Protein tyrosine phosphatases: from genes, to function, to disease
Nicholas K. Tonks Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 833-846 (November 2006) | doi:10.1038/nrm2039
The protein tyrosine phosphatase (PTP) superfamily of enzymes functions in a coordinated manner with protein tyrosine kinases to control signalling pathways that underlie a broad spectrum of fundamental physiological processes. In this review, I describe recent breakthroughs in our understanding of the role of the PTPs in the regulation of signal transduction and the aetiology of human disease
В эту эру 'omics' поисков, которые следуют за секвенированием генома человека, семейства сигнальных молекул становятся определенными, а сложность регуляции сигнальной трансдукции становится очевидной. В противоположность первоначальному мнению о сигнальных путях как простых линейных расположений каскадов фосфорилирования, которые функционируют изолированно, теперь стало ясно, что имеются множество взаимодействующих сигнальных сетей, координация которых в ответ на стимулы предопределяет физиологический исход. Значение фосфорилирования и регуляторная роль протеин киназ установлены; однако, недавно стало очевидным, что протеин фосфатазы не могут больше рассматриваться как пассивные энзимы домашнего хозяйства в этих процессах. Вместо этого киназы и фосфатазы являются партнерами и их активности координируются при регуляции сигнальных ответов. Самостоятельные, но комплементарные функции этих энзимов, подчеркиваются недавними исследованиями, в которых киназы оказались задействованы в контроль амплитуды реакций на передачу сигналов, тогда как фосфатазы, как полагают, играют важную роль в контроле скорости и продолжительности реакции1,2.
В отличие от протеин киназ, которые происходят от общего родоначальника, протеин фосфатазы принадлежать разным семействам, которые структурно и механистически отличны. Среди этих семейств, serine/threonine фосфатазы существуют in vivo как набор holoenzyme комплексов, которые состоят из множественных комбинаций каталитических и регуляторных субъединиц, которые контролируют широкий спектр сигнальных путей3. Эти энзимы катализируют непосредственно гидролиз phospho-субстрат, процесс, который облегчается с помощью двух ионов металла в активном центре энзима. Важность serine/threonine phosphatases подчеркивается их чувствительностью к некоторым ингибиторам, таким как tumour promoter okadaic acid, которые становятся ценными инструментами для характеристики зависимой от фосфорилирования сигнальной трансдукции. Недавно внимание было привлечено haloacid dehalogenases, которые включают фосфатазы, такие как Eyes absent (Eya), которая действуют также как транскрипционный фактор4, и chronophin, который является регулятором фосфорилирования cofilin и тем самым влиет на динамику актинового цитоскелета5. Эти энзимы катализируют дефосфорилирование посредством необычного механизма, который использует существенные остатки aspartic кислоты в активном сайте. Различные фосфатазы также регулируют передачу сигналов благодаря влиянию на небелковые субстраты, включая Src homology-2 (SH2)-domain-containing inositide phosphatases (SHIPs) и synaptojanins, которые катализируют дефосфорилирование inositol phospholipids6.
В обзоре основное внимание уделено protein tyrosine phosphatases (PTPs), которые кодируются с помощью огромнейшего семейства генов фосфатаз. Эти энзимы определяются по сигнатурному мотиву активного сайта HCX5R, в котором цистеиновый остаток функционирует как nucleophile и является существенным для катализа. Имеется описанный состав семейства PTP у людей и др. организмов, внимание теперь обращается на анализ их функции. Классическая роль этих энзимов в качестве регуляторов сигнальной трансдукции top` больше подчеркивается недавними примерами нарушений функции PTP, лежащих в основе болезней людей, включая идентификацию первого PTP онкогена.
The composition and diversity of the PTP family
После полного выяснения последовательностей генома человека стало возможным составить каталог генов. которые представляют собой сверхсемейство PTP (Figs 1, 2). Они кодируют энзимы, которые подразделяются на классические phosphotyrosine (pTyr)-специфические фосфатазы (Fig. 1) и фосфатазы двойной специфичности (DSPs)7,8 (Fig. 2). В общем, имеется около 100 генов в сверхсемействе PTP у человека по сравнению с 90 генами protein tyrosine kinase (PTK) у человека, что указывает на сходные уровни сложности в двух семействах. Однако, количество генов иллюстрирует только минимальный уровень сложности в семействе, т.к. дополнительное разнообразие вносится благодаря использованию альтернативных промоторов, альтернативного сплайсинга мРНК и пост-трансляционных модификаций. Такое структурное разнообразие указывает на функциональную важность PTPs в контроле клеточной передачи сигналов. Сегодня очевидно, что PTPs обладают способностью действовать позитивно и негативно в регуляции сигнальной трансдукции. Более того, PTPs обладают потенциалом высокой субстратной и функциональной специфичности in vivo. Следовательно, определение 'PTP-ome' создает основу для детального анализа структуры, регуляции и физиологической функции этого важного семейства сигнал-передающих энзимов.
Classical pTyr-specific PTPs. Каталитический домен классических PTPs представлен приблизительно 280 остатками и определяется по нескольким коротким мотивам последовательностей, в частности по сигнатурной последовательности, которая функционирует как phosphate-связывающая петля в активном сайте9. Геномы мышей и крыс содержат 38 генов классических PTP, включая osteotesticular (OST)-PTP, которые, как предполагается, кодируют функциональные белки. У людей, очевидно имеется 37 генов классических PTP, со статусом OST - PTP остающиеся неясными8. OST - PTP последовательности человека обнаруживают более значительную, чем ожидалось, дивергенцию от той функциональной дивергенции у мышей и крыс и было предположено, что у людей имеются псевдогены10. Кроме того, имеется 12 PTP псевдогенов., которые уникальны для человека, некоторые из которых транскрибируются, но их функция неизвестна8.
Классические PTPs включают трансмембранные рецептор-подобные белки (RPTPs), которые обладают потенциалом регулировать передачу сигналов посредством контролируемого лигандом дефосфорилирования protein tyrosine (Fig. 1). Многие из RPTPs обладают свойствами молекул клеточной адгезии в своем внеклеточном сегменте и участвуют в процессах, которые связаны с межклеточными и клетка-матрикс контактами. Из 21 RPTPs, 12 обладают тандемным расположением PTP доменов в своем внутриклеточном сегменте. Детальные исследования RPTPs показали, что все активности располагаются в проксимальном к мембране (названном D1) PTP домене. За исключением PTPα11, дистальный к мембране (названный D2) домен неактивен. Тем не менее структурная интеграция домена D2 важна для активности, специфичности и стабильности RPTP как целого12,13. Более того, домен D2 важен для межбелковых взаимодействий, которые регулируют димеризацию RPTP14,15.
Имеются также не-трансмембранные, цитоплазматические PTPs (Fig. 1). Эти энзимы характеризуются регуляторными последовательностями, которые фланкируют каталитический домен и контролируют активность или непосредственно путем взаимодействий с активным сайтом. который модулирует активность (SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-2 (SHP2)), или путем контроля специфичности к субстрату (такой как взаимодействие PTP-PEST с p130cas (Ref. 16) или STEP с mitogen-activated protein kinase (MAPK) ERK17). Эти некаталитические последовательности также контролируют субклеточное распределение, тем самым косвенно регулируя активность путем ограничения доступа к определенным субстратам с определенной субклеточной локализацией.
Dual specificity phosphatases. Имеется приблизительно 65 генов, которые кодируют гетерогенную группу фосфатаз которые широко описаны как DSPs (Fig. 2). Эти энзимы менее консервативны, имеют мало сходных последовательностей вне цистеин содержащего сигнатурного мотива и обладают меньшими каталитическими доменами, чем классические PTPs. В целом они обладают одним и тем же каталитическим механизмом, что и классические PTPs, но конструкция активного сайта DSP позволяет ему приспосабливаться к phosphoserine (pSer)/phosphothreonine (pThr) остаткам. а также к pTyr остаткам в белках. DSPs включают , которые родственны прототипическому VH1 DSP, белку в 20 kDa, который является фактором вирулентности вируса vaccinia18. Одно из наиболее охарактеризованных подразделений этих энзимов катализирует инактивацию MAPKs путем дефосфорилирования сайтов фосфорилирования тирозина и треонина в петле активации киназы. Эти MAPK phosphatases (MKPs) обладают самостоятельными паттернами индукции, субклеточной локализации и специфичности для индивидуальных MAPKs, тем самым они представляют собой реакционную сеть фосфатаз, которые функционируют, ослабляя пути MAPK-зависимой передачи сигналов. Тем не менее, в терминах физиологической функции, некоторые из DSPs могут действительно обнаруживать предпочтение или к tyrosine или serine/threonine остаткам, такие как KAP (cyclin-dependent kinase (CDK)-associated phosphatase), которые дефосфорилируют остатки threonine в активационной петлеl CDKs (Thr160 в )19, или VH1-related DSP (VHR), которые преимущественно дефосфорилируют остатки tyrosine в MAPKs20. Некоторые DSPs, такие как RNA-capping энзимы21 и разнообразные phosphatidylinositol phosphatases (включая myotubularins (MTMs)), нацелены даже на не-белковые субстраты22.
Pseudophosphatase PTPs. Некоторые слены сверхсемейства PTP обладают консервативными доменами с основными признаками PTP, но которые лишены остатков, которые обязательны для катализа23. Недавно достигнуто важное продвиженье в понимании функции таких белков. Прототипический пример, , каталитически неактивен, т.к. он содержит glycine остаток в положении, где обычно цистеин находится в активном сайте. Одиночная точечная мутация, превращающая glycine в cysteine, дает мутантный белок с активностью, которая сходна bona fide с DSP23. Styx взаимодействует с фосфопротеином сперматид CRHSP24 (calcium-regulated heat-stable protein of apparent molecular mass 24k), а мыши, которые несут мутацию зародышевой линии в Styx дефектны по продукции спермиев24. Однако, молекулярные детали функции этой каталитически-неспособной pseudophosphatase предстоит ещё определить.
Некоторые D2 домены в RPTPs сохраняют PTP складку, но лишены остатков, которые являются критическими для активности. Напр., LAR только две точковые мутации необходимы, его D2 домен из неактивного в активный PTP25. Сходным образом, две точковые мутации в D2 PTPα были достаточны, чтобы существенно усилить его активность до уровня D1 домена11. Эта ситуация снова напоминает примеры, встречаемые среди протеин киназ, включая , которая является Ste20-подобной pseudokinase, которая регулирует функцию опухолевой супрессорной киназы LKB1, члена семейства AGC киназ26. Подобно RPTPs, Janus PTKs (JAKs), которые являются критическими регуляторами передач сигналов цитокинов и факторов роста, содержат как активный, так и pseudokinase домен27; последний супрессирует активность каталитического домена и мутирует в myeloproliferative disease polycythemia vera, ведущего к повышению активности JAK27.
Внутри сверхсемейства PTP pseudophosphatases наиболее превалируют среди MTMs22,28 (Fig. 2). Из 14 MTM генов в геноме человека 6 кодируют pseudophosphatases. Недавно было продемонстрировано, что неактивные MTMs формируют комплексы с активными энзимами. Напр., активный (MTMR2) протеин соединяется с pseudophosphatases (Ref. 29) и (Ref. 30), в то время как соединяется с pseudophosphatase (Ref. 31). Эти взаимодействия регулируют как ферментативную активность, так и субклеточную локализацию активных фосфатаз. Инактивирующие мутации в MTMR2 были ассоциированы с type 4B Charcot-Marie-Tooth (CMT) болезнью, нейропатией, характеризующейся аномальной миэлинизацией нервов22,28. Было показано, что мутации pseudophosphatase MTMR13, которые возможно приводят к потере белка, также дают type 4B CMT болезнь30,32, что согласуется с функциональной важностью взаимодействия phosphatase-pseudophosphatase.
Недавние структурные исследования выявили молекулярную основу для распознавания специфических phosphoinositide субстратов с помощью активных MTMs33. Модельный анализ выявил, что хотя складка законсервирована, остатки в MTMR2, которые координируют связывание субстрата, не законсервированы в pseudophosphatases33. Следовательно, наиболее вероятно, что MTM pseudophosphatases неактивны и в противоположность исходным предположениям, не функционируют по захвату (docking) субстратов. Активный сайт MTMs расположен на позитивно заряженной поверхности белка, тогда как область, которая окружает 'active site' pseudophosphatase MTMs преимущественно заряжена негативно. Вообще-то взаимодействие между этими заряженными сторонами могут иметь целью в pseudophosphatase выполнять функцию по созданию каркаса.
Regulation of RPTP function
Как можно ожидать семейство энзимов, которые играют критические роли в регуляции передачи клеточных сигналов, активность PTPs четко контролируется in vivo с помощью различных механизмов. Важный аспект этой регуляции был выявлен с помощью существования связанных с рецепторами PTPs, через которых передача сигналов может регулироваться с помощью контролируемого лигандом дефосфорилирования tyrosyl остатков в белках. Недавно достигнут существенный прогресс в определении того, как RPTPs могут контролироваться за счет связывания лигандами, путем идентификации лигандов для RPTPs и некоторых сигнальных событий, которые эти фосфатазы могут регулировать.
The role of RPTP dimerization. Выяснение кристаллической структуры проксимального к мембране домена PTP в RPTPα является важным. Внутри кристалла PTP домены оказались организованы в симметричные димеры, в которых ингибирующий helix-turn-helix wedge мотив от одного домена закрывает активный сайт партнерского домена34. Было предположено, что в димерном состоянии каталитическая активность RPTPs может быть ослаблена за счет взаимного закрытия активных сайтов. Такая модель находится в вызывающем контрасте с RPTKs, которые активируются за счет индуцируемой лигандом димеризации35. Следовательно, регуляция димеризации RPTP за счет связывания лиганда может непосредственно модулировать активность phosphatase и фосфорилирование важных нижестоящих сигнальных молекул (Box 1).
Многие RPTPs содержат два внутриклеточных PTP домена, D1 и D2, которые ставят вопрос, могут ли конструкции, которые содержат оба домена димеризоваться тем же способом, как и изолированные D1 домены PTPα. LAR является RPTP, которая обладает свойствами молекул клеточной адгезии и участвует в контроле межклеточных и клетка-матрикс взаимодействий36. Кристаллическая структура тандемных D1 и D2 доменов LAR показала, что хотя wedge мотив и присутствует в этой структуре, нет доказательств димеризации в кристалле25. Кроме того, D1 и D2 домены были ориентированы так, что оба активных сайта были доступными и стерическое препятствие, вызываемое присутствием D2 д. предупреждать wedge-обусловленную димеризацию D1. Два домена оказывались тесно упакованными один против др., стягиваемые короткими линкерными последовательностями и рядом нековалентных взаимодействий, которые позволили авт. предположить, что такая ориентация д. оставаться предпочтительной и в растворе.
Структура тандемных доменов D1 и D2 из прототипического RPTP CD45 теперь установлена37. Ориентация D1 и D2 доменов очень сходна с таковой у LAR и наблюдалась в кристаллах в двух различных пространственных групп с разными кристаллографическими контактами между соседними молекулами. Снова два домена соединялись короткими линкерами и интерфейсы доменов стабилизировались за счет экстенсивных нековалентных взаимодействий, указывающих, что они отражают предпочтительную ориентацию. Несмотря на это важно помнить, что у RPTPs in vivo, домены PTP соединены через трансмембранный сегмент с внеклеточным сегментом, который может влиять на ориентацию D1 и D2 и на доступность активного сайта D1 для wedge мотива в димере. Фактически исследования PTPα показали, что множественные сегменты белка, включая D2 домен, а также внеклеточный и трансмембранные сегменты, вносят вклад димерное состояние15.
Как функционирует wedge? Используя химерную молекулу, представленную внеклеточным сегментом рецептора epidermal growth factor (EGF), слитого с внутриклеточным сегментом CD45, было показано, что лигандом индуцированная димеризация ингибирует функцию RPTP по регуляции передачи сигналов в T клетках и что этот ингибирующий эффект ослабляется за счет мутаций остатков в wedge мотиве38. Чтобы исследовать дальнейшее значение ингибирующего wedge на регуляцию функции CD45, получали knock-in мышей, у которых Glu613, который как считается является кончиком wedge, мутировал в arginine. Эта мутация, как предполагалось д. предупреждать wedge-обусловленное ингибирование CD45 в димере. Мыши, которые экспрессировали мутацию CD45-Glu613Arg выглядели нормальными в ранний период жизни, но с возрастом обнаруживали активацию лимфоцитов, развитие lymphoproliferative синдрома и в конечном итоге волчанка-подобного аутоиммунного заболевания39.
Недавние исследования показали, что генетическая элиминация B клеток у таких knock-in мышей устраняла лимфопролиферативное нарушение40. Последствиями экспрессии CD45-Glu613Arg у knock-in мышей в существенно противоположны тем, что наблюдались при нокауте гена CD45, совпадая с мнением, что мутации в wedge устраняют ингибиторное принуждение к функционированию CD45. У CD45-нокаутных мышей В клетки обнаруживают пониженные сигнальные реакции на стимуляцию B-cell receptor (BCR). Напротив, CD45-Glu613Arg B клетки являются гиперпролиферативными и имеют активированные передачи сигналов Ca2+ и MAPK, что проявляет себя нарушением B-клеточного развития.
Физиологические функции CD45 связаны с контролем состояния фосфорилирования tyrosyl остатков в Src семействе PTKs41. Аутоиммунный фенотип у CD45-Glu613Arg мышей напоминает эффект мутантных негативных регуляторов передачи сигналов BCR, таких как Src-семейства PTK Lyn, и могло бы объяснить в терминах состояния фосфорилирования этой PTK. Src-семейства PTKs регулируются с помощью фосфорилирования двух сайтов тирозина: сайт аутофосфорилирования в активационной петле, который способствует активности, и ингибирующий сайт на С конце. У CD45-нокаутных мышей, у которых передача сигналов BCR ослаблена, сайт аутофосфорилирования Lyn гиперфосфорилирован, тогда как обнаруживается пониженное фосфорилирование С-терминального ингибирующего сайта. Следовательно, функция Lyn как ингибитора передачи сигналов BCR потенциируется. Напротив, CD45-Glu613Arg мыши обладают противоположным фенотипом; сайт аутофосфорилирования гипофосфорилирован, это согласуется с тем, что Lyn функционально неактивен в присутствии мутации в wedge. Эти наблюдения указывают на то, что первичной функцией CD45 в B клетках является регуляция Lyn и это может объяснить, почему CD45-Glu613Arg фенотип отображает таковой Lyn-дефицитных мышей. Авт. исследования предположили, что CD45 функционирует в качестве реостата, чтобы создавать сигнальные пороги во время развития В клеток. Они пришли к выводу, что wedge мотив негативно регулирует активность CD45, делая возможной максимальную активацию Lyn, которая соответственно функционирует, чтобы ослабить передачу сигналов BCR. Эти данные четко показывают регуляторную важность wedge мотива. Однако, вовлекается ли механизм индуцируемого димерами ингибирования или некоторые др. эффекты, такие как контроль взаимодействия с субстратами, ещё предстоит определить.
Ligands for RPTPs. Если димеризация рассматривается как механизм для регуляции активности RPTP, то возникает вопрос об идентификации потенциальных лигандов. В случае CD45, который высоко гликозилирован и составляет до 10% поверхности гематопоэтических клеток, , такие как , могут соединяться с внеклеточным сегментом. Тем не менее эти взаимодействия, по-видимому, не модулируют активность PTP41. Гликозилирование внеклеточного сегмента CD45, и следовательно, его размер и форма, варьируют в зависимости от альтернативного сплайсинга прежде всего трех экзонов (обозначенных A, B и C). Наиболее крупные и более сильно гликозилированные и sialylated формы, такие как RABC, которые экспрессируют все три экзона, наименее эффективны в отношении формирования димеров, чем самая маленькая форма, названная RO42. Когда CD45-дефицитная Т-клеточная линия H45 воссоздана с физиологическими уровнями RO и RABC изоформ, то RO, как было установлено, димеризуется более эффективно, чем RABC при воссоздании передачи сигналов через Т-клеточные рецепторы42. Это привело к предположению, что имеется равновесие между мономерами и димерами CD45 на клеточной поверхности, причем активность CD45 обеспечивается дифференциальной димеризацией специфических изоформ. Однако, т.к. происходит обмен изоформами на клеточной поверхности по временной шкале дней, то это д. отражать механизм регуляции в терминах продолжительности42. Мутанты, которые сохраняют только внеклеточный и трансмембранный сегменты CD45 сохраняют способность димеризоваться. Более того, мутации в Glu613Arg-wedge не меняют степени димеризации RO изоформы CD45. Следовательно, роль wedge в модуляции активности в этом контексте и потенциальные механизмы острой регуляции активности CD45, остаются неясными.
Наиболее охарактеризованный пример острой регуляции RPTP за счет связывания лиганда - это ингибирование активности RPTPζ вследствие связывания pleiotrophin (PTN)43 (Fig. 3a), но обеспечивается ли этот эффект димеризацией PTP неизвестно. Потенциальным нижестоящим субстратом для RPTP&zeta:, который обнаруживает повышенное фосфорилирование в ответ на PTN, является и β-catenin43, который является компонентом cadherin-catenin клеточных адгезивных комплексов, и β-adducin44, который является цитоскелетным белком, который регулирует актиновые филаменты. Эти находки указывают на то, что некоторые эффекты на цитоскелетную архитектуру запускаются с помощью PTN и могут быть опосредованы за счет RPTPζ-индуцированных изменений в фосфорилировании тирозина. Сравнительно недавно p190 Rho GAP, GTPase-activating protein, который является мощным ингибитором Rho, был идентифицирован в качестве PTN-модулируемого субстрата для RPTPζ45. Аберрантное фосфорилирование p190 Rho GAP нарушает Rho-ROCK (Rho-associated kinase) сигнальный путь, который регулирует клеточный морфогенез путем ремоделирования актинового цитоскелета и может лежать в основе нарушений пространственного обучения и усиления долговременной потенциации у RPTPζ-дефицитных мышей46.
Further insights from neuronal systems. В интригующей симметрии с регуляцией RPTKs47, heparan sulphate proteoglycans (HSPGs) были распознаны, как играющие важную роль в регуляции функции RPTPs. Напр., HSPGs agrin и collagen XVIII были идентифицированы в качестве лигандов для RPTPσ в нейронах48. Недавно внеклеточный сегмент LAR, близкого родственника PTPσ, был использован в качестве зонда для сравнения окрашивания дикого типа и делеционных мутантов срезов эмбрионов Drosophila melanogaster, которое идентифицировало HSPG syndecan (Sdc) в качестве лиганда для LAR49. Это высокого сродства взаимодействие с LAR, обладающим sub-nanomolar сродством к Sdc in vitro. In vivo, Sdc, который является трансмембранным белком клеточной поверхности мышц, взаимодействует с LAR в транс-положении, чтобы регулировать позитивно функцию этого RPTP в ростовых конусах двигательных нейронов, обеспечивая тем самым сигнальные события, которые ассоциируют в решениями о наведении аксонов, что приводит к мышечной иннервации49 (Fig. 3b). В отдельном исследовании, Sdc был также идентифицирован в качестве лиганда высокго сродства, который способствует функции LAR во время формирования нейро-мышечных соединений у личинок D. melanogaster50. В том же исследовании др. HSPG, Dallylike (Dlp), который является glycosylphosphatidylinositol-anchored glypican, также был идентифицирован как LAR лиганд высокого сродства50 (Fig. 3b). Фосфорилированный по тирозину белок Enabled (Ena), который соединяется с цитоплазматическим сегментом LAR, msk идентифицирован как субстрат. RNA interference (RNAi)-обусловленная деплеция LAR усиливала фосфорилирование Ena в KC167 D. melanogaster клетках, в то время как RNAi-обусловлленная деплеция Dlp понижает фосфорилирование Ena. Следовательно, в противовес Sdc, Dlp действует, чтобы ингибировать функцию LAR в синапсах. Кажется, что Sdc и Dlp влияют на общий сигнальный путь в регуляции синаптического морфогенеза и действует путем соединения с LAR и модулирования активности PTP, при этом Dlp служит в качестве доминантного эффектора in vivo50 (Fig. 3b).
LAR обладает свойствами молекул клеточной адгезии из суперсемейства immunoglobulin (Ig), обладая внеклеточным сегментом, который представлен и доменами36. Гетеротипический лиганд Sdc соединяется с Ig доменами, но не с FNIII доменами в LAR50. Дополнительные лиганды были идентифицированы, которые взаимодействуют с FNIII мотивами. Напр., комплекс внеклеточного матрикса laminin-nidogen соединяется со специфическим сплайс-вариантом LAR, который включает последовательность из 9 остатков в FNIII домене-5 (Ref. 51). Это взаимодействие регулирует морфологию в клетках HeLa51. Некоторые др. RPTPs также обладают свойствами молекул клеточной адгезии Ig-сверхсемейства и, как впервые было показано для PTPmu52,53, участвуют в гомофильных связывающих взаимодействиях (т.е. лиганд для RPTP на поверхности одной клетки является молекулой того же самого энзима на соседней клетке).
Дальнейшее внимание было сфокусировано на LAR после идентификации новой изоформы его внеклеточного сегмента, которая содержит уникальную N-терминальную последовательность, которая слита с С-терминальной порцией FNIII домена-5. Этот белок, обозначенный LARFN5C, обладает способностью к гомофильному соединению и ассоциирует с полной длиной LAR в нейронах54, способствуя росту нейритов за счет активации множественных сигнальных путей55 (Fig. 3b). Характеристика механизмов, которые координируют разные лиганд-связывающие взаимодействия - предмет дальнейших исследований.
Regulation of RPTP by reversible oxidation
Недавно продукция reactive oxygen species (ROS), таких как hydrogen peroxide, и возникающая в результате пост-трансляционная модификация белков за счет обратимого окисления, оказались участниками регуляции зависимых от фосфорилирования тирозина сигнальных путей, которые инициируются широким кругом стимулов, включая факторы роста, гормоны, цитокины и клеточные стрессы56-58. Внимание было привлечено к PTPs в качестве мишеней для ROS, т.к. сигнатурный мотив этого семейства, (I/V)HCXXGXXR(S/T), содержит инвариантный цистеиновый остаток, который, благодаря уникальным условиям активного сайта PTP, характеризуется чрезвычайно низким 59-61. Низкое pKα означает, что этот цистеин присутствует как thiolate ион при нейтральном pH, это способствует его функции как nucleophile при катализе, но наделяет его высокой чувствительностью к окислению с соотв. аннулированием nucleophilic функции и ингибированием активности PTP. Это представляет новое подкрепление контроля зависимой от фосфорилирования тирозина предачи сигналов, которая осуществляется на уровне PTPs.
Mechanistic insights. Многие PTPs, как было установлено, окисляются временно в ответ на разные клеточные стимулы (Table 1). В зависимости от степени окисления цистеин активного сайта в PTPs может быть превращен в sulphenic (SOH), sulphinic (SO2H) или sulphonic (SO3H) кислоту. Для окисления, представляющего механизм для обратимой регуляции функции PTP, существенно, что цистеин активного сайта не окисляется далее, чем sulphenic кислота, т.к. при более высокой степени окисления наступают необратимые модификации. В классических PTPs, таких как PTP1B, мы имеем сегодня объяснение того, как это достигается. Окисление nucleophilic цистеина в sulphenic кислоту сопровождается её превращением в циклические sulphenamide виды (Fig. 4), которые вызывают выраженные конформационные изменения в активном сайте PTP, которые разрывают взаимодействие с субстратом и экспозируют окисленный цистеин в клеточную среду62 (Fig. 5). Это обладает потенциалом служить двум целям предупреждения необратимого окисления в более высокие окисленные формы и облегчения восстановления sulphenamide, чтобы восстановить активную форму PTP.
Двойной специфичности фосфатазы cdc25c и , а также low-Mr PTP, также чувствительны к окислению. В отличие от классических PTPs, эти энзимы содержат второй цистеиновый остаток в своем активном сайте. Вследствие окисления nucleophilic цистеина внутри сигнатурного мотива, формируется дисульфидная связь с соседним цистеином, защищающая энзим от необратимой инактивации, которая может быть результатом более высоко окисленных видов60. Связь S-S может быть легко устранена, это гарантирует временную природу модификации и возвращает энзим к его активной форме.
Oxidation of RPTPs. Интересен дальнейший аспект контроля за счет окисления у RPTPs. Для RPTPs с тандемным расположением PTP доменов в их внутриклеточном сегменте, выявляется структурное отличие между двумя доменами, которое предполагает различие функции. Напр., все D2 домены филогенетически отличны от D1 доменов, что определяет разные субсемейства PTP доменов9. Внутри LAR RPTP субтипа, сходство последовательностей между D2 доменами у LAR, PTPsigma и PTPdelta даже выше. чем между солотв. каталитически функционирующими D1 доменами9. Данные по филогенетическому анализу, что дупликации, которые преобразили RPTPs, которые несут два PTP домена, произошли в ранней эволюции вместе с высоким уровнем консервации D2 доменов, что подтверждает самостоятельную функцию D1 доменов. Недавно, базируясь на исследованиях RPTPα, было показано, что D2 домен обладает более значительной чувствительностью к окислению, чем D1 домен63 и может формировать внутримолекулярные (S-S) мостики вследствие воздействия H2O2, которое вносит вклад в стабилизацию PTP димеров64. Более того, окисление индуцирует конформационные изменения в D2, которые могут передаваться внеклеточному сегменту рецепторной PTP, что согласуется с потенциалом 'inside-out' передачей сигналов59 (Box 1). Эти наблюдения указывают на то, что D2 домены могут функционировать как redox сенсоры и было бы интересно посмотреть относится ли это к др. RPTPs. Кроме того, выявление механизмов, с помощью которых окисление D2 доменов может влиять на каталитическую активность D1 доменов могло бы помочь определить сигнальную функцию RPTPs как целого.
Important unresolved issues. Согласно современной модели физиологические стимулы, такие как факторы роста или привлечение антигенов рецепторов, запускают локальную продукцию ROS. Это ведет к окислению и инактивации тех PTPs, которые обычно функционируют, чтобы ослабить сигнальную реакцию, тем самым способствуют фосфорилированию тирозина и усилению передачи сигналов. окисление является временным с возвращением обратно PTPs к своему активному состоянию за счет действия клеточных восстановительных агентов, таких как thioredoxin или glutathione, приводящих к прекращению сигналов.
Хотя чрезвычайно возбуждает, как новый слой контролирует pTyr-зависимую передачу сигналов, имеется несколько вопросов, которые д. б. решены прежде чем физиологического значения redox регуляции PTPs будет установлено. В частности превалирует мнение о ROS как агентах неразборчивых повреждений скорее, чем о вторичных мессенджерах в клеточной передаче сигналов. Наблюдается тонкий контроль над продукцией ROS с помощью Nox (NADPH oxidase) энзимов, включая потребность для сборки в мультипротеиновых комплексах с поддерживающими и активаторными белками, в фосфорилировании регуляторных субъединиц, связывании inositol phospholipids и малой GTPase Rac57. Регуляция Duox (dual oxidase) NADPH oxidases с помощью Ca2+ добавляет дальнейший уровень контроля57. Несмотря на это важно объяснить, как ROS будучи продуцированными обладают специфичностью к окислению определенных PTPs. Т.к. цистеин активного сайта особенно чувствителен, то возможно, что д. существовать врожденные различия в чувствительности к окислению между индивидуальными PTPs65. Возможно также, что эти PTPs, которые ко-локализуются с сайтами продукции ROS д. окисляться в первую очередь. Напр., было показано, что Nox4 регулирует окисление PTP1B в ответ на insulin66 и ко-локализуется с PTP1B на внутриклеточных мембранах67. Следовательно, важно определять, где в клетке происходит окисление, точный источник ROS, такой как Nox энзим66 или митохондрии68 и как регулируется локализация PTPs. Более того, исследования окисления PTP сообщают кстати о кондукторах при условиях, богатых O2, скорее, чем при низких физиологических концентрациях O2, которые встречаются в тканях. Интересно, сообщалось, что в кардиомиоцитах гипоксия индуцирует повышение ROS по сравнению с нормотоксическими условиями, как было установлено по DCF (2',7'-dichlorodihydrofluorescein) флюоресценции благодаря повышенной генерации ROS митохондриями69. Тем не менее важно оценить эффекты гипоксии на окисление PTP.
PTPs and human disease
Давно известнро, что PTPs не только обладают способностью функционировать как ингибиторы pTyr-зависимой передачи сигналов, но и также действовать как позитивные регуляторы, способствующие передаче сигналов, как в случае CD45 (Ref. 41). Некоторые PTPs были идентифицированы как продукты генов опухолевых супрессоров70 (Box 2; Table 2). Сегодня имеются примеры абератного позитивного контроля PTPs в раковых опухолях у людей; избыточная экспрессия регулирующей клеточный цикл фосфатазы cdc25 была выявлена во множественных раках, что часто коррелирует с плохим прогнозом71. Новым явилась идентификация первого онкогена, который кодирует PTP. Сегодня некоторые компоненты phosphatidylinositol 3-kinase сигнального пути задействованы при раке или сендромах предрасположенности к раку, включая опухоль-супрессирующую фосфатазу PTEN72, сегодня очевидно, что разнообразные синдромы могут быть объяснены в терминах аберрантной регуляции Ras-MAPK сигнального пути73. Одним из аспектов этого являются мутации избыточной функции в гене PTPN11, который кодирует SH2-домен-содержащую PTP SHP2 (Box 3).
PTPN22/PTP Lyp and autoimmunity. Важно отметить, что аберрантная регуляция членов сверхсемейства PTP ассоциирует также с болезнями иными, чем рак8. В интересной серии исследований гена , который кодирует PTP Lyp, идентифицирован single nucleotide polymorphism (SNP), который возникает в результате точковой мутации Arg620 в триптофан. Эта мутация, как было установлено, является распространенным фактором риска для аутоиммунных болезней, включая диабет типа I diabetes74, 75, 76,77 и системную lupus erythematosus78. PTPN22 Lyp экспрессируется в гематопоэтических клетках и действует как ингибитор активации Т клеток. В согласии с этим сайт аутофосфорилирования PTKs Lck и ZAP70 м T-клеточного рецептора-zeta (TCRζ) цепи был идентифицирован в качестве субстрата этой фосфатазы79. инициальная характеристика PTPN22-Arg620Trp SNP была сфокусирована на том факте, что эта мутация возникает в участке. богатом proline, не-каталитического сегмента энзима и нарушает ассоциацию с SH3 доменом Csk, Src C-терминальной киназы74. Теперь установлено, что это действительно мутация с избыточной функцией, которая генерирует более активную PTP, которая является наиболее эффективным ингибитором передачи T-клеточных сигналов, чем энзим дикого типа80. Однако, механизм, с помощью которого эта мутация в некаталитическом сегменте ведет к активации фосфатазы ещё предстоит определить. Предполагается, что такая активирующая мутация в PTPN22 может вызывать предрасположенность к аутоиммунным заболеваниям или в результате неспособности делетировать аутореактивные Т клетки или из-за недостаточной активности регуляторных Т клеток80. Было бы интересно выяснить возможность того, что низко молекулярные ингибиторы PTP-Lyp могут оказаться терапевтически эффективными при аутоиммунных заболеваниях.
Future directions
Recently, we have witnessed important breakthroughs in the functional characterization of members of the PTP superfamily that have provided new perspectives on the regulation of signal transduction. Ligands for some RPTPs, and the signalling pathways that they regulate, have been identified and characterized. Now, there are specific examples of receptor PTPs that regulate signal transduction through ligand-controlled dephosphorylation of tyrosyl residues in proteins. Reversible oxidation is becoming established as a novel mechanism for the control of PTP function. Future studies must define the links between oxidation of specific PTPs and the regulation of pTyr-dependent signalling in a physiological context. Of particular significance has been the definition of links between the disruption of PTP function and the aetiology of human disease.
As our understanding of the physiological importance of PTPs has matured, so has enthusiasm for the development of PTP-based therapeutics, fuelled in particular by compelling data that define PTP1B as an outstanding target for the treatment of diabetes and obesity81. However, the PTPs are challenging targets for the development of active-site-directed inhibitors. Their susceptibility to oxidation can cause problems in high-throughput screens and the tendency for potent inhibitors to be highly charged, such as non-hydrolysable pTyr mimetics, presents challenges with respect to bioavailability. Antisense-based therapeutics that target PTP1B have shown efficacy in type II diabetes and are now in phase 2 clinical trials82,83, providing further validation of this target in humans. The future will no doubt see alternative approaches for therapeutic development, such as those involving secondary allosteric sites recently described for PTP1B84. The development of 'wedge domain' peptides as inhibitors of RPTPs, based upon the dimerization model of the regulation of PTP function, suggests a new strategy for PTP inhibition85. Recent data highlighting the importance of RPTPsigma in regulating post-injury axon regrowth in the peripheral and central nervous system86 suggest that in some circumstances there may also be utility for therapeutic agents that target the extracellular segment of RPTPs.
Nonetheless, the PTP field is still in its infancy and many of these enzymes remain largely uncharacterized. The description of the 'PTP-ome' will now facilitate functional analyses of the family as a whole, for example by RNAi87. The application of substrate-trapping mutant technology88 will help to define the physiological substrate specificity of members of the PTP superfamily, as illustrated by the recent elucidation of the role of PTPRO/GLEPP1 in the dephosphorylation and inactivation of Eph receptor PTKs, and thereby in the regulation of retinal axon guidance in the developing nervous system89. As further progress is made in defining the signalling function of PTPs and elucidating novel links to human disease, it is anticipated that new insights into therapeutic development will be revealed, either at the level of the PTPs themselves or from targets within the pathways they regulate.
