Это не просто, что PKC изоформы могут быть рекрутированы на каркасы с др. трансдуцерами, что важно, но также важно то, что они могут контролировать поведение каркасных комплексов, влияя на их сборку или разборку и их субклеточную локализацию, без необходимости быть интегральной частью комплекса. Т.к. пространственные и динамические аспекты передачи сигналов становятся всё более важными в нашем понимании клеточной физиологии, поэтому время рассмотреть примеры действия изоформ PKC в контроле этих событий. Здесь мы кратко предоставим основу семейства PKC, раскрывая свойства и пути, после нескольких примеров определенных PKC изоформ, занятых в передаче сигналов, которые влияют на динамику и локальное поведение сигналов и сигнальных комплексов. Мы не стремимся представить всё изобилие PKC-взаимодействующих белков и каркасов, которые не раз обсуждались (see Refs 9, 10, 11, 12). Мы подчеркиваем, что процессы, проиллюстрированные здесь, будут примерами динамической природы сигнальных платформ и ролей PKC изоформ в создании этого динамизма. В частности примеры будут связаны с гомотипическим и гетеротипическим межклеточным распознаванием и клетка-extracellular matrix (ECM) взаимодействиями, которые регулируют миграцию клеток. Наконец, мы рассмотрим проблему, как можно преобразовать описание пространственно испускаемых сигналов в понимание причинных взаимоотношений для этих распределяемых сигналов.
Ser/Thr PKC семейство составляет ~2% kinome человека. PKCs широко законсервированы у эукариот в пределах от одиночной изоформы у почкующихся дрожжей (S. cerevisiae) до 5 изоформ у D. melanogaster и 12 у млекопитающих13. Большое количество членов семейства PKC у млекопитающих и их широкое перекрывание в отношении специфичности к субстратам, создают затруднения в попытке выявить специфические функции у членов этого класса киназ. Хотя степень перекрывания значительна, как показывают генетические эксперименты на мышах, увеличиваются доказательства, подкрепляющие индивидуальные, не перекрывающиеся, хотя часто и незначительные роли для большинства членов этого семейства14.
Все изоформы PKC имеют общий сильно законсервированный С-терминальный киназный домен, который сцеплен с помощью шарнирной области с более дивергентным N-терминальным регуляторным доменом (Fig. 1a). Будучи неактивной, PKC ауто-ингибируется за счет псевдо-субстратной последовательности, которая присутствует в регуляторном домене, и которая занимает карман, связывающий субстрат, во всем остальном отношении киназный домен функционален15. PKC активируется, когда вторичные мессенджеры и/или аллостерические эффекторы соединяются с регуляторным доменом, обычно на плазматической мембране (Fig. 1b). Это нарушает стыковочный регуляторный киназный домен, который смещает связанный псевдосубстратный регион из активного сайта, делая возможной активацию PKC16, 17.
Семейство PKC может быть подразделено на 4 структурно и функционально различающиеся подгруппы, распознаваемые по из дивергентным регуляторным доменам (Fig. 1a). Обычные PKCs (cPKCs) представлены
PKCα,
PKCβ и
PKCγ . Это семейство активируется с помощью комбинации diacylglycerol и phospholipid, соединяющихся с их доменами conserved region 1 (C1), и с помощью Ca
2+-зависимого связывания phospholipid с их C2 доменами. Новые PKCs (nPKCs), которые включают
PKCδ,
PKCε,
PKCθ и PKCη, сходным образом активируются с помощью diacylglycerol и phospholipids, но они не реагируют непосредственно на Ca
2+ (rev. Ref. 13). Атипические PKCs (aPKCs;
PKCι (известна как PKCλ у мыши) и
PKCζ) не зависят от Ca
2+ или diacylglycerol для активации, а вместо этого аллостерически активируются за счет взаимодействия их
Phox/Bem 1(PB1) domain с partitioning defective 6 (PAR6)-CDC42 комплексом, который участвует в спецификации клеточной полярности
18 (see below). Члены подсемейства PKN (PKN1, PKN2 и PKN3) обладают общим родственным G-белок зависимым аллостерическим способом регуляции и содержат мотивы homology region 1 (HR1) вместо регуляторного PB1 домена. Бивалентный ангажемент HR1a и HR1b мотивов
19 с помощью Rho-family GTPases Rho или Rac (Box 2) высвобождает PKN псевдосубстрат и ведет к активации киназы
20. Недавние доказательства показали, что C-конец PKN1 может быть также необходим для её активации с помощью Rho21. Помимо этих специфических сигналов, др. регуляторные процессы влияют также на функцию PKCs. Сюда входят ковалентная модификация (обычно фосфорилирование) PKCs и их взаимодействие со специфическими партнерами по связыванию, которые могут модулировать потребность в аллостерических воздействиях или в некоторых случаях обходить их всех вместе, как это наблюдается при некоторых взаимодействиях с каркасом (reviewed in Ref. 11).
Модулярная природа этого семейства - PKCs имеют законсервированный киназный домен, связанный с серией дифференциально активируемых регуляторных доменов - позволяет PKC активности осуществлять свои действия с пространственной и временной специфичностью. Она также позволяет PKC активности быть направляемой с помощью множественных воздействий, включая локальную (ограниченную мембраной) продукцию вторичных мессенджеров и взаимодействие с закрепленными на мембране малыми G белками, каркасными и акцессорными белками. В результате семейство PKC оказывается вовлеченным в центр пространственного контроля сигнальной трнс дукции в клетках.
PKC action in cell-cell contacts
Межклеточные взаимодействия могут участвовать в гетерологичном и гомологичном распознавании клеток. Гетерологичное распознавание происходит, когда взаимодействия происходят между разными типами клеток, такими как Т клетки и
antigen-presenting cell (APC) (see below). Гомологичное распознавание клеток происходит между клетками одного и того же происхождения, напр., клетками, формирующими слой поляризованного эпителия. Изоформы PKC играют ключевые роли в контроле сборки и разборки локальных сигнальных комплексов обоих типов клеточного распознавания.
PKCθ regulates T cell recognition of APCs. Взаимодействие эффекторных Т клеток с APC осуществляется посредством множественных межклеточных взаимодействий. Эти взаимодействия являются сутью способности T cell receptor (TCR) распознавать преобразованные пептидные антигены, которые им предоставляются, связанными с major histocompatibility complex (MHC) class I или class II на APC
22. Это событие распознавания запускает активацию Т клеток, которая характеризуется асимметричными делениями Т клеток и процессами дифференцировки, которые определяют природу антигена. Дифференцированные субнаборы CD4
+ T helper (TH) клеток, которые генерируются вследствие инициального распознавания антигена (включая
TH1,
TH2 и
TH17 cells), чем осуществления эффекторных функций, которые имеют отношение к реакции выявления патогена. Инициальный патоген запускает базирующиеся на TCR-ассоциации и TCR-proximal передаче сигналов события, которые частично регулируются с помощью PKCθ и aPKCs
23, 24.
PKCθ экспрессируется высоко, но не исключительно Т клетками25, 26. Такой паттерн экспрессии ведет к выяснению роли PKCθ в пролиферации и дифференцировке Т клеток в ex vivo моделях, это указывает на то, что PKCθ участвует в активации транскрипционных факторов nuclear factor-κB (NF-κB), nuclear factor of activated T cells (NFAT) и activator protein 1 (AP1) (rev. Ref. 27). Ни один из этих транскрипционных факторов, как известно, не участвует в дифференцировке CD4+ T клеток в направлении разных субнаборов. Напротив, исследования in vivo показали, что PKCθ необходимы для путей специфической Т клеточной дифференцировки и эффекторной функции TH1 клеток в ответ на внутриклеточные бактерии Leischmania major28 и вирусы29. Однако в отсутствие PKCθ дифференцировка TH2 клеток дефектна, которая ставит под угрозу иммунную реакцию на гельминты. Сходный дефект в отсутствии PKCθ связан с дифференцировкой TH17 клеток в ответ на аллергены30. Полученные доказательства указывают на то, что PKCθ играет ключевую роль в дифференцировке CD4+ T клеток в определенные субнаборы T helper.
Событие инициации активации T клеток, которое предшествует последующим делениям и дифференцировке субнаборов T
H клеток, запускается с помощью TCR-обеспечиваемого распознавания молекул пептидов, связанных с MHC на поверхности APC. Это событие и активация различных ко-стимулирующих рецепторов (напр., T клеточных ко-рецепторов CD28 вследствие связывания с лигандами их клеток мишеней CD80 или CD86 (Ref. 31)),ведет к сборке сигнальных синапсов, которые представлены самостоятельными субдоменами на мембране. Эти субдомены создают
supramolecular activation complex (SMAC32), который собирается как серия концентрических мембранных доменов, представленных центральным SMAC (cSMAC), периферическим SMAC (pSMAC) и дистальным SMAC (dSMAC)
33. Область контакта между T клетками и APC известна как иммунологический синапс, используя терминологию нервных соединений. Сигнальные белки, которые маркируют эти мембранные субдомены Т клеток, включают TCR и SRC семейство tyrosine kinase LCK в cSMAC, lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA1; также известный как α4β 7 integrin) в pSMAC и трансмембранную phosphotyrosine phosphatase CD45 в dSMAC
34. Сильная стимуляция T клеток ассоциирует с накоплением PKCθ в cSMAC
35. Это рекрутирование нуждается в PKCθ, чтобы взаимодействовать с coiled-coil доменом каркасного белка CARD-containing MAGUK protein 3 (CARMA1; также известного как CARD11)
36. После рекрутирования в cSMAC, PKCθ фосфорилируется с помощью LCK по Tyr90 (Ref. 37) и аутофосфорилируется по Thr219 (Ref. 38). Обе эти модификации необходимы для поддержания PKCθ в иммунологичном синапсе. Более того, исследования на модельных системах указывают на роль PKCθ в контроле NF-κB, NFAT и AP1 посредством фосфорилирования, рекрутирования и/или активации др. рецепторных комплексов белков. таких как adaptor protein B cell lymphoma 10 (который необходим для активации NF-κB), tyrosine kinase-phospholipase C (PLC) пути белков IL-2-inducible T cell kinase (ITK), tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma (TEC) и PLCγ 1 (которая активирует NFAT) и MAPKKK SPAK (которая активирует AP1)
39.
Помимо своей способности регулировать совместно рекрутируемые сигнальные трансдуцеры в SMAC, PKCθ, по-видимому, контролирует стабильность самого иммунологического синапса. Наблюдение вживую компонентов иммунологических синапсов возможно на модельной системе с использованием
total internal reflection fluorescence (TIRF) микроскопии, чтобы отслеживать Т клетки, которые вступают в контакт с поверхностью, которая модифицирована для мимикрии под APCs. Это было проделано для дикого типа и PKCθ-нокаутных Т клеток, взаимодействующих с иммобилизированными Т клеточными агонистами. Доказательства показали, что иммунологические синапсы динамичны в клетках дикого типа с компонентами, перемещающимися в и из синапсов. Напротив нокаутные по PKCθ клеточные синапсы существенно более стабильны
40. Эти различия в динамике этих сигнальных событий влияют на силу, продолжительность и локализацию сигнала. Было также установлено, что паттерн сил сигналов влияет на Т клеточные реакции, так что
anergy гарантирует в ответ поступление слабого сигнала, тогда как сильные сигналы запускают дифференцировку и эффекторную функцию Т клеток
30. Возможно, что границы эффектов PKCθ на дифференцировку и функцию T клеток
in vivo отражает её влияние на динамику SMAC, связанную с разной силой сигнала, которые необходимы для управления путями специфической дифференцировки.
PKC, cell polarity and the Par complex. Полярность существенна для ряда нормальных клеточных функций, включая асимметричные клеточные деления, поддержание целостности эпителия и миграция клеток. В эпителиальных клетках полярность устанавливается с помощью трансмембранных белков, которые действуют как организаторы клеточной поверхности, чтобы свести кортикальные белки вместе и создать каркас для межклеточных суб-апикальных адгезивных структур, которые известны как
tight junctions у млекопитающих и septate соединения у
D. melanogaster. Эти субапикальные соединения физически разделяют апикальный и
basolateral membrane домены клетки и необходимы для начала активной сортировки белков из этих доменов для их поддержания и продолжения
apical-basal polarity41. Потеря апикально-базальной полярности в эпителиальных клетках является основным признаком прогрессирующей злокачественности. aPKCs участвуют в обеспечении клеточной полярности. Они локализуются апикально в поляризованных клетках, они ассоциированы с клеточными соединениями и необходимы для развития апикальной части мембраны
42-45. Более того, aPKCs могут регулировать состав и локализацию комплексов полярности посредством комбинации каркасной и каталитической активности.
Контроль с помощью aPKC комплексов полярности хорошо иллюстрируется dofbvjtlqcndbtv между Par комплексом и lethal giant larvae (LGL; включая LGL1 и LGL2)(Fig. 2a). Par комплекс хорошо законсервирован у метазоа
42, 46, 47. Белки в Par комплексе (ортологами у млекопитающих являются aPKCs, PAR6 и PAR3) впервые были идентифицированы в исследованиях на
Caenorhabditis elegans, у которых нокдаун генов, кодирующих PKC-3, PAR-6 и PAR-3 ведет к аномальному процессу симметричных делений оплодотворенной зиготы и неправильной сегрегации полярных гранул (задних маркеров материнского происхождения); эти дефекты разделения являются характерными признаками фенотипа
par43, 44, 48-50. PAR6 и aPKCs соединяются посредством своих соотв. PB1 доменов (rev. Ref. 51), чтобы сформировать стабильный гетеродимер. RAC1 и CDC42 (которые являются из Rho семейства GTPases) активируют гетеродимер PAR6-aPKC путем освобождения от PAR6-индуцированного ингибирования aPKCs
52, 53. Активные PAR6-aPKC могут затем соединяться с PAR3, который взаимодействует с белками суб-апикальных соединений. Соединение PAR6-aPKC с PAR3 обеспечивается с помощью каталитического домена aPKCs и
PDZ домена PAR6 (Refs 54, 55). Т.о., формируется третичный Par комплекс, который вносит вклад в формирование суб-апикальных соединений и сам локализуется (посредством соединения PAR3) с белками соединений, включая junctional adhesion molecule A, nectin 1 и nectin 3 (Refs 56, 57, 58).
LGL является одним из группы базолатерально расположенных белков опухолевых супрессоров, которые конкурируют с PAR3 за соединение с PAR6-aPKC как у D. melanogaster , так и млекопитающих59, 60. LGL фосфорилируется с помощью aPKC, если LGL оказывается в комплексе с PAR6-aPKC, а aPKC активна; это ведет к отделению от комплекса LGL и транслокации с мембраны60, 61 (Fig. 2a). LGL, следовательно, исключается из апикального клеточного местоположения aPKC-зависимым способом. Фосфорилирование LGL с помощью aPKC может также приводить к автоингибирующим внутримолекулярным взаимодействиям в LGL между его LGL и N-терминальным доменами62, 63. Индуцированное с помощью aPKC фосфорилирование LGL усиливается за счет взаимодействия между aPKC и LGL-ассоциированным белком p32, регуляторным белком, который может вызывать обогащение актином апикальной части мембраны и нарушать поялрность, если избыточно экспрессируется в Madin-Darby canine клетках почек64.
Будучи фосфорилированными с помощью aPKC, и тем самым ограниченными базолатеральными регионами эпителиальных клеток млекопитающих, LGL1 и LGL2 образуют комплекс со связанными с мембраной белками Scribble и discs large 1 (DLG1)65 (Fig. 2b). У D. melanogaster, эти три белка зависят один от др., чтобы установить полярность66. LGL млекопитающих также может вносить вклад в эпителиальную полярность благодаря взаимодействию с базолатерально расположенным syntaxin 4, который участвует в обеспечении экзоцитоза и в поляризованной доставке молекул на базолатеральную часть мембраны67. Комплекс Par и LGL никоим образом не являются единственными комплексами полярности, взаимодействие которых обеспечивается с помощью aPKCs. Др. примеры включают crumbs комплекс и PAR1 (Fig. 2b).
Очевидно, что клетки образуют сложную сигнальную сеть на базе пространственного ограничения и взаимного исключения, чтобы регулировать полярность. Как было суммировано выше, aPKCs являются критическими для этого контроля. Они действуют как каркасы, которые взаимодействуют преимущественно с апикально расположенными комплексами и влияют на их действие посредством их киназной активности. Серии базолатерально расположенных комплексов полярности скорее всего формируют лишь временные комплексы с апикально расположенными белками, т.к. им препятствуют образовывать стабильные ансамбли за счет aPKC-индуцированного фосфорилирования. Изоформы aPKC предопределяют динамику этих сигнальных комплексов.
Неправильный сигнал от регулятора полярности, такой как aPKC, является потенциальным путем к канцерогенезу. В самом деле избыточная экспрессия aPKC или измененная локализация коррелируют с плохим прогнозом при многих эпителиальных раках человека
68-71, а измененные глобальные уровни экспрессии PAR6 и p32 участвуют в озлокачествлении у человека
64, 72. Дальнейшие исследования этих белков и др. предположительно ассоциированных с болезнями белков полярности необходимо для установления того, как измененные уровни и субклеточное распределение белков полярности вносят вклад в болезни и прогноз.
Localized PKC actions in migration
PKC изоформы участвуют в многочисленных миграторных моделях, поскольку они регулируют свойства, такие как динамика цитоскелета (reviewed in Ref. 73) и функционирование различных белков клеточной поверхности, которые участвуют во взаимодействиях клетка-ВКМ и миграции. Эти белки клеточной поверхности включают syndecan 4, который взаимодействует с PKCα74, β 1 integrin, которые поставляются под контролем PKCα и PKCε75, 76, и CD44 (также известного как gp85), который также регулируется с помощью PKC изоформ77 и является непосредственным субстратом для очищенной PKC головного мозга (обычно смесь cPKC)78. Две системы в особенности иллюстрируют пространственное влияние PKC изоформ на продукцию сигналов при миграции, одна связана с cPKC и nPKC-обеспечиваемым контролем передачи сигналов MET и вторая связана с aPKC-обеспечиваемым контролем поведения integrin при миграции. Integrins являются гетеродимерами, состоящими из α- и β-цепей, и являются интегральными для взаимодействия клеток с белками ВКМ. Сила и динамика этих взаимодействий предопределяют насколько эффективно клетки слипаются с субстратом и мигрируют (reviewed in Ref. 79).
cPKC, nPKC and control of the signal generator MET. MET, рецептор hepatocyte growth factor (HGF), стимулирует несколько клеточных функций, таких как рост, миграция и жизнеспособность. Избыточная экспрессия MET или мутации избыточной функции, как полагают, играют роль в переходе опухолей к матастазированию при различных раковых опухолях
80-83. После HGF связывания MET начинает быстро интернализоваться посредством использования типичного пути эндоцитоза рецепторов
clathrin и GTPase
dynamin84, 85. Они затем рекрутируются
early endosome antigen 1 (EEA1)-позитивными периферическими ранними эндосомами, где они остаются активными и способными к передаче сигналов
86-91. Без локализации MET в эндосомах, HGF-обусловленная стимуляция нижестоящих эффекторов, таких как extracellular signal-regulated kinase 1 (ERK1) и ERK2, является субоптимальной
91. PKCε может негативно регулировать передачу сигналов MET путем фосфорилирования Ser985 в MET juxtamembrane регионе, который ассоциирует с редуцированным фосфорилированием Tyr в MET и, следовательно, с неэффективным рекрутированием нижестоящих эффекторов
92. Однако , PKCε оказывает также свое позитивное влияние на передачу сигналов MET к ERK1 и ERK2, путем обеспечения их доставки на фокальные комплексы, где они обеспечивают HGF-индуцированную миграцию клеток. Пока ещё неясно, как PKCε влияет на доставку ERK1 и ERK2 на фокальные комплексы. Однако подчеркнем параллель с находкой, что platelet-derived growth factor способствует рекрутированию β3 integrin, на ERK1 фокальные комплексы, поддерживая β3 integrin-ERK1 ассоциацию
93, PKCε может регулировать локализацию ERK1 и ERK2, контролируя доставку β1 integrin-ERK1 или ERK2 комплексов на плазматическую мембрану. Это д. соответствовать находке, что PKCε контролирует рециклинг β1 integrin
76. Будучи доставленным на плазматическую мембрану активные ERK1 и ERK2, как полагают, регулируют динамику
focal adhesion посредством фосфорилирования paxillin и др. мишеней фокальных адгезий (see below).
Из периферических эндосом, PKCα способствует доставке активированных MET вдоль микротрубочек (Fig. 3), вызывая прогрессивное накопление MET в околоядерном эндомембранном компартменте. Такое поведение согласуется с ролью PKCα в обеспечении доставки в околоядреный компартмент, это ведет к накоплению маркеров этого пути доставки (rev. Ref. 94). Этот пост-эндоцитический перенос не нужен для деграцации MET, но он необходим для эффективной активации и накоплении в ядре онкогена и for the efficient activation and nuclear accumulation of the oncogene и транскрипционного фактора signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)95. Если потребления ядрами STAT3, которое необходимо, чтобы STAT3 достигал своих генов мишеней, ингибируется соединением STA-21 (также известным как deoxytetrangomycin), то HGF-индуцируемая миграция также ингибируется95. Благодаря действию phosphotyrosine phosphatases, STAT3 лишь очень слабо активируется с помощью MET в плазматической мембране и периферических эндосомах. оказавшись в проксимальном к ядру положении, активированный MET может запустить транслокацию в ядро STAT3 (Ref. 95). Т.о., передача сигналов MET на STAT3 нуждается в PKCα-регулируемой доставке MET в околоядерный эндомембранный компартмент (Fig. 3).
aPKCs control localized signals in migratory cells. aPKCζ и aPKCι, по-видимому, являются ключевыми модуляторами клеточной миграции благодаря своей способрности способствовать сильно локализованным сигнальным событиям.
In vivo aPKC, как часть активированного Par комплекса (see above), необходима для миграции нейробластов и аксонову
C. elegans96. aPKCs также важна для гаструляции
Xenopus laevis. XGAP, GTPase-activating protein for ADP ribosylation факторы, по-видимому, контролируют выдающийся набор клеточных движений во время гаструляции
X. laevis, которая известна как
convergent extension. XGAP достигает этого путем ограничения локализации Par белков и aPKC на выпячиваемых регионах
97. Более того,во время миграции у
D. melanogaster пограничных клеток, необходимо поддержание их апикально-базальной полярности посредством aPKC-PAR3-PAR6 комплекса, чтобы организовать кластер пограничных клеток и сделать возможной миграцию. Комплекс aPKC-PAR3-PAR6 поддерживает распределения различных белков в разных частях мигрирующих пограничных клеток
98.
Имеются многочисленные модели клеточной миграции, в которых aPKC принимают участие. Одна из них иллюстрирует роль aPKCs в организации сигналов. В клетках почек нормальных крыс aPKCζ and aPKCι необходимы для миграции клеток
99, как и exocyst protein complex100 (Fig. 4a). Экзоцист комплекс состоит из 8 белков, которые в основном ассоциированы с мембранами. Во время миграции нормальных почечных клеток крыс локализация aPKCs экзоцист комплекса на
leading edge взаимо зависима и aPKCζ и aPKCι взаимодействуют с экзоцист комплексом посредством каркасного почечного и головного мозга белка (KIBRA; также известного как WWC1). В отношении функции aPKC-KIBRA-exocyst комплекс служит средством запуска активации ERK1, ERK2 и Jun N-terminal kinase 1 (JNK1) на ведущем крае мигрирующих нормальных клеток почек крыс
99. Доказательства указывают на то, что активация ERK1, ERK2 и JNK1 в этом компартменте контролирует динамику фокальных адгезий; однако глобальное ингибирование активации ERK1, ERK2 или JNK1 не выявляет их роли на ведущем крае по сравнению с др. компартментами, напр., в ядре. Следовательно, возникновение фенотипических последствий в отношении локализованных эффекторов является хорошо скоррелированным (see below). Отражением пространственного разрешения этих событий, aPKC-KIBRA-exocyst комплекс контролирует активность JNK1 на ведущем крае мигрирующей клетки специфически, но не регулирует активность JNK1 в ядре. aPKC-KIBRA-exocyst-зависимая активация JNK1, ERK1 и ERK2 на ведущем крае необходима для MAPK-индуцированного фосфорилирования цитоскелетного белка paxillin в этом компартменте. В свою очередь фосфорилирование paxillin на плазматической мембране ассоциирует с изменениями в динамике фокальных адгезивных комплексов, которые, как полагают, детерминируют скорость миграции. Эти события объясняют частично потребность в функции aPKC в миграции нормальных почечных клеток крыс.
В модели миграции астроцитов, локальная активность aPKCζ действует посредством микротубулярного моторного белка dynein, чтобы детерминировать полярность Golgi и центросом (Fig. 4b). В мигрирующих астроцитах активация интегринов на вновь сформированном ведущем крае делет возможным рекрутирование и активацию комплекса PAR6-aPKCζ посредством поляризованного рекрутирования и активации малой GTPase CDC42(Refs 101, 102), которая непосредственно анцелена на PAR6. Во время миграции астроцитов интегрины, которые активируют по фронту клетки CDC42 и комплекс PAR6-aPKCζ это ведет к последующей переориентации центросом - главного центра организации микротрубочек в клетке. Активация aPKCζ может приводить к фосфорилированию и инактивации Ser/Thr protein kinase glycogen synthase kinase 3β (GSK3β ; роль этого специфического события фосфорилирования для ориентации центросом находится под вопросом по данным Ref. 102), и adenomatous polyposis coli (белок опухолевого супрессора является непосредственным субстратом для GSK3β ), ассоциирует с плюс концами микртрубочек на ведущем крае
103, 104. PAR6-PKCζ комплекс также регулирует пространственно организованную ассоциацию DLG1 млекопитающих и поляризацию клеток adenomatous polyposis coli в этой астроцитной модели. Активация комплекса PAR6-aPKCζ с помощью CDC42 на ведущем крае мигрирующих клеток способствует как локальной ассоциации adenomatous polyposis coli с плюс концами микротрубочек, так сборке точек. содержащих DLG1, на плазматической мембране. Физическое взаимодействие между adenomatous polyposis coli и DLG1 необходимо для поляризации скелета микротрубочек
105.
Perspectives
The examples illustrated here show the importance of PKCs in controlling spatial resolution in signalling processes. Even though signalling cascades are often controlled simply by the presence, absence or activation state of proteins, the effect of signal location can be as important as signal strength, or indeed help to determine net strength, as we have discussed in this Review using the MET and STAT3 example. The localization of signalling molecules to subcellular environments that contain the appropriate downstream targets is essential and to a great extent determines the output of a particular signalling cascade.
Despite the recognition of the importance of localized signalling, our ability to locally interfere with signals to provide evidence of necessity and sufficiency has been limited by a lack of appropriate experimental methodologies. Many high-resolution microscopy approaches have been developed, such as TIRF, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), fluorescence resonance energy transfer (FRET) and stimulated emission depletion (STED), for visualizing and quantifying distribution and interactions of individual molecules in a spatial and temporal context (reviewed in Ref. 106). Such approaches have been employed to monitor the localization of fluorescently tagged PKC isoforms in cells and also to follow their activity, either by autophosphorylation107 or through a reporter108. In the second case, the reporter is a genetically encoded device that changes its conformation and consequently FRET behaviour after it has been phosphorylated by PKC. Such analyses can lend substantial weight of evidence to defining roles of PKCs in controlling specific events in particular compartments. However, these imaging approaches are mostly descriptive of localized processes and do not provide information of the requirement for the protein in the particular location.
Strategies are necessary that allow the manipulation of spatial and dynamic behaviour in a physiological context. Pharmacological agents or small interfering RNAs that interfere with signalling cascades typically have global effects that are often chronic (knockdown or knockout) and ignore spatial resolution. However, a drug-dependent dimerization approach, originating in the Schreiber laboratory109, is a promising tool to overcome these spatial restrictions. It exploits the mechanism of action of the immunosuppressive drug rapamycin, which binds FK506-binding protein 12 (FKBP12) and, as a complex with FKBP12, interacts with the FKBP rapamycin-binding (FRB) domain on mammalian target of rapamycin (mTOR), thereby disrupting its function. As modular binding domains, FKBP12 and the FRB from mTOR can be fused to other proteins, which allows the recruitment of any genetically encoded enzymatic activity to any protein marker-defined compartment, thereby leading to the modification of local behaviour in cellular systems. This approach has been used to manipulate specific membrane phosphoinositide compartments110, 111. One of these studies used the recruitment of the inositol lipid phosphatase myotubularin 1 into RAB5-positive endosomes to locally dephosphorylate phosphatidylinositol 3-phosphate and phosphatidylinositol 3,5 bisphosphate, which shows that these lipids determine the normal maturation of this endosomal compartment and the flux of certain receptors through it110. This strategy is broadly applicable to localized intervention in many different signalling contexts and promises to provide information on the consequences of localized actions.
Although the examples of PKC control exerted on cell–cell contacts and migratory behaviours are distinct, they do share a common theme in that they both involve regulated scaffold functions. The signalling synapses associated with both immune cell receptor signalling and tight junctions have echoes in the signalling interfaces associated with receptors engaged in cell–ECM and cell–growth factor interactions. In all these situations the evidence indicates that PKC isoforms control the localization, assembly and/or disassembly of these signalling platforms.
Сайт создан в системе
uCoz
