или кальций-зависимым или кальций-независимым образом. Положение этого домена в структуре PI 3-kinase указывает на его роль в общем связывании с мембраной и возможно в нахождении субстрата (Walker et al., 1999). HR4 (показано красным) является предположительно Ras-связывающим доменом или малым G-protein-связывающим доменом, который обнаружен только в классе I и II PI 3-kinases. Кстати, HR4 домен единственный, для которого выявлены функциональные эффекты благодаря его взаимодействиям с Ras в классе I PI 3-kinases (Katso et al., 2001).

Class II PI 3-kinases


Class II PI 3-kinases был идентифицирован благодаря гомологии и PCR cloning подходу и по этой причине он довольно хорошо изучен (Fry, 2001). Беспоозвоночные имеют единственного представителя этого класса PI 3-kinase, тогда как млекопитающие и рыбы (C.J.T. и M.J.F., unpublished) имеют по 3 представителя класса II PI 3-kinases. У людей этот класс II PI 3-kinases называется PI3K-C2α (PIK3C2A на 11p15.5-p14), PI3K-C2β (PIK3C2B на 1q32) и PI3K-C2γ (PIK3C2G на 12p12). Если класс I PI 3-kinases располагатся в основном в цитоплазме до тех пор, пока не рекрутируется в активные сигнальные комплексы, то класс II PI 3-kinases в основном постоянно ассоциирован с мембранными структурами, включая плазматическую мембрану, внутриклеточные мембраны и что неожиданно ядерные (Fry, 2001). Внеклеточные сигналы, включая integrin engagement, факторы роста (напр., insulin, EGF, SCF и HGF) и хемокины, стимулируют активность класса II PI 3-kinase (Brown и Shepherd, 2001). Механизм активации пока неясен, он связан с фосфорилированием тирозина, протеолизом и привлечением адпторных белков (напр., Grb2, clathrin), играющих роль в разных типах клеток или рецепторных систем. Сегодня нет четко установленной клеточной роли этих энзимов или какого-либо четкого консенсуса об их продуктах in vivo. In vitro класс II PI 3-kinases м. фосфорилировать PtdIns и PtdIns(4)P, но в отличие от класса I PI 3-kinases, не PtdIns(4,5)P2. Класс II PI 3-kinases не удаётся выделить в ассоциации с регуляторной субъединицей, но он обладет более длинными N- и C-концами по сравнению с классом I PI 3-kinases, которые м. служить для этой цели. N-конец лишен определяемых структурных доменов, но обладает и суперскрученным (coiled-coil (бледно голубой)) и богатым пролином (лиловый) мотивами, которые м. обеспечивать межбелковые взаимодействия. Увеличенный C-конец имеет тандем PX (жёлтым) и C2 (крупный голубой кругe) доменами, функции которых ещё не установлены для класса II PI 3-kinases. Исходя из структурных и функциональных исследований их роли у др. белков, эти домены скорее всего обеспечивают связь с мембранынми липидами или межбелковые взаимодействия (Djordjevic и Driscoll, 2002).

Class III PI 3-kinases


Класс III PI 3-kinases представлен единственным членом Saccharomyces cerivisiae PI 3-kinase, Vps34 (Fry, 1994; Wurmser et al., 1999; Katso et al., 2001). В отличие от класса I и II PI 3-kinases, этот энзим м. фосфорилировать только PtdIns и , следовательно, является PtdIns 3-kinase. Все изученные эукариоты имеют единственного гомолога Vps34. Ген человека (PIK3C3) расположен на хромосоме 18 в 18q12.3. Единственная в 150 kDa регуляторная субъединица (у дрожжей VPS15, у людей PIK3R4, локализована на 3q22.1) обладает внутренне присущей protein-serine kinase активностью, которая необходима для функционирования Vps34 (Wurmser et al., 1999). Первоначально выделенный как мутантный vesicle-mediated vacuolar protein sorting у дрожжей, класса III PI 3-kinases участвуют в слиянии эндосом во время событий внутриклеточного переноса (trafficking) и локализуются главным образом во внутриклеточных мембранах (Wurmser et al., 1999). Недавние исследования показали, что этот класс PI 3-kinase участвует в разнообразных внутриклеточных событиях переноса, включая аутофагию (Kihara et al., 2001) и образование phagosome (Vieira et al., 2001), образование внутренних пузырьков внутри multivesicular эндосом (Futter et al., 2001), ретроградный транспорт эндосом в аппарат Гольджи (Burda et al., 2002) и транспорт на ядерную мембрану (Roggo et al., 2002).
Сайт создан в системе uCoz