Посещений:
RETINOID-RELATED ORPHAN RECEPTORS (RORs)

Функции

Retinoid-related orphan receptors (RORs): critical roles in development, immunity, circadian rhythm, and cellular metabolism
Anton M. Jetten
Nucl Recept Signal. 2009; 7: e003.| doi: 10.1621/nrs.07003. PMCID: PMC2670432

The last few years have witnessed a rapid increase in our knowledge of the retinoid-related orphan receptors RORα, -β, and -γ (NR1F1-3), their mechanism of action, physiological functions, and their potential role in several pathologies. The characterization of ROR-deficient mice and gene expression profiling in particular have provided great insights into the critical functions of RORs in the regulation of a variety of physiological processes. These studies revealed that RORα plays a critical role in the development of the cerebellum, that both RORα and RORβ are required for the maturation of photoreceptors in the retina, and that RORγ is essential for the development of several secondary lymphoid tissues, including lymph nodes. RORs have been further implicated in the regulation of various metabolic pathways, energy homeostasis, and thymopoiesis. Recent studies identified a critical role for RORγ in lineage specification of uncommitted CD4+ T helper cells into Th17 cells. In addition, RORs regulate the expression of several components of the circadian clock and may play a role in integrating the circadian clock and the rhythmic pattern of expression of downstream (metabolic) genes. Study of ROR target genes has provided insights into the mechanisms by which RORs control these processes. Moreover, several reports have presented evidence for a potential role of RORs in several pathologies, including osteoporosis, several autoimmune diseases, asthma, cancer, and obesity, and raised the possibility that RORs may serve as potential targets for chemotherapeutic intervention. This prospect was strengthened by recent evidence showing that RORs can function as ligand-dependent transcription factors.

Клонирование некоторых рецепторов стероидных гормонов в 1980s привело к интенсивному исследованию многими лаб. дополнительных, новых членов сверхсемейства стероидных гормонов [Aranda and Pascual, 2001; Desvergne and Wahli, 1999; Escriva et al., 2000; Evans, 1988; Giguere, 1999; Kumar and Thompson, 1999; Novac and Heinzel, 2004; Willy and Mangelsdorf, 1998]. Это привело к идентификации ряда орфановых рецепторов, включая членов подсемейства retinoid-related orphan receptor (ROR), которое состоит из RORα (NR1F1, RORA или RZRα)[Becker-Andre et al., 1993; Giguere et al., 1995; Giguere et al., 1994], RORβ (NR1F2, RORB или RZR?) [Andre et al., 1998b; Carlberg et al., 1994; Schaeren-Wiemers et al., 1997] и RORγ (NR1F3, RORC или TOR) [He et al., 1998; Hirose et al., 1994; Medvedev et al., 1996; Ortiz et al., 1995; Sun et al., 2000]. ROR гены были клонированы от нескольких видов млекопитающих [Becker-Andre et al., 1993; Carlberg et al., 1994; Giguere et al., 1994; He et al., 1998; Hirose et al., 1994; Jetten and Joo, 2006; Koibuchi and Chin, 1998; Medvedev et al., 1996; Ortiz et al., 1995] и рыбок данио [Flores et al., 2007]. ROR ортологи были также идентифицированы у некоторых низших видов, включая Drosophila hormone receptor 3 (DHR3) у Drosophila melanogaster [Carney et al., 1997; Gates et al., 2004; Horner et al., 1995; Koelle et al., 1992; Sullivan and Thummel, 2003; Thummel, 1995], CHR3 у Caenorhabditis elegans [Kostrouch et al., 1995; Palli et al., 1997; Palli et al., 1996] и MHR3 у Manduca sexta [Hiruma and Riddiford, 2004; Lan et al., 1999; Lan et al., 1997; Langelan et al., 2000; Palli et al., 1992; Riddiford et al., 2003].

ROR structure and activity


ROR gene structure


Ген RORα картируется на хромосоме человека 15q22.2 и занимает довоно большую область генома в 730 kb, представленную 15 экзонами. Гены RORβ и RORγ картируются в 9q21.13 и 1q21.3 и занимают приблизительно 188 и 24 kb, соотв. В результате использования альтернативных промоторов и сплайсинга экзонов каждый ген ROR генерирует несколько изоформ, которые отличаются только по своему N-концу [Andre et al., 1998b; Giguere et al., 1994; Hamilton et al., 1996; He et al., 1998; Hirose et al., 1994; Matysiak-Scholze and Nehls, 1997; Medvedev et al., 1996; Sun et al., 2000; Villey et al., 1999] (Figure 1). Четыре RORα изоформы выявлены у человека, обозначенные как RORα1-4, и только две изоформы, α1 and α4, были описаны у мышей. Мышиный RORβ ген дает две изоформы, β1 and β2, тогда как человек, по-видимому, экспрессирует только RORβ1 изоформу [Andre et al., 1998b]. И мышиный и человеческий ген RORγ генерирует две изоформы, γ1 и γ2 [He et al., 1998; Hirose et al., 1994; Medvedev et al., 1996; Villey et al., 1999]. Большинство изоформ обнаруживает разные паттерны ткане-специфической экспрессии и участвуют в регуляции разных физиологических процессов и генов мишеней. Напр., RORα3 человека обнаруживается только в семенниках человека [Steinmayr et al., 1998]. RORα1 и RORa;4 преимущественно экспрессируются в мозжечке мышей, тогда как др. ткани мыши экспрессируют преимущественно RORα4 [Chauvet et al., 2002; Hamilton et al., 1996; Matysiak-Scholze and Nehls, 1997]. RORγ2, часто обозначаемый как RORγt, обнаруживается исключительно в немногих самостоятельных типах клеток иммунной системы, тогда как экспрессия ROR?1 ограничена некоторыми др. тканями [Eberl et al., 2004; He et al., 1998; Hirose et al., 1994; Kang et al., 2007]. У мышей экспрессия ROR?2 ограничена шишковидной железой и сетчаткой, тогда как RORγ1 является преимущественной изоформой коры головного мозга, талямуса и гипоталямуса [Andre et al., 1998b]. Хотя большинство ROR изоформ находится под контролем разных промоторов, мало известно о транскрипционной регуляции их ткане-специфической экспрессии.



Figure 1 Schematic representation of ROR family members. Schematic structure of the various human (h) and mouse (m) ROR isoforms.The DNA binding domain (DBD) and ligand binding domain (LBD), and activation function 2 (AF2) are indicated.The variable regions at the N-terminus of each ROR generated by alternative promoter usage and/or alternative slicing are indicated by patterned boxes on the left.The numbers on the right refer to the total number of amino acids in RORs.The different ROR isoforms identified in human and mouse are shown on the right (+/-).

ROR protein structure


ROR гены кодируют белки из 459 - 556 аминокислот (Figure 1). RORs обладают типичной структурой доменов ядерных рецепторов, состоящей из 4 основных функциональных доменов: N-терминальный (A/B) домен, сопровождаемый очень консервативным DNA-binding domain (DBD), шарнирным доменом и C-терминальным ligand-binding domain (LBD) [Evans, 1988; Giguere, 1999; Jetten et al., 2001; Moras and Gronemeyer, 1998; Pike et al., 2000; Steinmetz et al., 2001; Willy and Mangelsdorf, 1998]. RORs регулируют транскрипцию генов путем соединения со специфическими ДНК response elements (ROREs), содержащих консенсусный RGGTCA стержневой мотив, которому предшествует 6-bp A/T-rich последовательность в регуляторном регионе генов мишеней [Andre et al., 1998a; Carlberg et al., 1994; Giguere et al., 1994; Greiner et al., 1996; Jetten et al., 2001; Medvedev et al., 1996; Moraitis and Giguere, 1999; Ortiz et al., 1995; Schrader et al., 1996]. RORs связывают ROREs в виде мономера и не образуют гетеродимеров с retinoid-X receptors (RXRs) [Andre et al., 1998b; Carlberg et al., 1994; Giguere et al., 1994; Greiner et al., 1996; Medvedev et al., 1996; Moraitis and Giguere, 1999; Ortiz et al., 1995; Schrader et al., 1996] (Figure 2). Взаимодействие RORs с ROREs обеспечивается с помощью P-box, петли между последними двумя cysteines внутри первого цинкового пальчика, который распознает стержневой мотив в большой борозде, и с помощью C-терминального расширения, область в 30 остатков непосредственно ниже двух цинковых пальчиков, которые взаимодействуют с 5'-AT-rich сегментом в RORE в соседней минорной борозде [Andre et al., 1998b; Giguere et al., 1995; Giguere et al., 1994; Jetten et al., 2001; McBroom et al., 1995; Sundvold and Lien, 2001; Vu-Dac et al., 1997]. Хотя RORα-γ и их разные изоформы распознают близко-родственные ROREs, они обнаруживают разное сродство к разным ROREs. N-конец (A/B домен), как было установлено, играет критическую роль в обеспечении специфичности связывания ДНК для разных ROR изоформ [Andre et al., 1998b; Giguere et al., 1995; Giguere et al., 1994; Sundvold and Lien, 2001; Vu-Dac et al., 1997]. Помимо RORE последовательности и N-конца контекст промотора может служить важным фактором в детерминации, какой из ROR будет рекрутирован на определенный RORE.

Figure 2 Mechanism of action of RORs, physiological functions and roles in disease. RORs bind as a monomer to ROREs consisting of the GGTCA consensus core motif preceded by a 6A/T rich region. REV-ERBs can compete with RORs for binding to ROREs. RORs interact with coactivators or corepressors to positively or negatively regulate gene transcription. RORs are critical in the regulation of many physiological processes and may have a role in several pathologies. Although evidence has been provided indicating that certain ligands can modulate ROR transcriptional activity, whether ROR activity is modulated in vivo by endogenous ligands has yet to be determined. RORs might serve as potential novel targets for chemotherapeutic strategies to intervene in various disease processes.

В некоторых примерах общение между путями ядерных рецепторов использует конкуренцию между рецепторами за соединение с одним и тем же чувствительным элементом. Такое взаимодействие продемонстрировано между RORs и ядерными рецепторами REV-ERBAα и REV-ERBβ (NR1D1 и D2, соотв.), которые распознают субнабор ROREs [Burris, 2008; Giguere et al., 1995]. Поскольку REV-ERB рецепторы действуют как транскрипционные репрессоры, то они способны ингибировать ROR-обеспечиваемую активацию транскрипции за счет конкуренции с RORs за связывание RORE [Austin et al., 1998; Bois-Joyeux et al., 2000; Downes et al., 1996; Forman et al., 1994; Liu et al., 2007b; Medvedev et al., 1997; Retnakaran et al., 1994] (Figure 2). Позитивная и негативная регуляция RORE-обеспечиваемой генной транскрипции с помощью RORs и REV-ERBs, как было установлено, играет роль в контроле экспрессии в головном мозге и мышцах ARNT-like 1 (BMAL1 или ARNTL) и может быть частью некоторых др. регуляторных петель обратной связи [Akashi and Takumi, 2005; Albrecht, 2002; Gachon et al., 2004; Guillaumond et al., 2005; Nakajima et al., 2004; Preitner et al., 2002; Triqueneaux et al., 2004].
LBDs ядерных рецепторов являются многофункциональными и играют роль в связывании лиганда, ядерной локализации, димеризации рецептора и предоставляют интерфейс для взаимодействия с коактиваторами и корепрессорами. Рентгеновский структурный анализ продемонстрировал, что RORs имеют вторичную доменовую структуру, т.е. характеристики ядерных рецепторов [Kallen et al., 2002; Stehlin-Gaon et al., 2003; Stehlin et al., 2001]. LBDs из RORs содержат помимо типичных 12 canonical ?-helices (H1-12), две дополнительные спирали, H2' и H11'. Activation function 2 (AF2) в H12 состоит из PLYKELF, которая на 100% законсервирована в RORs (Figure 1). Делеция H12 или точковые мутации в H12 вызывают потерю трансактивационной активности ROR и дают доминантно-негативные ROR [Kurebayashi et al., 2004; Lau et al., 1999]. Считается, что H10 играет критическую роль в гомо- и гетеродимеризации ядерных рецепторов. Структурный анализ выявил присутствие узла (kink) в H10 в LBD из RORα и RORβ, это д. существенно влиять на способность к димеризации RORs [Kallen et al., 2002; Stehlin-Gaon et al., 2003; Stehlin et al., 2001]. Это согласуется с выводом, что RORs не образуют гомодимеров или гетеродимеров с др. RORs или RXRs.

RORs: ligand-dependent transcription factors


Кристаллография предоставляет информацию не только о структуре LBD, но также о размере лиганд связывающего кармана в RORs [Kallen et al., 2002; Stehlin et al., 2001]. Этот карман в RORβ , как было подсчитано, является 766 A3, сходным с таковым в RORα (722 A3). Моделирование гомологии предсказывает, что лиганд связывающий карман в RORγ сходен по размеру (705 A3), но отличается по форме. Cholesterol, 7-dehydrocholesterol и cholesterol sulfate были идентифицированы как RORα агонисты [Kallen et al., 2004; Kallen et al., 2002]. Они связывают RORα обратимым способом и усиливают зависимую от RORE активацию транскрипции с помощью RORα в клетках, поддерживающихся на лишенной холестерола среде. На этом основании было предположено, что RORα могут действовать как липидные сенсоры и участвовать в регуляции липидного метаболизма. Последнее согласуется с сообщениями, показавшими, что RORα регулируют экспрессию некоторых генов, участвующих в метаболизме липидов [Boukhtouche et al., 2004; Jakel et al., 2006; Kallen et al., 2002; Kang et al., 2007; Lau et al., 2008; Lau et al., 2004; Lind et al., 2005; Mamontova et al., 1998; Wada et al., 2008a]. Однако , функционируют ли cholesterol и метаболиты cholesterol как настоящие физиологические агонисты RORα, и служат ли др. структурно-родственные липиды в качестве эндогенных лигандов для RORα, ещё предстоит установить.
X-ray структурный анализ RORβ(LBD) идентифицировал stearic кислоту в качестве случайно залавливаемого лиганда, который, по-видимому, действует как стабилизатор при заполнении лиганд-связывающего кармана скорее, чем как функциональный лиганд [Stehlin et al., 2001]. Впоследствии некоторые ретиноиды, включая all-trans retinoic acid (ATRA) и синтетический ретиноид ALRT 1550 (ALRT), были идентифицированы в качестве функциональных лигандов для RORβ [Stehlin-Gaon et al., 2003]. ATRA и ALRT 1550 оказались способны связывать обратимо RORβ(LBD) и с высоким сродством, а снижение RORβ-обеспечиваемой активации транскрипции указывает на то , что они действуют как частичные антагонисты. Эти ретиноиды оказались также способными связывать RORγ и ингибировать RORγ-обеспечиваемую трансактивацию, но не соединяются с RORα и не влияют на RORα-индуцируемую трансактивацию [Stehlin-Gaon et al., 2003]. Интересно, что репрессия RORβ-обеспечиваемой транскрипции наблюдается только в нервных клетках, но не в др. типах протестированных клеток, указывая тем самым, что этот антагонизм может быть скорее зависимым от типа клеток и использует взаимодействие со специфическими для нервных клеток RORβ репрессорами [Stehlin-Gaon et al., 2003]. Дальнейшие исследования д. установить, может ли ATRA действовать как настоящий физиологический лиганд для RORβ и RORγ и установить физиологическое значение такого взаимодействия в нервных и не-нервных клетках.
Хотя необходимы дальнейшие исследования. чтобы определить регулируется ли активность in vivo ROR с помощью эндогенных лигандов, кристаллографические и структурные исследования подтверждают концепцию, что активность ROR может модулироваться с помощью специфических эндогенных и/или синтетических (ant)agonists [Kallen et al., 2004; Kallen et al., 2002; Stehlin-Gaon et al., 2003]. Такое заключение очень к месту в связи с выявляемой ролью RORs при некоторых патологиях, включая воспаление, различные аутоиммунные заболевания, ожирение и астму, и обещает, что эти рецепторы могут cлужить в качестве потенциальных мишеней для фармакологических вмешательств в эти болезни (Figure 2).

Interaction with coregulatory proteins


Для многих рецепторов функция связывания лиганда действует как переключатель, который индуцирует конформационные изменения в рецепторе, которые связаны с репозиционированием H12 (AF2) [Darimont et al., 1998; Glass and Rosenfeld, 2000; Harding et al., 1997; Heery et al., 2001; Heery et al., 1997; McInerney et al., 1998; Nagy et al., 1999; Nolte et al., 1998; Xu et al., 1999]. Когда RORs находятся в транскрипционно активной конформации, то H12 с H3 и H4 формируют гидрофобную расщелину и загружают манжетку (clamp), для этого используется участие законсервированного Lys в H3 и консервативного Gluв H12 в RORs [Kallen et al., 2002; Stehlin-Gaon et al., 2003; Stehlin et al., 2001]. Манжетка служит в качестве интерфейса для взаимодействия с LXXLL мотивами, присутствующими в коактиваторах, и родственными мотивами в корепрессорах [Gold et al., 2003; Harris et al., 2002; Kurebayashi et al., 2004; Littman et al., 1999; Moraitis et al., 2002; Xie et al., 2005]. Комплексы рецептор:коактиватор посредством своей histone acetylase активности, индуцируют ацетилирование гистона, это приводит к декомпакции хроматина и усилению транскрипции генов мишеней [Glass and Rosenfeld, 2000; McKenna and O'Malley, 2002; Wolf et al., 2008; Xu, 2005], тогда как ассоциация рецептора с корепрессором ведет к деацетилированию гистонов и последующей компакции хроматина и репрессии генной экспрессии [Horlein et al., 1995; Hu and Lazar, 2000; Nagy et al., 1999].
RORs взаимодействуют с корепрессорами, также как и с коактиваторами, указывая тем самым, что они могут функционировать как репрессоры и активаторы генной транскрипции. Коактиваторы NCOA1 (SRC1), NCOA2 (TIF2 или GRIP1), PGC-1?, p300 и CBP [Atkins et al., 1999; Gold et al., 2003; Harding et al., 1997; Harris et al., 2002; Jetten, 2004; Jetten and Joo, 2006; Kurebayashi et al., 2004; Lau et al., 1999; Lau et al., 2004; Littman et al., 1999; Liu et al., 2007b; Xie et al., 2005] и корепрессоры NCOR1, NCOR2, RIP140 и neuronal interacting factor X (NIX1) [Greiner et al., 2000; Harding et al., 1997; Jetten, 2004; Jetten and Joo, 2006; Johnson et al., 2004; Littman et al., 1999] находятся среди корегуляторов, обнаруженных в ROR протеиновых комплексах. Недавно репрессия ROR-обеспечиваемой активации транскрипции с помощью forkhead box transcription factor p3 (FOXP3) была показана как зависящая от прямого взаимодействия между RORs и FOXP3 [Du et al., 2008; Yang et al., 2008c; Zhou et al., 2008].

Posttranslational modifications


Посттрансляционные модификации, включая фосфорилирование, ацетилирование, убиквитилирование и сумоилирование, играют важную роль в регуляции активности и стабильности ядерных рецепторов [Faus and Haendler, 2006; Popov et al., 2007]. Ubiquitin (Ub)- протеосомная система интимно используется для ремоделирования структуры хроматина и транскрипционного контроля с помощью ядерных рецепторов [Dace et al., 2000; Dennis et al., 2001; Ismail and Nawaz, 2005; Kinyamu et al., 2005; Poukka et al., 1999; Wallace and Cidlowski, 2001]. Протеосомами обеспечиваемое убиквитилирование является также интегральной чатью механизма, с помощью которого контролируется передача сигналов ROR рецепторов. Ингибирование 26S протеосомного комплекса с помощью ингибитора протеосом MG-132 ведет к накоплению ubiquitinated RORα белка и снижает транскрипционную активность этого рецептора [Moraitis and Giguere, 2003]. Сходным образом корепрессор Hairless (Hr) [Cachon-Gonzalez et al., 1994; Thompson et al., 2006], который действует как эффективный репрессор ROR-обеспечиваемой активации транскрипции, усиливает стабильность RORα белка за счет протекции его от протеосомами осуществляемой деградации [Moraitis and Giguere, 2003; Moraitis et al., 2002]. Сообщения, показавшие, что различные субъединицы протеосом, включая протоесомную единицу β типа 6 (PSMB6) и 26S ATPase субъединицу PSMC5, являются частью ROR белковых комплексов, согласуются с ролью системы протеосом в регуляции транскрипционной активности ROR [Atkins et al., 1999; Jetten and Joo, 2006]. Ubiquitin-conjugating enzyme I (UBE2I или UBC9), который катализирует sumoylation, взаимодействует с RORs. Катализирует ли UBE2I ROR sumoylation и изменяет ли активность ROR еще предстоит установить.
Недавние исследвания показали, что активация protein kinase C индуцирует фосфорилирование RORα1 и ингибирует RORα1-обусловленную активацию транскрипции [Duplus et al., 2008], тогда как calmodulin-dependent kinase IV (CaMKIV) , как было показано, усиливает транскрипционную активность RORα за счет механизма, который не использует фосфорилирование RORα с помощью CaMKIV [Kane and Means, 2000]. Extracellular signal-regulated kinase-2 (ERK2) , как сообщалось, фосфорилирует RORα4 in vitro по Thr128 [Lechtken et al., 2007]. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить физиологическое значение этих разных киназ в активности и функции ROR.

RORs and development


Critical role of RORα in cerebellar development


Хотя RORα экспрессируются в разных тканях, включая семенники, почки, жировую ткань и печень, они наиболее высоко экспрессируются в головном мозге, особенно в мозжечке и талямусе [Becker-Andre et al., 1993; Carlberg et al., 1994; Dussault et al., 1998; Hamilton et al., 1996; Matysiak-Scholze and Nehls, 1997; Nakagawa et al., 1997; Nakagawa et al., 1998; Nakagawa and O'Leary, 2003; Vogel et al., 2000]. Функция RORα в развитии головного мозга не была тщательно изучена помимо мозжечка. Высокий уровень экспрессии RORα наблюдается в клетках Пуркинье мозжечка, тогда как RORα не обнаруживаются в слое гранулярных клеток [Ino, 2004; Matsui et al., 1995; Nakagawa et al., 1997; Sashihara et al., 1996; Sotelo and Wassef, 1991]. Во время развития клеток Пуркинье экспрессия RORα впервые обнаруживается на ст. E12.5, сразу после того, как предшественники клеток Пуркинье выходят из митотического цикла и покидают вентрикулярную зону, мигрируя вдоль радиальной глии, чтобы сформировать временную cerebellar plate-подобную структуру [Gold et al., 2003; Gold et al., 2007; Goldowitz and Hamre, 1998; Jetten and Joo, 2006].
RORα нулевые мыши, генерируемые с помощью целенаправленного разрушения гена ROR?, обнаруживают практически идентичный фенотип, что и у гомозиготных staggerer мышей (RORαsg/sg) [Dussault et al., 1998; Hamilton et al., 1996; Herrup and Mullen, 1981; Landis and Sidman, 1978; Sidman et al., 1962; Steinmayr et al., 1998]. Эта естественно возникшая мутантная линия несет внутригенную инсерцию в 6.4 kb, вызванную делецией пятого экзона, кодирующего начало LBD, и сдвиг рамки считывания, который дает преждевременный стоп кодон [Gold et al., 2007; Hamilton et al., 1996]. RORα-дефицитные мыши обнаруживают несколько аномалий, включая тонкие длинные кости, указывают на роль RORα в формировании костей [Meyer et al., 2000]. Кроме того, эти мыши обнаруживают атаксию и тяжелую атрофию мозжечка, характеризующуюся значительно меньшим количеством клеток Пуркинье и потерей гранулярных клеток мозжечка [Doulazmi et al., 2001; Doulazmi et al., 1999; Dussault et al., 1998; Gold et al., 2007; Hamilton et al., 1996; Herrup and Mullen, 1979; Herrup and Mullen, 1981; Landis and Reese, 1977; Landis and Sidman, 1978; Sidman et al., 1962; Steinmayr et al., 1998]. Хотя морфология коры мозжечка у молодых гетерозиготных (RORαsg/+) мышей кажется нормальной, с возрастом ускоряется потеря клеток Пуркинье и гранулярных клеток [Doulazmi et al., 1999; Hadj-Sahraoui et al., 2001; Hadj-Sahraoui et al., 1997; Zanjani et al., 1992].
На ст. E17.5 развития количества генерируемых клеток Пуркинье, по-видимому, сходно у WT и RORαsg/sg мышей [Doulazmi et al., 2001; Vogel et al., 2000]. Однако, на PND5, количество клеток Пуркинье драматически снижается и клетки выглядят дезорганизованными. Выжившие ROR?sg/sg клетки Пуркинье содержат чахлые дендритные веточки, лишенные дистальных колючих побегов и дефицитны по сборке в них зрелых синапсов с гранулярными клетками, это указывает на то, что дендритогенез нарушен. Это сопровождается отсутствием входа parallel fiber (PF) и персистенцией множественных climbing fiber (CF) инневаций [Boukhtouche et al., 2006a; Janmaat et al., 2009; Mariani, 1982; Mariani and Changeux, 1980]. Образование нефункциональных синапсов между PF и клетками Пуркинье ассоциирует с задержкой сдвига с глютаматного транспортера Slc17a6 (VGluT2) на Slc17a7 (VGluT1) в PF терминальных окончаниях и с измененным распределением глютаматовых рецепторов, Grm1 и Grm2, в клетках Пуркинье [Janmaat et al., 2009]. Экспрессия RORα в RORαsg/sg клетках Пуркинье ведет к восстановлению нормального дендритогенеза в органотипических культурах [Boukhtouche et al., 2006a]. Эти наблюдения указывают на то, что RORα не регулируют генезис клеток Пуркинье, а скорее их созревание, особенно дифференцировку дендритов (Figure 3). Эта концепция далее была подтверждена наблюдениями, показавшими, что некоторые гены подавляются в клетках Пуркинье у RORαsg/sg мышей, кодирующие белки, используемые при созревании клеток Пуркинье. Сюда входят гены, участвующие в сигнал-зависимом высвобождении кальция, такие как calmodulin inhibitor Pcp4, IP3 receptor (Itpr1) и его партнер по взаимодействию Cals1, calcium-transporting ATPase Atp2a2 и главный внутриклеточный calcium buffer 1 (Calb1) [Gold et al., 2003; Gold et al., 2007; Hamilton et al., 1996; Messer et al., 1990]. Кроме того, некоторые гены, сцепленные с glutamatergic путем, экспрессировались на пониженных уровнях у RORαsg/sg мышей, включая glutamate рецептор Grm1, glutamate транспортер Slc1a6 и его якорь Spnb3, кодирующий специфический для головного мозга ?-spectrin.

Figure 3 Regulation of Purkinje cell maturation and cerebellar development by RORα. RORα regulates the expression of several genes in Purkinje cells. ROR? becomes highly expressed in postmitotic Purkinje cells. It regulates their maturation, particularly dendritic differentiation. Dendritogenesis and the expression of several genes, including Shh, Itpr1, Pcp4, Calb1, Pcp2, and Slc1a6, normally expressed in mature Purkinje cells, are inhibited in ROR? -deficient mice.The transcription of several of these genes is under direct control of ROR? . Shh released by Purkinje cells interacts with Patched (Ptch) receptors on granule cell precursors, leading to activation of GLI transcription factors and the subsequent induction of proliferation-promoting genes. Reduced Shh expression in Purkinje cells from ROR?-deficient mice is a major factor in the cerebellar atrophy observed in these mice. Cerebellar granule cells and Purkinje cells mutually interact (e.g., glutamatergic synapses).

Промоторные регуляторные регионы некоторых генов, подавленных в RORαsg/sg клетках Пуркинье, включая и те Pcp2, Pcp4, Itpr1, Shh и Slc1a6, содержат ROREs, которые связывают RORα [Gold et al., 2003; Gold et al., 2007; Serinagaoglu et al., 2007]. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) анализ продемонстрировал, что RORα, ассоциированные с этими ROREs in vivo, указывают на то, что эти гены непосредственно регулируются с помощью RORα. Более того, эти исследования установили идентичность некоторых транскрипционных медиаторов, которые участвуют в комплексах ROR? транскрипционной активации на этих ROREs. Интересно, что состав этих RORα:coactivator комплексов, ассоциированных с разными промоторами, обладает определенной специфичностью к промоторам. Напр., RORα транскрипционный комплекс, ассоциированный с Pcp2-RORE содержится в TIP60 (Tat-interactive protein, 60 kD) и SRC-1; Slc1a6-RORE связывающий комплекс, содержится в CBP, TIP60, SRC-1 и GRIP-1; тогда как с Pcp4-RORE ассоциированный комплекс, содержится в β-catenin, SRC-1, p300 и TIP60 [Gold et al., 2003]. Эти результаты указывают на то, что последовательность и контекст промотора из RORE играет критическую роль в детерминации состава комплекса RORα:coactivator, рекрутируемого на каждый из промоторов.
Развитие клеток Пуркинье и гранулярных клеток взаимно зависимо. Позиционирование и морфологическая дифференцировка клеток Пуркинье зависит от гранулярных клеток, тогда как пролиферация гранулярных предшественников нуждается в факторах, высвобождаемых клетками Пуркинье [Goldowitz and Hamre, 1998; Vogel et al., 2000]. При рождении количества гранулярных клеток до некоторой степени редуцируется и это становится наиболее очевидным во время первых недель после рождения. У взрослых RORα-дефицитных мышей гранулярный слой очень тонок и истщен в отношении гранулярных клеток [Doulazmi et al., 2001; Doulazmi et al., 1999; Dussault et al., 1998; Gold et al., 2007; Hamilton et al., 1996; Herrup and Mullen, 1979; Herrup and Mullen, 1981; Landis and Reese, 1977; Landis and Sidman, 1978; Sidman et al., 1962; Steinmayr et al., 1998; Yoon, 1972]. Исследования с использованием WT:staggerer химер показали, что истощение гранулярных клеток мозжечка у RORαsg/sg мышей связано c аномалиями, унаследованными RORαsg/sg клетками Пуркинье [Herrup and Mullen, 1979; Herrup and Mullen, 1981]. Это согласуется с высоким уровнем экспрессии RORα в клетках Пуркинье и отсутствием RORα в гранулярных клетках мозжечка. Sonic hedgehog (Shh), высвобождаемый клетками Пуркинье, играет критическую роль в регуляции пролиферации гранулярных клеток мозжечка [Dahmane and Ruiz i Altaba, 1999; Gold et al., 2003; Kenney et al., 2003; Wallace, 1999] (Figure 3). Взаимодействие Shh с Patched (Ptch) рецепторами на гранулярных предшественниках мозжечка ведет к активации GLI Kruppel-like zinc finger белков и последующей транскрипционной активации N-MYC и др. генов. регулирующих клеточный цикл. Экспрессия Shh в RORαsg/sg клетках Пуркинье редуцируется в несколько раз, указывая тем самым, что репрессия Shh может быть критическим фактором в уменьшении пролиферации гранулярных предшественников [Gold et al., 2003; Gold et al., 2007]. Это согласуется с наблюдаемой репрессией нескольких генов мишеней для Shh, включая N-MYC, в мозжечке RORαsg/sg мышей. Эта гипотеза в дальнейшем была подтверждена в экспериментах, показавших, что Shh способен усиливать пролиферацию клеток гранулярных предшественников в срезах мозжечка от PND4 RORαsg/sg мышей и частично предупреждать уменьшение гранулярных клеток [Boukhtouche et al., 2006a]. Эти наблюдения указывают на то, что подавление Shh у RORαsg/sg мышей является важным фактором вносящим вклад в развитие гипоплазии мозжечка у этих мышей и что RORα действует как позитивный регулятор экспрессии Shh. ChIP анализ показал, что RORα регулирует экспрессию Shh непосредственно через ROREs в промоторной регуляторной области гена Shh. Более того, эти исследования идентифицировали β-catenin и p300 как составляющие RORα трансактивационного комплекса, ассоциированного с RORE в Shh. Ассоциация β-catenin c RORα трансактивационными комплексами подтверждает связь между передачей сигналов Wnt и ROR и согласуется с обнаруженной ролью передачи сигналов Wnt в развитии мозжечка [Salinas et al., 1994; Wang et al., 2001].

Link between RORα and spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1)


Сравнение профилей генной экспрессии указывает на возможную связь между RORα и spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1), аутосомно доминантным нейродегенеративным нарушением, которое характеризуется прогрессирующей потерей моторной координации, нарушением речи и проблемами с глотанием [Serra et al., 2006; Zoghbi and Orr, 2000]. SCA1 вызывается аберрантными эффектами, запускаемыми с помощью расширенных polyglutamine (polyQ) треков в белке ataxin 1 (ATXN1), приводящими к различным степеням нейродегенерации, преимущественно в мозжечке (обусловленными потерей клеток Пуркинье), стволовой части головного мозга и спинном мозге. Sca1[82Q] мутантные мыши, которые экспрессируют Atxn1 белок, содержащий 82 glutamine повтора, обнаруживают тяжелую атаксию и дегенерацию клеток Пуркинье [Burright et al., 1995]. Наблюдается значительное перекрывание между генами, репрессированными в мозжечке Sca1[82Q] мышей и генами, регулируемыми с помощью RORα в клетках Пуркинье, это указывает на возможную связь между ними [Gold et al., 2003; Serra et al., 2004]. Иммуногистохимический анализ показал, что уровень RORα существенно редуцирован в клетках Пуркинье у Sca1[82Q] мышей [Serra et al., 2006]. Эта редукция, как было установлено, по крайней мере, частично обусловлена снижением стабильности RORα белка. Кроме того, было продемонстрировано , что RORα и ATXN1 являются частью одного и того же белкового комплекса. Эта ассоциация непрямая и обеспечивается прямым взаимодействием ATXN1 с коактиватором TIP60, который, как было показано, является частью нескольких ROR?-coactivator комплексов клетках Пуркинье [Gold et al., 2003; Serra et al., 2004]. Считается, что пониженные уровни RORα белка в SCA1 клетках Пуркинье вызывают снижение экспрессии RORα генов мишеней, которые являются критическими для развития и функции клеток Пуркинье и поэтому важны как фактор вносящий вклад в нейродегенерацию, наблюдаемую у SCA1 [Serra et al., 2006].

Physiological Function of RORβ in brain and retina


RORβ обнаруживает ограниченный паттерн экспрессии, который лимитирован определенными регионами головного мозга и сетчаткой [Andre et al., 1998a; Andre et al., 1998b; Azadi et al., 2002; Nakagawa and O'Leary, 2003; Schaeren-Wiemers et al., 1997]. Во время периода между E12.5 и PND5 развития мыши, RORβ экспрессируется в неокортексе и дорсальной части талямуса высоко динамическим и пространственно-временным образом [Jetten and Joo, 2006; Nakagawa and O'Leary, 2003]. В головном мозге взрослых RORβ мРНК экспрессируется на высоком уровне в коре головного мозга, талямусе, гипотялямусе, suprachiasmatic nucleus (SCN), и шишковидной железе, тогда как незначительная экспрессия наблюдается в мозжечке или гиппокампе [Andre et al., 1998a; Andre et al., 1998b; Schaeren-Wiemers et al., 1997; Sumi et al., 2002]. RORβ экспрессируется также в переднем обонятельном ядре заднего и сенсорного кортекса. Эти наблюдения подтверждают, что RORβ существенно ограничен несколькими регионами, участвующими в переработке сенсорной информации.
Изучение RORβ нулевых мышей предоставило некоторую информацию о физиологической функции RORβ. RORβ нулевые мыши обнаруживают несколько моторных дефектов, включая 'утиную' походку и нарушение некоторых нейрологических рефлексов, напр., hind paw clasping рефлекс [Andre et al., 1998a; Masana et al., 2007]. RORβ нулевые мыши обнаруживают некоторые поведенческие отклонения, включая повышенную исследовательскую активность и поведение пониженного страха и обонятельные дефекты [Masana et al., 2007]. Кроме того, RORβ-/- мыши обнаруживают задержку начала плодовитости самцов [Andre et al., 1998a].
Относительно высокая экспрессия в сетчатке и развитие дегенерации сетчатки у RORβ-/- мышей указывает на важную регуляторную функцию RORβ в этой ткани [Andre et al., 1998a]. На ст. E17.5 развития мышей и крыс экспрессия RORβ обнаруживается в formative слое ганглиолярных клеток и слое нейробластов [Andre et al., 1998a; Schaeren-Wiemers et al., 1997; Srinivas et al., 2006]. На PND6, слой нейробластов расщепляется на внутренний нуклеарный слой промежуточных нейронов и наружный нуклеарный слой, где располагаются фоторецепторные клетки, палочки и колбочки. На PND16 и позднее, RORβ всё ещё экспрессируется во всех слоях сетчатки, но наиболее сильно в наиболее наружной части наружного нуклеарного слоя. RORβ-/- обнаруживают некоторые дефекты развития сетчатки. На PND6 наблюдается клеточная потеря в ганглиолярном слое, тогда как интернейроны во внутреннем слое приходят в беспорядок. Хотя наружный ядерный слой и сформирован, но он значительно тоньше, чем в WT сетчатке, но поддерживается в течение нескольких недель. Палочки и колбочки фоторецепторы наружного слоя выглядят дезорганизованными и лишенными наружного и внутреннего сегментов. Эти наблюдения указывают на то, что RORβ играет ключевую роль в созревании фоторецепторов, особенно в формировании наружных сегментов, свет воспринимающих структур колбочек и палочек, содержащих opsin и rhodopsin, соотв. [Srinivas et al., 2006].
У большинства млекопитающих цветное зрение зависит от фотопигментов, S и M opsin, которые синтезируются разными популяциями колбочек [Ebrey and Koutalos, 2001]. У WT мышей экспрессия S opsin наблюдается на PND6, а на PND13 он концентрируется в наружных сегментах созревающих колбочек; однако у RORβ-/- мышей, индукция S opsin (Opn1sw) существенно задержана. После PND23, S opsin обнаруживается в значительно редуцированных количествах. Небольшие различия в индукции M opsin (Opn1mw) и thyroid hormone receptor TR?2, который существенен для экспрессии Opn1mw, наблюдаются между WT и RORβ-/- мышами. Транскрипционный фактор CRX (cone-rod homeobox factor), который является критическим lzk экспрессии генов S и M opsin, обычно экспрессируется в палочках и колбочках [Srinivas et al., 2006]. Эти данные и гистологические исследования указывают на то, что ROR? не нужен для инициации дифференцировки предшественников в фоторецепторы, но специфически регулирует их созревание, как это иллюстрируется редуцированным уровнем S opsin.
Изучение Opn1sw промотора предоставило дальнейшие доказательства, что ROR? является важным регулятором экспрессии Opn1sw. Проксимальная промоторная область Opn1sw содержит два предполагаемых ROREs, которые способны соединяться с RORβ. Оптимальная активация этой промоторной области нуждается в синергичном взаимодействии между RORβ и CRX [Srinivas et al., 2006]. Это согласуется с ко-экспрессией обоих транскрипционных факторов в фоторецепторном слое во время периода, когда индуцируется экспрессия Opn1sw. Активация промотора Opn1sw с помощью RORβ обеспечивается принципиально посредством взаимодействия с более проксимальным RORE и, как ожидается, нуждается в DBD и AF2 доменах RORβ. Анализ трансгенов, состоящих из LacZ , контролируемого с помощью проксимальной промоторной области Opn1sw у мышей, показал, что экспрессия ограничивается фоторецепторами со свойствами колбочек в наружном ядерном слое, тогда как мутации в ROREs тотально устраняют эту экспрессию. Эти наблюдения указывают на то, что RORβ необходим для индукции S opsin и подтверждают заключение, что RORβ регулирует транскрипцию Opn1sw непосредственно через ROREs в его проксимальной промоторной области. Кроме того, они объясняют существенно сниженную экспрессию Opn1sw, наблюдаемую в сетчатке RORβ-/- мышей.

Role for RORα in cone development


Недавние исследования показали, что RORα также играет роль в развитии сетчатки мышей [Fujieda et al., 2009; Ino, 2004]. В сетчатке экспрессия RORα очень динамична. Она впервые обнаруживается на ст. E17 в развивающемся ганглиолярном слое, но не выявляется в слое нейробластов. На ст. PND3, RORα также обнаруживается на наружной и внутренней границе neuroblastic слоя. В сетчатке взрослых мышей RORα интенсивно экспрессируется в слое ганглиолярных клеток, внутреннем ядерном слое и фоторецепторах колбочках в наружном слое, на это указывает его колокализация с S и M opsin. Анализ экспрессии Opn1sw и Opn1mw показал, что их уровень экспрессии достоверно снижен в RORαsg/sg сетчатке. Экспрессия arrestin (Arr3) в колбочках также снижена, тогда как экспрессия некоторых др. cone генов, включая phosphodiesterases 6c and 6h (Pde6c и Pde6h) и cyclic nucleotide gated channel b3 (Gngb3), и экспрессия специфичного для палочек гена rhodopsin (Rho) оставалась неизменной. Экспрессия RORβ также оставалась незатронутой в RORαsg/sg сетчатке. Как продемонстрировано для RORβ, RORα действует синергично с CRX, чтобы индуцировать экспрессию Opn1sw [Fujieda et al., 2009]. In vivo ChIP анализ подтвердил заключение, что Opn1sw, Opn1mw и Arr3 являются непосредственными мишенями для регуляции с помощью ROR?. Т.о., и RORα и RORβ функционируют как регуляторы развития колбочек и Opn1sw; однако в противоположность RORα, RORβ не влияет на экспрессию Opn1mw. Эти данные указывают на то, что хотя RORa; и RORβ обнаруживают некоторое функциональное перекрывание, их функции в развитии колбочек, по-видимому, в основном различны.

Role of RORγ in the development of secondary lymphoid tissues


RORγ1 и RORγt (RORγ2) обнаруживают отличающиеся паттерны ткане-специфической экспрессии. RORγ1 экспрессируется во многих тканях, включая печень, жировую ткань, скелетные мышцы и почки, тогда как экспрессия RORγt обнаруживается исключительно в небольшом самостоятельном типа клеток иммунной системы [Eberl and Littman, 2003; Eberl and Littman, 2004; Jetten, 2004; Jetten and Joo, 2006; Lipp and Muller, 2004]. мыши, дефицитные по экспрессии RORγ, лишены лимфатических узлов и Peyer's patches (PPs), это указывает на то, что RORγ обязателен для органогенеза лимфатических узлов и развития PPs [Eberl and Littman, 2003; Eberl et al., 2004; He, 2002; Jetten and Joo, 2006; Jetten et al., 2001; Jetten and Ueda, 2002; Kurebayashi et al., 2000; Lipp and Muller, 2004; Littman et al., 1999; Sun et al., 2000]. Lymphoid tissue inducer (LTi) клетки играют критическую роль в развитии лимфатических узлов и PPs. LTi клетки происходят от клеток гематопоэтических предшественников в печени плодов и недавно были охарактеризованы как CD45intCD4+CD3-CD127(IL-7R?)+Lin- клетки у мышей, а у человека как клон-негативные CD45intCD4-CD3-CD127hiLin- клетки [Cupedo et al., 2009; Eberl and Littman, 2003; Mebius et al., 2001; Mebius et al., 1997]. LTi клетки рекрутируются в зачатки лимфатических узлов благодаря их взаимодействию с мезенхимными клетками организаторами, специализированными клетками, происходящими из клеток дифференцирующейся мезенхимы [Cupedo et al., 2002; Cupedo and Mebius, 2005; Eberl, 2005; Eberl and Littman, 2003; Lipp and Muller, 2004] (Figure 4). Это межклеточное взаимодействие использует несколько позитивных петель обратной связи и механизмы амплификации. Органогенез лимфатических узлов инициируется в результате взаимодействия lymphotoxin α1β2 на поверхности LTi клеток с их соотв. рецепторами на мезенхимных клетках организаторах. Это ведет к индукции нескольких адгезивных молекул, включая vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) и mucosal addressin cellular adhesion molecule 1 (MadCAM-1) и к последующей продукции гомеостатических хемокинов с помощью мезенхимных клеток организаторов [Cupedo et al., 2002; Cupedo and Mebius, 2005; Eberl, 2005; Lipp and Muller, 2004; Muller et al., 2003; Yoshida et al., 2002] (Figure 4). Помимо усиления взаимодействия между LTi и мезенхимными организующими клетками, эти взаимодействия умножают рекрутирование дополнительных LTi клеток и способствуют рекрутированию др. клеток, таких как моноциты и T и B лимфоциты из кровообращения [Cupedo and Mebius, 2005; Muller et al., 2003]. Последующие исследования показали, что LTi клетки отсутствуют в селезенке, мезентерии и кишечнике ROR?-/- E18.5 эмбрионов, указывая тем самым, что RORγt играет критическую роль в генерации и/или выживании LTi клеток [Eberl, 2005; Eberl and Littman, 2003]. Так как следствие, отсутствие лимфатических узлов и PPs у RORγt- или RORγ-дефицитных мышей обусловлено отсутствием LTi клеток.

Figure 4. RORγ t is essential for the development of secondary lymphoid tissues. Lymphoid tissue inducer (LTi) cells are derived from fetal liver hematopoietic stem cells.This differentiation is accompanied by induction of the transcription factors Id2 and RORγ t. LTi cells are recruited from the circulation by mesenchymal organizer cells.This is mediated by multiple receptor-ligand interactions. LTi cells are required for the development of lymph nodes, Peyer' s patches, cryptopatches, and isolated lymphoid follicles (ILFs), which are thought to be derived from cryptopatches after the colonization of the intestine by bacteria. Recently, a novel lymphocyte population (NKp46 +int NK1.1 CD127+ RORγ t hi) was identified in the gut that may be derived from LTi-like cells in cryptopatches. RORγ t is required for the generation and/or survival of LTi cells.The absence of LTi cells in RORγ-deficient mice is responsible for the lack of lymph nodes, Peyer' s patches, cryptopatches, ILFs, and NKp46 +NK1.1 int CD127+ RORγ t hi cells.

Помимо PPs и мезентерических лимфатических узлов, кишечная иммунная система содержит несколько др. компартментов лимфоидных клеток, включая cryptopatches и isolated lymphoid follicles (ILFs) [Eberl, 2005; Taylor and Williams, 2005] (Figure 4). ILFs развиваются из cryptopatches в ответ на воспалительные сигналы врожденного иммунитета, генерируемые с помощью колонизации кишечника бактериями. Lin-cKit+CD127+CD44+ клетки в cryptopatches и в ILFs экспрессируют высокие уровни RORγt и, по-видимому, составляют у взрослых аналог LTi клеток [Eberl, 2005; Eberl and Littman, 2004]. Дефицит cryptopatches и ILFs обнаруживается у RORγ-/- мышей и указывает на то, что RORγt важен для развития этих клеточных компартментов и обусловлен отсутствием этих LTi-подобных клеток у этих мышей.
Недавние исследования идентифицировали новую популяцию лимфоцитов в кишечной lamina propria, которая продуцирует IL-22 и ко-экспрессирует RORγt и CD127 и natural killer (NK) клеток маркеры NKp46 и NK1.1 (CD3-RORγthiCD127+NKp46+NK1.1int) [Cupedo et al., 2009; Luci et al., 2009; Sanos et al., 2009] (Figure 4). Эти клетки отсутствуют у RORγt-дефицитных мышей. Благодаря его зависимости от RORγt и его CD127+c-Kit+ фенотипа, эти клетки NK напоминают LTi клетки, указывая на возможную связь между двумя типами клеток. LTi клетки, как известно, способны дифференцироваться в NK и антиген презентирующие клетки [Mebius et al., 2001; Mebius et al., 1997]. Basic helix-loop-helix транскрипционный фактор Id2, который как RORγt экспрессируется в LTi клетках, важен для развития как LTi, так и NK клеток [Yokota et al., 1999]. Напротив периферические NK клетки не экспрессируют RORγt и их количество вне меняется у RORγ-дефицитных мышей [Sun et al., 2000]. Было предположено, что RORγthiNKp46+NK1.1int клетки не принадлежат к клону NK клеток, но могут происходить из Lin-Kit+CD127+RORγthi LTi-подобных клеток в cryptopatches [Cupedo et al., 2009; Luci et al., 2009; Sanos et al., 2009]. Точная роль этих клеток в иммунитете нормальной слзистой кишенчика и при патологии, включая колиты, нуждается в дальнейшем изучении.
В противоположность лимфатическим узлам и Пейеровы бляшкам развитие некоторых др. лимфоидных тканей, включая лимфоидную ткань носа и бронхов (BALT и NALT), не нарушается у RORg; -/- мышей, указывая тем самым что органогенез этих лимфоидных тканей использует др. механизм [Harmsen et al., 2002].

Critical functions of RORγ in thymopoiesis


Некоторые исследования продемонстрировали, что RORγt играет критическую роль в регуляции формирования тимуса [Guo et al., 2002; He, 2000; He et al., 1998; Hirose et al., 1994; Jetten, 2004; Jetten and Joo, 2006; Kurebayashi et al., 2000; Medvedev et al., 1996; Ortiz et al., 1995; Sun et al., 2000]. Во время thymopoiesis, T клеточные предшественники CD25-CD44+CD4-CD8-клетки (DN1) дифференцируются последовательно через две промежуточные стадии, CD25+CD44+ (DN2) и CD25+CD44- (DN3), в CD44-CD25- (DN4) тимоциты (Figure 5). Эти клетки затем дифференцируются посредством immature single positive (ISP) клеток (CD3-CD4-CD8low) в двойные позитивные CD4+CD8+ (DP) тимоциты [Miyazaki, 1997]. после успешной перестройки гена T cell receptor α (TCRα) , DP клетки, экспрессирующие TCRα рецептор, подвергаются процессу тщательной селекции, чтобы элиминировать тимоциты, экспрессирующие нефункциональные или аутореактивные TCR [Starr et al., 2003; Zhang et al., 2005]. Позитивные отобранные DP тимоциты созревают в одиночно позитивные (single positive (SP)) CD4+CD8- helper и CD4-CD8+ цитотоксические T клетки, которые затем колонизируют вторичные лимфоидные органы, включая селезенку, лимфатические узлы и PPs.

Figure 5. Role of RORγ t in thymopoiesis. CD4- CD8- CD25- CD44+ (DN1) cells differentiate via DN2, DN3, DN4 into immature single positive (ISP) cells (CD3- CD4- CD8low).These cells subsequently differentiate into CD3+ CD4+ CD8+ , DP thymocytes. RORγ t, as well as Bcl-X L , are induced during the ISP-DP transition and again down-regulated during the differentiation of DP into CD4+ and CD8+ single positive cells. RORγ t promotes the differentiation of ISP into DP cells and positively regulates the expression of the anti-apoptotic gene Bcl-XL .The latter enhances cell survival that subsequently promotes TCR rearrangements. Lack of RORγ t expression inhibits the ISP-DP transition and reduces expression of Bcl-X L in DP thymocytes.The latter results in accelerated apoptosis, reduced lifespan of DP thymocytes and, consequently, impaired TCRα rearrangements.

RORγt временно экспрессируется во время thymopoiesis [Guo et al., 2002; He, 2002; He et al., 2000; He et al., 1998; Jetten, 2004; Jetten and Joo, 2006; Jetten et al., 2001; Sun et al., 2000] (Figure 5). Он не обнаружим в DN тимоцитах и индуцируется высоко когда ISP клетки дифференцируются в DP тимоциты и снова подавляется, когда DP тимоциты дифференцируются в зрелые T лимфоциты. При рождении и на ранних стадиях жизни RORγ нулевые мыши имеют достоверно меньший тимус по сравнению с мышами дикого типа в результате резкого сокращения количества double позитивных DP и SP тимоцитов, в то время как процент ISP тимоцитов существенно увеличивается [Eberl and Littman, 2003; Jetten et al., 2001; Jetten and Ueda, 2002; Kurebayashi et al., 2000; Sun et al., 2000]. Накопление ISP клеток у RORγ-/- мышей, по-видимому, обусловлено задержкой в дифференцировке ISP в DP клетки, это подтверждает роль, RORγ t в регуляции перехода ISP-DP [Guo et al., 2002]. Кроме того, DP тимоциты подвергаются массивному апоптозу in vivo и in vitro [Jetten, 2004; Jetten and Joo, 2006; Jetten et al., 2001; Kurebayashi et al., 2000; Sun et al., 2000]. Ускоренный апоптоз RORγ-/- DP тимоцитов связан со снижением экспрессии анти-апоптического гена Bcl-XL. Это репрессия раннего и ключевого события в ускорении апоптоза в RORγ-/- тимоцитах [Sun et al., 2000; Xie et al., 2005]. Т.о., RORγ функционирует как позитивный регулятор экспрессии Bcl-XL и как результат способствует выживанию DP тимоцитов, тем самым делая возможной перестройку генов [Eberl et al., 2004; He et al., 1998; Jetten, 2004; Jetten and Joo, 2006; Jetten et al., 2001; Jetten and Ueda, 2002; Kurebayashi et al., 2000; Ma et al., 1995].
По-прежнему мало известно о механизме, с помощью которого экспрессия Bcl-XL и RORγt регулируется во время thymopoiesis. Снижение экспрессии Bcl-XL у RORγ-/- мышей и наблюдение, что индукция и подавление экспрессии Bcl-XL и RORγt происходит параллельно, согласуется с концепцией, что RORγt регулирует экспрессию Bcl-XL. Использует ли эта регуляция непосредственный или косвенный механизм ещё предстоит установить. Недавнее исследование предоставило доказательства связи между экспрессией early growth response gene 3 (EGR3) и регуляцией RORγt и Bcl-XL [Xi and Kersh, 2004; Xi et al., 2006]. Pre-TCR сигналы временно индуцируют EGR3, это способствует пролиферации, в то время как последующее подавление EGR3 ведет к перерыву и индукции RORγt и Bcl-XL, необходимых для выживания клеток и собственно для перестройки генов.
Анализ профилей генной экспрессии тимоцитов от WT и RORγ-/- мышей выявил дополнительные изменения в генной экспрессии, включая репрессию транскрипционного фактора EGR1, Ngfi-A binding protein 2 (NAB2), и glucocorticoid-induced transcript 1 (GLCCI1) [Kang et al., 2006]. Один из генов наиболее драматически репрессирован в тимоцитах у RORγ-/- мышей, это oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold-containing 2a (Obfc2a, также наз. NABP1). Паттерн экспрессии Obfc2a во время thymopoiesis коррелирует с таковым RORγt. Следовательно, Obfc2a может быть потенциальным геном мишенью для RORγ ;напротив, его подавление проявляется непосредственным следствием редукции DP клеток, наблюдаемой у RORγ-/- мышей. Итак, эти исследования показывают, что RORγ играет критическую роль в гомеостазе тимоцитов путем регуляции дифференцировки, пролиферации и апоптоза тимоцитов [He, 2002; Jetten, 2004; Jetten and Joo, 2006; Jetten et al., 2001; Winoto and Littman, 2002].

Role of RORα in lymphocyte development


И селезенка и тимус достоверно меньше у RORα-дефицитных мышей, это указывает на то, что RORα может играть роль в регуляции thymopoiesis и развитии лимфоцитов [Dzhagalov et al., 2004; Trenkner and Hoffmann, 1986]. RORα мРНК экспрессируется на низких уровнях в DP тимоцитах и на высоких уровнях в SP тимоцитах, тогда как она снижена у зрелых CD8+ и повышена у зрелых CD4+ T лимфоцитов. B220+ B лимфоциты экспрессируют низкие уровни RORα. Общее количество тимоцитов и спленоцитов существенно снижено у RORα-/- мышей и связано с потерей DP тимоцитов и соотв. повышением процента DN и SP тимоцитов [Dzhagalov et al., 2004]. в селезенке RORα-/- как зрелые T, так и B лимфоциты были существенно редуцированы, указывая тем самым, что RORα играет критическую роль в развитии лимфоцитов.
Не выявлено различий между RORα-/- и WT мышами в отношении индукции пролиферации CD4+ и CD8+ T лимфоцитов в ответ на anti-CD3 или lipopolysaccharide (LPS), и в отношении индукции цитокинов с помощью TNFα [Dzhagalov et al., 2004]. Напротив, индукция IL-6 и tumor necrosis factor α существенно возрастала в RORα-/- тучных клетках и макрофагах после воздействия LPS [Dzhagalov et al., 2004; Kopmels et al., 1992]. Эти результаты указывают на то, что, по крайней мере, в определенных иммунных клетках, RORα действует как негативный регулятор экспрессии цитокинов. Хотя механизм этой репрессии не полностью ясен, RORα , как сообщалось, позитивно регулирует экспрессию IKBα, негативного регулятора NF-kB сигнального пути [Delerive et al., 2001]. На этом основании было сделано заключение, что RORα может функционировать как негативный регулятор воспаления.

RORs and T cell lineage specification


Role of RORs in Th17 cell differentiation


Недавние исследования идентифицировали критическую роль RORs в регуляции спецификации клонов в helper T клетках [Chen et al., 2007; Chen and O'Shea, 2008; Dong, 2008; Furuzawa-Carballeda et al., 2007; Huang et al., 2007; Ivanov et al., 2006; Ivanov et al., 2007; Laurence and O'Shea, 2007; Weaver et al., 2007; Yang et al., 2008d]. Дифференцировка в разные эффекторные CD4+ T клеточные клоны, T helper (Th) 1, Th2, Th17 и T regulatory (Treg or Th3) клетки инициируется благодаря взаимодействию дендритных клеток с недетерминированными (naive) CD4+ T helper cells (Thp). Th1, Th2, Treg и Th17 характеризутся синтезом специфических цитокинов и их иммуно-регуляторными функциями (Figure 6). Interferon γ является сигнатурным цитокином, продуцируемым Th1 клетками, в то время как IL-4, IL-5 и IL-13 являются основными цитокинами, продуцируемыми Th2 клетками. Недавно открытые клетки Th17 продуцируют IL-17A (IL-17), IL-17F, IL-21 и IL-22 в качестве основных цитокинов, тогда как Treg клетки синтезируют IL-10 и TGFβ1 [Bettelli et al., 2008; Chen and O'Shea, 2008; Dong, 2008; Harrington et al., 2006; Park et al., 2005]. T helper и Treg клетки играют критическую роль в некоторых воспалительных реакциях, включая адаптивные иммунные реакции на различные патогены. Защита хозяина координируется за счет провоспалительных Th1, Th2 и Th17 клеток, тогда как Treg клетки участвуют в негативной регуляции и приобретении иммунной воспалительной реакции. Клетки Th17 Ю как полагают, являются основными провоспалительными клетками, участвующими в аутоиммунитете, тогда как Treg клетки защищают от аутоиммунитета [Dong, 2008; Furuzawa-Carballeda et al., 2007; Ivanov et al., 2007; Laurence and O'Shea, 2007; Weaver et al., 2007]. Дифференцировка в различные клоны инициируется дендритными клетками, которые преобразуют и предоставляют (микробные) антигены TCRs клеткам Thp. Взаимодействие дендритных клеток с разными классами патогенов ведет к активации различных путей и высвобождению различных цитокинов, которые затем взаимодействуют с рецепторами на Thp клетках и или ведут или репрессируют их дифференцировку в разные клоны (Figure 6). Последнее связано с активацией различных сигнальных каскадов и транскрипционных факторов и синтезом др. cyto/chemokines и cyto/chemokine рецепторов, которые являются частью дополнительных позитивных и негативных петель обратной связи. Напр., индукция Th1 клеток с помощью IL-12 связана с транскрипционными факторами STAT4, STAT1 и T-bet, тогда как дифференцировка в Th2 клон в ответ на IL-4 нуждается в STAT6 и GATA3 [Harrington et al., 2006; Moulton and Farber, 2006]. Дифференцировка в Treg клетки и Th17 клетки часто реципрокна, связана с некоторыми позитивными и негативными регуляторными сетями, которые благоприятствуют одному или др. клону [Bettelli et al., 2006; Bettelli et al., 2008; Dong, 2008; Furuzawa-Carballeda et al., 2007; Harrington et al., 2006; Ivanov et al., 2006; Ivanov et al., 2007; Laurence and O'Shea, 2007; Park et al., 2005; Veldhoen et al., 2006; Weaver et al., 2007]. Сюдя входят yin-yang взаимоотношения между экспрессией RORγt и FOXP3 и их регуляция с помощью некоторых цитокинов, transforming growth factor β (TGFβ), and ATRA.

Figure 6. Specific role for RORs in T cell lineage specification. Differentiation into different effector CD4 T cell lineages, T helper (Th) 1, Th2, Th17, and T regulatory (Treg ) cells is initiated through an interaction of dendritic cells with uncommitted (naive) CD4+ T helper cells (Thp).The effector cell types are characterized by their synthesis of specific cytokines and their immuno-regulatory functions, as indicated on the right.The differentiation along different lineages involves different cytokines and the activation of distinct signaling cascades and transcription factors that result in the induction of additional cyto/chemokines and cyto/chemokine receptors, which may be part of positive and negative feedback loops.These cytokines and transcription factors may favor one cell lineage, while inhibiting another (not indicated). RORα and RORγ t are induced during differentiation of Thp into the Th17 lineage and are critical for this lineage specification.

Littman, Cuaс коллегами впервые сообщили, что RORγt необходим для дифференцировки naive CD4+ T клеток в Th17 клетки [Ivanov et al., 2006; Ivanov et al., 2007; Manel et al., 2008]. Это было подтверждено находками из нескольких лаб. [Dong, 2008; Laurence et al., 2007; Yang et al., 2007b; Yang et al., 2008d]. RORγt индуцируется во время дифференцировки стимулированных антигеном Thp клеток вместе с Th17 клоном в ответ на IL-6 или IL-21 и TGFβ (Figure 7). Клетки, дефицитные по IL-6 не экспрессируют ни RORγt, ни IL-17F и IL23R [Korn et al., 2007a; Laurence et al., 2007; Yang et al., 2007b]. IL-6 осуществляет свое действие посредством активации STAT3. Дефицит STAT3 существенно нарушает активацию экспрессии RORγt и дифференцировку Th17, указывая тем самым, что эта индукция зависит от STAT3 [Harris et al., 2007; Nurieva et al., 2007; Yang et al., 2007b]. Напротив, дефицит suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3), негативного регулятора активности STAT3, усиливает дифференцировку Th17 [Chen et al., 2006]. Регулирует ли STAT3 экспрессию RORγt непосредственно при помощи соединения с промотором RORγt , необходимо ещё доказать. Дополнительные доказательства роли RORγt в дифференцировке Th17 получены в исследованиях, показавших, что Thp клетки, выделенные из isolated from RORγ -нулевых мышей обнаруживают заметное снижение своей способности подвергаться дифференцировке в Th17 клон [Ivanov et al., 2006; Nurieva et al., 2007; Yang et al., 2007b]. Напротив, экзогенная экспрессия RORγt в Thp клетках существенно увеличивает экспрессию IL-17 цитокинов и IL23R в отсутствие цитокинов. Последующие исследования показали, что подобно RORγt, RORα также индуцируются на высоком уровне во время дифференцировки Th17 клеток STAT3-зависимым образом [Yang et al., 2008d] (Figure 7). Дефицит RORα снижает IL-17 и IL23R, но не экспрессию IL-17F или IL-22 , тогда как экзогенная экспрессия RORα в Thp клетках или Jurkat клетках усиливает экспрессиию IL-17, IL-17F, IL-22 и IL23R [Du et al., 2008; Yang et al., 2008d]. Эти наблюдения указывают на то, что RORα также действует как позитивный регулятор дифференцировки Th17, подтверждая степень функционального перекрывания между RORγt и RORα. Это согласуется с находками, показавшими, что дифференцировка Th17 полностью нарушена в Thp клетках, дефицитных по RORα и RORγ [Yang et al., 2008c; Yang et al., 2008d]. Т.о., и RORα и RORγt необходимы для оптимальной дифференцировки Thp клеток в Th17 клетки; , однако, RORγt, по-видимому, является основным игроком в этом процессе, поскольку дефицит RORγt обнаруживает более выраженный эффект на экспрессиию Th17 цитокинов, чем потеря RORα. Выполняют ли RORα и RORγ какую-либо уникальную роль в регуляции генной экспрессии во время или после дифференцировки Th17, этот вопрос нуждается в дальнейших исследованиях.

Figure 7. RORs are essential for Th17 cell differentiation and IL-17 expression. In the presence of TCR engagement, treatment of Thp cells with IL-6 plus TGFβ 1 induces differentiation along the Th17 lineage and the activation of several genes, including IL-21, RORα, RORγ t, IL-17, IL-17F, IL-22, and IL23R. Interaction of IL-23 and IL-21 with, respectively, IL23R and IL21R, reinforce Th17 differentiation and ROR expression. RORα and RORγ t are required for the induction of IL-17, IL-17F, and IL23R, but not IL-21. A balance between FOXP3, which is induced by treatment with TGFβ alone, determines whether Thp cells differentiate into Th17 or Treg cells. ATRA, through activation of RARα-RXR complexes, leads to increased FOXP3 and reduced ROR expression. FOXP3 inhibits RORα and RORγ t transcriptional activity by interacting directly with RORs, thereby promoting differentiation along the T T reg reg lineage and inhibiting Th17 differentiation.Transcriptional regulators IRF4 and RUNX1 have also been implicated in the regulation of and Th17 differentiation.

D дополнение к индукции RORγt, IL-17 и IL-17F, дифференцировка в Th17 клон ассоциирует с повышенной экспрессией IL-21 и IL23R [Acosta-Rodriguez et al., 2007; Korn et al., 2007a; Laurence and O'Shea, 2007; Nurieva et al., 2007; Wilson et al., 2007; Zhou et al., 2007]. Индукция IL-21 в ответ на IL-6 использует непосредственную связь STAT3 с IL-21 промотором. IL-21, благодаря своей активации STAT3, действует синергично с IL-6 и TGFβ , чтобы индуцировать экспрессию RORγt и IL-17 [Nurieva et al., 2007; Palmer and Weaver, 2007; Zhou et al., 2007] (Figure 7). IL-21 экспрессия на затрагивается у RORγ-дефицитных мышей, указывая тем самым, что эта регуляция происходит выше RORγ. IL-21 также экспрессируется в T follicular helper T (Tfh) клетках, др. новом T клеточном субнаборе, который развивается независимо от RORs [Nurieva et al., 2008]. В противоположность IL-21, индукция IL23R существенно снижена у RORγ-дефицитных мышей, указывая тем самым, что его экспрессия регулируется с помощью RORγt. IL23R сам по себе является частью позитивной петли обратной связи ; он позволяет IL-23 соединяться с и тем самым усиливать дифференцировку Th17 посредством активации STAT3 [Ivanov et al., 2007; McGeachy et al., 2007; Yang et al., 2007b; Zhou et al., 2007].

Suppression of ROR transcriptional activity by FOXP3


Treg и Th17 клетки реципрокно регулируются с использованием разных позитивных и негативных регуляторных сетей [Bettelli et al., 2008; Dong, 2008; Furuzawa-Carballeda et al., 2007; Ivanov et al., 2007; Laurence and O'Shea, 2007; Nurieva et al., 2007; Weaver et al., 2007; Zheng and Rudensky, 2007; Zhou et al., 2008]. Баланс между экспрессией RORγt и forkhead box transcription factor p3 (FOXP3) играет критическую роль в детерминации того, могут ли недетерминированные CD4+ T helper клетки дифференцироваться в Treg или Th17 клетки (Figure 6). FOXP3 содержит репрессорный домен в N-терминальной половине и C2H2 zinc finger, лейциновую застежку и forkhead домен на своей C-терминальной половине, это позволяет белку действовать как активатор или репрессор транскрипции генов [Campbell and Ziegler, 2007; Carson et al., 2006; Li et al., 2007; Lopes et al., 2006]. FOXP3 преимущественно экспрессируется в CD4+CD25+ Treg клетках, где он играет важную роль в направлении дифференцировки [Campbell and Ziegler, 2007; Lochner et al., 2008; Zheng and Rudensky, 2007]. Кроме того, он регулирует некоторые функциональные свойства и вносит вклад в жизнеспособность Treg клетокs. FOXP3-дефицитные мыши лишены Treg клеток и высоко чувствительны к воспалительным заболеваниям [Brunkow et al., 2001; Fontenot et al., 2005]. Напротив, индукция или экзогенная экспрессия FOXP3 ингибирует дифференцировку Th17 .
Регуляция экспрессии FOXP3с помощью TGFβ и IL-6 играет критическую роль в детерминации клонов Treg и Th17 [Bettelli et al., 2008; Chen et al., 2007; Dong, 2008; Ivanov et al., 2007; Weaver et al., 2007]. В присутствии задействованных TCR , TGFβ индуцирует экспрессию FOXP3 и дифференцировку Treg в Thp клетках мышей. Хотя TGFβ может умеренно усиливать экспрессию RORα и RORγt, FOXP3 индуцируется на значительно боее высоких уровнях, в результате сдвигается баланс ROR/FOXP3 в направлении FOXP3 и дифференцировки Treg [Bettelli et al., 2006; Chen et al., 2003; Fantini et al., 2004; Korn et al., 2007a; Nurieva et al., 2007; Veldhoen et al., 2006; Wan and Flavell, 2007; Yang et al., 2008a; Zhou et al., 2008] (Figure 7). Добавление IL-6 или IL-21ингибирует индукцию FOXP3 с помощью TGFβ и активирует экспрессию RORα и RORγt , сдвигая тем самым баланс ROR/FOXP3 в пользу дифференцировки Th17. Эти наблюдения указывают на то, что FOXP3 репрессирует дифференцировку Th17 за счет противодействующей функции RORγt, скорее, чем ингибирования его экспрессии [Du et al., 2008; Ichiyama et al., 2008; Ivanov et al., 2007; Yang et al., 2008c; Zhou et al., 2008]. Такой антагонизм обеспечивается за счет непосредственного взаимодействия FOXP3 с RORα и RORγt и использует домен AF2 в RORs и мотив LXXLL в области, кодируемой экзоном 2 из FOXP3. Мутация этого мотива сильно ингибирует взаимоедйствие FOXP3 с RORs, но не полностью предупреждает FOXP3-обусловленную супрессию активности ROR. Репрессия транскрипции с помощью FOXP3 использует взаимодействие с histone acetyltransferase TIP60 и histone deacetylase HDAC7 посредством 106-190 кислотного региона FOXP3 [Li et al., 2007]. Делеция этого региона уменьшает ингибирующий эффект FOXP3 на ROR-обусловленную трансактивацию, тогда как отсутствие и LXXLL мотива и домена взаимодействия TIP60-HDAC7 полностью устраняет FOXP3-обеспеичваемую супрессию [Yang et al., 2008c]. Т.о., взаимодействие FOXP3, возможно в комплексе с TIP60 и HDAC, вместе с RORs репрессирует транскрипционную активность ROR и , следовательно, ингибирует активацию экспрессии IL-17 и дифференцировку Th17 с помощью RORα и RORγt.
Ряд др. цитокинов и транскрипционных факторов влияет на баланс между дифференцировкой Treg и Th17. В противовес IL-6, IL-21 и IL23, IL-2 ингибирует экспрессию RORγt и дифференцировку Th17 посредством STAT5-зависимого механизма и способствует генерации Treg клеток [Ivanov et al., 2007; Laurence et al., 2007]. IL-10, помимо ингибирования дифференцировки Th1. также супрессирует дифференцировку Th17 и экспрессию RORγt и IL-17 [Gu et al., 2008]. Напротив, экспрессия RORγt и дифференцировка Th17 усиливаются в IL-10-/- клетках селезенки. Более того, обработка IL-10-/- макрофагов с помощью LPS в значительной степени индуцирует экспрессию RORγt и IL-17. Повышенная экспрессия RORγ and IL-17 в IL-10-/- клетках селезенки, а LPS-обработанные макрофаги репрессируются с помощью добавления IL-10. Помимо STAT транскрипционных факторов interferon regulatory factor 4 (IRF4) регулирует детерминацию T клона и необходим для дифференцировки Th17 [Brustle et al., 2007; Huber et al., 2008]. IRF4 важен для IL21-индуцированной дифференцировки Th17. Экспрессия RORα, RORγt и IL-17 существенно снижается в IRF4-дефицитных T клетках, тогда как экспрессия, FOXP3 увеличивается. указывая тем самым, что IRF4 также играет роль в регуляции баланса между Th17 и Treg клетками. Т.о., баланс между дифференцировкой Th17 и Treg находится под сложным контролем, использующим множественные транскрипционные факторы.

Suppression of Th17 differentiation and RORγt expression by ATRA


Ретиноиды играют важную роль в некоторых иммунных функциях, включая предопределение Thp клеток в разные клоны [Iwata et al., 2003; Iwata et al., 2004]. ATRA , образующийся из ретинола с помощью дендритных клеток, как было установлено, негативно регулирует дифференцировку Th1 и Th2 клеток [Iwata et al., 2003]. Более недавние исследования показали, что ретиноевая кислота является критическим фактором в контроле баланса между Th17 и Treg клетками [Coombes et al., 2007; Mucida et al., 2007; Sun et al., 2007]. После активации TCR дифференцировка Thp клеток в Treg клетки зависит как от TGFβ , так и ATRA [Benson et al., 2007; Coombes et al., 2007; Elias et al., 2008; Sun et al., 2007]. ATRA ингибирует индукцию дифференцировки Th17 и подавляет RORγt экспрессию в ответ на TGFβ и IL-6, и вместо этого способствует экспрессии FOXP3 и последующей генерации Treg клеток (Figure 7). Помимо IL-17, ATRA репрессирует также экспрессию IL-23R и IL-6Rα. Эти находки согласуются с концепцией, что дифференцировка TCR-активированных Thp клеток в Th17 или Treg предопределяется за счет баланса между FOXP3 и RORγt.
Точный механизм ингибирования RORγt и индукции экспрессии FOXP3 с помощью ATRA пока неясен. Поскольку IL-2 индуцирует экспрессию FOXP3 посредством активации, то ATRA д. усиливать FOXP3 благодаря усилению экспрессии IL-2 и активации STAT5. Однако индукция FOXP3 с помощью ATRA не зависит от IL-2 и STAT5 [Elias et al., 2008]. Соединение с и активация рецепторов ретиноевой кислоты α, β, and γ (RARs), в гетеродимерных комплексах с RXRs, является основным механизмом, с помощью которого ATRA регулирует транскрипцию генов [Minucci and Ozato, 1996]. Ретиноидная (4-[E-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl] benzoic кислота (TTNPB), синтетический RAR pan-агонистt, эффективно индуцирует экспрессию FOXP3 и дифференцировку Treg , тогда как RAR-антагонист ингибирует эту индукцию с помощью ATRA. Эти наблюдения указывают на то, что эти эффекты ATRA опосредуются через RARs. Изучение RAR-селективных ретиноидов показало, что RARα скорее, чем RARγ является ключевым игроком в индукции FOXP3 и супрессии дифференцировки Th17 [Elias et al., 2008]. Это подтверждается данными, демонстрирующими, что ATRA способна содейцствовать превращению RARβ- и RARγ-дефицитных Thp клеток в FOXP3+ клетки, но не в Thp клетказ, выделенных от RARα-дефицитных мышей [Hill et al., 2008]. Было предположено, что стимуляция пути передачи сигналов TGFβ может частично объяснить увеличение дифференцировки Treg с помощью ATRA в присутствии TGFβ. Это подтверждается находками, показавшими, что ATRA увеличивает экспрессию и фосфорилирование SMAD3 [Xiao et al., 2008]. Однако недавние исследования показали, что индукция клеток Treg с помощью ATRA обеспечивается за счет непрямого механизма, с участием ослабления ингибиции экспрессии FOXP3 с помощью CD4+CD44hi memory клеток [Hill et al., 2008].
Ингибирование дифференцировки Th17 с помощью ATRA может объяснить защитные эффекты ретиноидов в животных моделях аутоиммунных болезней [Wang et al., 2000; Xiao et al., 2008]. Добавка ATRA супрессирует развитие experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) у мышей за счет ингибирования проваспалительных реакций. Эта супрессия, по-видимому, связана с ингибированием генерации клеток Th17 скорее, чем с увеличением клеток Treg.

Regulation of IL-17 by RORs


Хотя экспрессия IL-17, IL-17F, IL-22 и IL23R во время дифференцировки Th17 зависит от RORs, не совсем понятно, как эти гены регулируются непосредственно с помощью RORs. Некоторые исследования идентифицировали присутствие функциональных ROREs в 6 kb в промотор фланкирующем регионе гена IL-17 [Ichiyama et al., 2008; Yang et al., 2008d; Zhang et al., 2008b]. Однако отсутствует согласие, какие ROREs наиболее важны в управлении экспрессией IL-17 с помощью RORγt. Недавние исследования показали, что регион CNS2 в il17-il17f локусе (между -4 и -6 kb) подвергается ремоделированию хроматина в ответ на IL-6/TGFβ [Akimzhanov et al., 2007]. Последующие исследования показали, что регуляция IL-17 с помощью RORs использует этот CNS2 регуляторный регион [Yang et al., 2008d]. Этот предполагаемый энхансер содержит два ROREs, которые способны связывать ROR непосредственно и обеспечивать транскрипционную активацию с помощью RORα и RORγt, тогда как в 1kb регион проксимальной части промотора нечувствителен к ROR. ChIP анализ показал, что RORs ассоциируют in vivo с регионом, содержащим сайт CNS2 [Yang et al., 2008d]. Эти наблюдения показывают, что индукция IL-17 с помощью RORs обеспечивается посредством этого региона и подтверждает, что IL-17 является непосредственной мишенью для транскрипционной регуляции с помощью ROR .
Помимо RORs, некоторые др. транскрипционные факторы. включая STAT3, позитивно регулируют транскрипцию IL17 [Yang et al., 2008d; Zhou et al., 2007]. Индукция с помощью STAT3 обеспечивается посредством соединения с промоторным регионом гена IL17. Экспрессия постоянно активного STAT3 индуцирует IL17, если ко=экспрессируется с RORγt, но оказывает незначительный эффект в RORγ-дефицитных T клетках, указывая тем самым, что индукция экспрессии IL17 с помощью STAT3 зависит от присутствия RORγt.
Runt-related transcription factor 1 (RUNX1) является др. транскрипционным регулятором, который способствует дифференцировке Th17 за счет усиления экспрессии RORγ t и IL17 [Zhang et al., 2008b]. Активация экспрессии IL17 с помощью RUNX1 обеспечивается с помощью двух Runx-связывающих сайтов, которые расположены вблизи ROREs в промоторном регионе IL17. Кроме того, было показано, что RUNX1 взаимодействует непосредственно с RORγt и действует синергично с RORγt? чтобы оптимально активировать экспрессию IL17. Экспрессия FOXP3 ингибирует эту активацию путем непосредственного взаимодействия с RORγt и RUNX1, репрессируя тем самым их транскрипционную активность.

RORs and autoimmune disease


Th17 клетки участвуют в аутоиммунных болезнях и др. воспалительных заболеваниях человека, включая волчанку, артриты, множественный склероз, атопический дерматит, псориаз, астму и воспалительное заболевание кишечника [Bi et al., 2007; Huang et al., 2007; Ivanov et al., 2007]. IL-17 индуцирует секрецию различных хемокинов, цитокинов, metalloproteinases и др. провоспалительных медиаторов и способствует рекрутированию нейтрофилов. Мыши, лишенные IL-17, резистентны к collagen-induced arthritis (CIA) и EAE, модели множественного склероза. Нейтрализация IL-17 антителами супрессирует аутоиммунное воспаление ЦНС [Dong, 2008; Furuzawa-Carballeda et al., 2007; Huang et al., 2007; Korn et al., 2007b; Stockinger et al., 2007]. Напротив, перенос Th17 клеток усугубляет болезнь. Rag1-/- мыши воспроизведенные с помощью CD4+ splenocytes или костного мозга из RORγ- или RORα-дефицитных мышей менее чуввтвительны к EAE, чем мыши воспроизведенные с помощью WT CD4+ splenocytes или костного мозга [Ivanov et al., 2006; Yang et al., 2008d]. Сходные эксперименты с помощью Rag1-/- мышей восстановленных с помощью клеток от мышей, дефицитных по RORα и RORγ, обнаруживают полную устойчивость к EAE. Недавние исследования с использованием adoptive transfer модели колита, показали, что перенос RORγ-нулевых T клеток не способен повышать уровни IL-17 цитокина в слизистой и не индуцируют колит, тогда как воздействие IL-17A восстанавливает колит после переноса RORγ-нулевых T клеток [Leppkes et al., 2009]. Эти исследования показали, что потеря функции RORα/γt сильно снижает чувствительность к развитию аутоиммунных заболеваний у мышей. Эти наблюдения указывают на то, что с помощью контроля дифференцировки Th17 и экспрессии IL-17, RORγt и RORα играют критическую роль в регуляции воспалительных реакций (Figure 2). Следовательно, RORs могут функционировать как потенциальные лекарственные мишени для терапевтического вмешательства в аутоиммунные заболевания, включая хронические колиты и множественный склероз.

RORs and lung inflammation


RORαsg/sg и RORγ-/- мыши менее чувствительны к ovalbumin (OVA)-индуцированному воспалению легких, которые служат в качестве экспериментальной модели аллергических болезней воздушных путей [Jaradat et al., 2006; Tilley et al., 2007]. Инфильтрация воспалительных клеток, включая эозинофилы, нейтрофилы и лимфоциты в перибронхиолярные и периваскулярные регионы легких и в бронхиальную альвеолярную смывную жидкость (lavage fluid), была достоверно ниже у OVA-challenged RORαsg/sg мышей по сравнению с WT мышами, а индукция Th2 цитокинов IL-4, IL-5 и IL-13 была существенно скомпроментирована. Анализ профилей генной экспрессии показал, что экспрессия большинства генов, участвующих в реакциях воспаления, включая хемокины TARC, eotaxin-2 (Ccl24), MIP-1a (Ccl3), MCP-2 (Ccl8) и RANTES (Ccl5), белки быстрого ответа, mucins MUC5b и MUC5ac, индуцируются в занчительно меньшей степени в легких OVA-challenged RORαsg/sg мышей, чем в таковых от WT мышей. Вместе эти наблюдения обнаруживают, что RORαsg/sg мыши дают менее тяжелую аллергическую воспалительную реакцию. Интересно, что RORαsg/sg мыши более чувствительны к LPS-индуцированному воспалению [Stapleton et al., 2005]. Механизм такой повышенной чувствительности не совсем понятен.
Аллергическая реакция у RORγ-/- мышей также тяжело нарушена, как показывает изнурительное эозинофильное легочное воспаление и уменьшение CD4+ лимфоцитов и уровня Th2 cytokines/chemokines [Tilley et al., 2007]. OVA сенсибилизированные и неполноценные RORγ-/- животные обнаруживают неожиданное увеличение TNF-α, IL-2, IL-10 и IFN-γ и реципрокное уменьшение IL-4, IL-5 и IL-13. Этот сдвиг в профиле цитокинов в купе со сниженнными уровнями IgG1 и повышенными IgG2c в сыворотке OVA-экспозированных RORγ-/- мышей указывает на критическую роль RORγ в регуляции продукции иммуноглобулинов и балансе между разными популяциями T helper клеток. Сниженная воспалительная реакция у RORγ-/- мышей может быть частично связана в ролью RORγ , выполняемой в детерминации клона Th17 [Ivanov et al., 2006; Ivanov et al., 2007; Yang et al., 2008d].Интересно, что мыши, лишенные IL-17, обнаруживают изнурительное эозинофильное воспаление легких и продукцию Th2 цитокина, тогда как IL-10, который продуцируется Treg клетками, ингибирует аллергическое воспаление [Umemura et al., 2007; Urry et al., 2006]. Юолее того, мыши, дефицитные по IL17 гену, но не по IL17F, также обнаруживают пониженную Th2 реакцию в подобной модели астмы [Yang et al., 2008b]. Т.о., редукция Th17 клеток у RORγ-/- мышей и наблюдаемое увеличение в IFN-γ (Th1) и IL-10 (Treg) у OVA-challenged RORγ-/- мышей согласуется с предположением, что пониженная чувствительность к аллергическому воспалению легких у этих мышей может быть связана со сдвигом в предопределении разных Th клонов. Эта гипотеза согласуется с концепцией, что взаимное общение между клон-специфическими транскрипционными факторами играет важную роль в спецификации клонов.

RORs and circadian rhythm


Circadian behavior of ROR expression


Circadian rhythms are daily cycles of behavioral and physiological changes that are regulated by endogenous circadian clocks [Hastings et al., 2007; Isojima et al., 2003; Ko and Takahashi, 2006; Liu et al., 2007a; Schibler and Naef, 2005; Schibler and Sassone-Corsi, 2002]. The circadian clock impacts virtually all physiological functions and behavior. It is therefore not surprising that abnormalities in circadian rhythm are implicated in an increasing number of diseases, including sleep and mood disorders, diabetes, obesity, and cancer [Barnard and Nolan, 2008; Gery and Koeffler, 2007; Ishida, 2007; Liu et al., 2007a; Maywood et al., 2006; Turek et al., 2005].
A number of studies have established links between nuclear receptor function and expression, the circadian regulatory circuitry, and the regulation of various physiological processes [Akashi and Takumi, 2005; Duez and Staels, 2008; Guillaumond et al., 2005; Horard et al., 2004; Jetten and Joo, 2006; Liu et al., 2008; Preitner et al., 2003; Ueda et al., 2002b; Yang et al., 2006; Yang et al., 2007a]. Many nuclear receptors, including RORs, display, at least in some tissues, rhythmic patterns of expression during the circadian cycle, indicating that their expression is controlled by the circadian clock. RORα expression shows a weak circadian oscillation in liver, kidney, retina, and lung [Akashi and Takumi, 2005; Kamphuis et al., 2005; Tosini et al., 2007; Ueda et al., 2002b; Yang et al., 2006]. In the SCN, RORγ exhibits a rhythmic pattern of expression with a peak at CT6-8. A similar circadian profile was observed for RORβ, while RORγ is not expressed in the SCN [Schaeren-Wiemers et al., 1997; Sumi et al., 2002; Ueda et al., 2002b]. ROR?2 displays a rhythmic expression pattern in mouse pineal gland and retina, with a maximum at CT18 [Andre et al., 1998a; Ueda et al., 2002b]. RORγ exhibits an oscillatory expression pattern in liver, brown adipose tissue, and kidney, but not in skeletal muscle and thymus [Guillaumond et al., 2005; Jetten and Joo, 2006; Kang et al., 2007; Ueda et al., 2002b; Ueda et al., 2005; Yang et al., 2006]. In these tissues, RORγ is expressed at low levels during the day and at optimum levels at night.
Mice deficient in RORα or RORβ exhibit an aberrant circadian behavior [Akashi and Takumi, 2005; Masana et al., 2007; Sato et al., 2004; Schaeren-Wiemers et al., 1997], while no abnormalities in circadian behavior have been noticed in RORγ-/- mice [Liu et al., 2008]. RORαsg/sg mice display an anomalous, slightly decreased, free-running period of locomotor activity and an altered feeding pattern during the circadian cycle [Akashi and Takumi, 2005; Guastavino et al., 1991; Sato et al., 2004], while RORβ-/- mice display an extended period of free-running rhythmicity under conditions of constant darkness [Andre et al., 1998a; Masana et al., 2007].

Regulation of clock genes by ROREs


Nearly every mammalian cell type contains its own circadian oscillator. The oscillators in peripheral tissues operate in a self-sustained, cell-autonomous manner [Isojima et al., 2003; Ko and Takahashi, 2006; Liu et al., 2007a; Reppert and Weaver, 2001; Reppert and Weaver, 2002; Ripperger and Schibler, 2001; Schibler and Sassone-Corsi, 2002]. Their synchronization is coordinated by signals originating from the master circadian clock residing in the SCN of the anterior hypothalamus. The phase of the master oscillator is set by the light-dark cycle input received by both visual and non-visual photoreceptor systems in the retina.
At the molecular level, the clockwork consists of an integral network of several interlocking negative feedback and positive feedforward loops. The basic molecular circuitry of circadian clocks is analogous between tissues. A major positive loop consists of the basic helix-loop-helix/PAS-type transcriptional activators BMAL1 and CLOCK or its paralog NPAS2, while two cryptochrome (CRY) and three period proteins (PER) are involved in the negative control of the oscillator [Albrecht, 2002; DeBruyne et al., 2007a; DeBruyne et al., 2007b; Isojima et al., 2003; Reppert and Weaver, 2002; Schibler and Naef, 2005; Schibler and Sassone-Corsi, 2002] (Figure 8). BMAL1-CLOCK heterodimers positively regulate the circadian expression of many genes, including PER and CRY, through interaction with E-box enhancers (CACGTG) in the promoter regulatory region of target genes. When PER and CRY proteins accumulate to a critical level, they in turn repress BMAL1:CLOCK-mediated transcription, including their own transcription, by interacting directly with BMAL1-CLOCK complexes. This subsequently leads to reduced levels of PER and CRY protein and to a new cycle of activation and repression.

Figure 8 RORs function as integrators of circadian oscillators and the rhythmic expression of downstream (metabolic) genes. The rhythmic expression of RORs is greatly dependent on the ROR isoform and tissue type.The core loop of the oscillator consists of the heterodimeric activators BMAL1 and CLOCK that activate the expression of PERs and CRYs. PER and CRY heterodimers interact with the BMAL1-CLOCK complex and negatively regulate their transcriptional activity. BMAL1 and CLOCK also activate the expression of REV-ERBs, which through their interaction with ROREs repress the transcription of several genes, including BMAL1, CRY1, and RORγ . REV-ERBs are critical in the rhythmic expression of BMAL1, CRY1 and RORγ in liver and several other tissues. RORγ does not affect the rhythmic expression, but increases the peak level of expression of BMAL1, CRY1, NPAS2, CLOCK, and REV-ERB?.The major function of RORγ appears to be to regulate the oscillatory pattern of expression of downstream target genes and, therefore, the rhythmic nature of several physiological processes. RORα exhibits a very weak rhythmic pattern of expression in liver and its major function also appears to be in regulating the (rhythmic) expression of downstream target genes. SIRT, through its deacetylase activity, promotes the degradation of PER and inhibits the interaction of CRY with BMAL1/CLOCK complex, thereby enhancing BMAL1/CLOCK transcriptional activity.

The core loop is further regulated by several accessory pathways, including one in which the D box-binding proteins, the activator D site-binding protein (DBP) and the repressor E4 promoter binding-protein 4 (E4BP4 or NFIL3), play a role, and another that involves regulation by RORs and REV-ERBs through ROREs [Burris, 2008; Ko and Takahashi, 2006; Liu et al., 2008; Preitner et al., 2003; Preitner et al., 2002; Ueda et al., 2005]. ROREs have been identified in several clock genes, including BMAL1, CLOCK, and CRY1 [Guillaumond et al., 2005; Kumaki et al., 2008; Nakajima et al., 2004; Preitner et al., 2002; Sato et al., 2004; Ueda et al., 2002b]. The BMAL1 gene, which contains two ROREs in its promoter region, is positively regulated by RORs, whereas REV-ERBs repress BMAL1 transcription (Figure 8). Mutation of these ROREs abolishes the circadian rhythmicity of the BMAL1 promoter activation, indicating that these response elements are essential for rhythmic transcriptional regulation of BMAL1. Further study showed that BMAL1 expression is elevated and its rhythmicity impaired in fibroblasts deficient in both REV-ERBα and β, but fibroblasts deficient in only one of the REV-ERB receptors still retain BMAL1 rhythmicity [Liu et al., 2008]. These observations suggested that REV-ERBα and β are functionally redundant and essential for the rhythmic expression of BMAL1. However, REV-ERBα and β are not required for the rhythmicity of several other clock genes, including PER and CRY.
In contrast to REV-ERBs, RORs are not required for the rhythmicity of BMAL1 expression [Liu et al., 2008]. RORαsg/sg fibroblasts, which lack RORα and do not express either RORβ or γ, display rhythmic oscillations of BMAL1 or PER2 promoter-regulated luciferase reporter expression that are similar to that observed in WT fibroblasts. These findings are in agreement with studies showing that the rhythmic expression of various clock proteins, including PER2, CRY1, BMAL1, and CLOCK, was not altered in RORαsg/sg or RORγ null mice [Liu et al., 2008; Sato et al., 2004]. However, the peak expression levels of BMAL1, as well as that of several other RORE-containing clock genes, including CLOCK, CRY1, and NPAS2, were reduced in both RORαsg/sg and RORγ null mice, while those of PER2 and DBP were not changed. Regulation of BMAL1 by RORs is supported by findings showing that RORs interact with ROREs in the BMAL1 promoter and induce transcriptional activation through this promoter region [Akashi and Takumi, 2005; Guillaumond et al., 2005; Sato et al., 2004; Ueda et al., 2005]. This activation of BMAL1 expression by RORs appears to be mediated through the coactivator PGC-1α [Liu et al., 2007b]. Thus, RORs are not essential for the rhythmic expression of BMAL1 or other clock genes, but do regulate their level of expression. Moreover, in contrast to common regulators of the circadian clock, which appear to be ubiquitously expressed, RORs exhibit a much more restricted pattern of expression, consistent with the view that they are not common constituents of clock regulatory circuitry mechanisms. In addition to modulating the expression of several components of the circadian clock, the major function of RORs might be regulating the rhythmic expression of downstream target genes. Therefore, RORs may function as intermediates that couple the circadian oscillators with the cyclic control of various physiological processes, including energy homeostasis, lipid, and xenobiotic metabolism [Kang et al., 2007; Liu et al., 2008; Sato et al., 2004] (Figure 8).

Regulation of circadian expression of RORs


Как упоминалось выше, в некоторых тканях RORs обнаруживают ритмическую экспрессию во время циркадного цикла [Liu et al., 2008; Panda et al., 2002; Sato et al., 2004; Ueda et al., 2002b; Ueda et al., 2005; Ukai-Tadenuma et al., 2008]. Идентифицированы некоторые функциональные элементы, имеющие отношение к циркадному ритму, в промоторах RORs. Функциональные D-boxes были идентифицированы в RORα и RORβ, предположительно для регуляции с помощью членов семейства bZIP. Проксимальный промотор RORγ1 и RORα1 содержат по одному функциональному E-box, тогда как таковой в RORα4 содержит два E-boxes, это указывает на регуляцию с помощью BMAL1/CLOCK. Исходя из присутствия функциональных ROREs в промоторных регионах RORs, было предположено, что их экспрессия может контролироваться с помощью REV-ERBs белков. Наблюдение, что в печени и некоторых др. тканях экспрессия RORγ1 и REV-ERBs связаны обратно пропорционально, согласуется с мнением, что REV-ERBs действуют как репрессоры транскрипции RORγ1 и регулируют ритмичность экспрессии RORγ1 ('repressor-antiphasic-to-activator' механизм) [Liu et al., 2008; Ueda et al., 2005; Ukai-Tadenuma et al., 2008]. RORγ1, по-видимому, играет минимальную роль в контроле транскрипции REV-ERBs, поскольку их экспрессия лишь слегка затрагивается в печени in liver from RORγ null mice. Анализ экспрессии мРНК RORγ1 в печени BMAL1-/- мышей показал, что ритмичность экспрессии RORγ1 почти целиком устраняется и что экспрессия RORγ1 на всех CTs сильно увеличена [Grechez-Cassiau et al., 2008; Liu et al., 2008]. Следовательно, по крайней мере, в печени потеря экспрессии репрессора REV-ERB обнаруживается у BMAL1-/- мышей скорее всего ответственен за отсутствие ритмичности и уменьшенную или увеличенную экспрессию RORγ1 у этих мышей [Liu et al., 2008]. Экспресия была особенно повышенной во время CT6-8, время, когда REV-ERB обычно экспрессируется на высоком уровне. Как же транскрипция RORγ1 активируется в печени BMAL1-/- mice? Было предположено, что экспрессия RORs может управляться с помощью не-циркадных, тонических сигналов, таких как путь cAMP:cAMP response element-binding (CREB) [Liu et al., 2007a; Liu et al., 2008; O'Neill et al., 2008].

SIRT1 and RORγ expression


Посттрансляционные модификации, включая фосфорилирование с помощью casein kinases и др. киназ и ацетилирование. играют критическую роль в регуляции межбелковых взаимодействий, ядерной локализации, транскрипционной активности и оборота clock белков [Eide et al., 2005; Gallego and Virshup, 2007; Ko and Takahashi, 2006; Ripperger and Schibler, 2001]. CLOCK, который функционирует как histone acetyltransferase, участвует в ремоделировании хроматина во время циркадного ритма [Doi et al., 2006]. Помимо гистонов, CLOCK также ацетилирует др. белки, включая BMAL1 [Hirayama et al., 2007]. Недавно sirtuin 1 (SIRT1), NAD+-зависимая deacetylase, была идентифицирована как важный регулятор экспрессии циркадных генов. Было предположено, что он обеспечивает функциональную связь между метаболической активностью и циркадным контролем [Asher et al., 2008; Belden and Dunlap, 2008; Nakahata et al., 2008]. SIRT1 деацилирует гистоны и ряд транскрипционных регуляторов и связывает BMAL1-CLOCK-PER2 комплексы circadian-зависимым способом. SIRT1 катализирует деацетилирование PER2, облегчая тем самым его деградацию с помощью протеосомной системы. Поэтому отсутствие экспрессии SIRT1 ведет к высоким уровням PER2, приводя к уменьшению транскрипционной активности BMAL1-CLOCK и репрессии clock-контролируемых генов мишеней, включая пониженную экспрессию PER2 и CRY1 (Figure 8). Кроме того, SIRT1 индуцирует деацетилирование BMAL1 по Lys537, это редуцирует эффективность CRY взаимодействовать с и замалчивать CLOCK-BMAL1 [Nakahata et al., 2008]. Хотя RORγ1 экспрессируется на низких уровнях в эмбриональных фибробластах мышей (MEFs), его экспрессия значительно уменьшается в SIRT1 KO MEFs. Поскольку экспрессия RORγ1 позитивно регулируется с помощью BMAL1-CLOCK, то его экспрессия в SIRT1 KO MEFs может быть связана с замалчиванием активности BMAL1-CLOCK. Напротив, подавление RORγ1 в SIRT1 KO MEFs может, по крайней мере, частично объяснить пониженную экспрессию BMAL1, наблюдаемую в этих клетках.
Становится всё яснее, что SIRT1 действует как связь между circuitry циркадного ритма, клеточным метаболизмом и ядерными рецепторами, включая и RORs [Asher et al., 2008; Nakahata et al., 2008; Schwer and Verdin, 2008]. Одна такая связь затрагивает PGC-1α. SIRT1, как сообщалось, индуцирует деацетилирование и активацию PGC-1α, который действует как коактиватор некоторых ядерных рецепторов [Rodgers et al., 2008]. Это вместе с регуляцией циркадного ритма экспрессии ядерных рецепторов, является частью сложного механизма, с помощью которого ядерные рецепторы регулируют клеточный метаболизм. Интересно отметить, что пик активности SIRT1 приходится примерно на то же самое время, что и экспрессия мРНК RORγ1 (на CT16).

RORs and cellular metabolism


Changes in lipid metabolism and ROR-deficient mice


Накапливаются доказательства. указывающие, что RORs играют важную роль в регуляции нескольких метаболических путей, особенно липидного и стероидного метаболизма [Boukhtouche et al., 2004; Duez and Staels, 2008; Genoux et al., 2005; Jetten, 2004; Jetten and Joo, 2006; Kang et al., 2007; Lau et al., 2008; Lau et al., 2004; Lind et al., 2005; Mamontova et al., 1998; Raichur et al., 2007; Raspe et al., 2001; Vu-Dac et al., 1997; Wada et al., 2008a; Wada et al., 2008b]. RORαsg/sg мыши при нормальной диете обнаруживают выраженную hypo-α-lipoproteinemia и имеют более низкие уровни общего холестерола, high density lipoprotein (HDL), ApoA1, основных составляющих HDL, ApoC3, ApoA2, и триглицеридов в плазме по сравнению с WT мышами. Пониженная экспрессия обратных транспортеров холестерола ABCA1 и ABCA8/G1 в печени иApoA1 в кишечнике могут быть частично ответственны за пониженные уровни HDL. Идентифицированы функциональные ROREs в промоторных регуляторных регионах APOC2 и APOA1 [Raspe et al., 2001; Vu-Dac et al., 1997]. RORE в APOA1 промоторе взаимодействуют избирательно с RORα1, но не с RORα2 или α3. Хотя ApoA5 человека был идентифицирован как ген мишень для RORα ? его экспрессия не менялась в печени RORαsg/sg мышей [Genoux et al., 2005; Lind et al., 2005]. После старения, RORαsg/sg мыши менее чувствительны к развитию печеночного steatosis, чем WT мыши [Lau et al., 2008]. Кроме того, несмотря на их высокое потребление пищи старые RORαsg/sg мыши обладают пониженным индексом жира в теле. Жировые клетки в коричневой и белой жировой ткани меньше и уровень триглицеридов ниже в печени RORαsg/sg мышей, чем WT мышей. Повышенное потребление пищи коррелирует с наблюдаемым снижением экспрессии leptin. Как наблюдается для старых RORαsg/sg mice, 2-3 мес. RORαsg/sg мыши менее чувствительны к ожирению и steatosis, индуцируемых высоким содержанием жира в пище [Lau et al., 2008].
В противовес RORαsg/sg мышам, уровни холестерола и триглицеридов остаются неизменными у RORγ-/- мышей; , однако эти мыши обнаруживают снижение до некоторой степени уровней глюкозы в крови [Kang et al., 2007]. Мыши, дефицитные по RORα и RORγ (DKO) обнаруживают сходные изменения холестерола и триглицеридов и глюкозы, как это наблюдается и у одиночных KO мышей. Сравнение профилей экспрессии генов из печени WT, RORα-deficient, RORγ-дефицитных и DKO мышей, указывает, что RORα and RORγ могут функционировать как позитивные и негативные регуляторы генной экспресси. Помимо регуляции экспрессии разных наборов генов, выявлены уникальные регуляторные функции, некоторые гены лишь позитивно- или негативно регулируются у DKO мышей, указывая на определенную степень функциональной перекрываемости degree между RORα and RORγ [Kang et al., 2007]. Последнее скорее всего связано с их сходством в сродстве связывания RORE. Однако основные функции RORα и RORγ по-видимому, различны.

RORs in the regulation of (lipid) metabolism


Эффект RORα на гомеостаз триглицеридов может быть обусловлен изменениями в регуляции ряда генов, включая те, что вовлечены в контроль липогенеза и окисления жирных кислот. Экспрессия sterol regulatory element-binding protein 1, изоформы c (SREBP1c), которая является критическим регулятором липогенеза, и некоторых липогенных генов, существенно снижена в печени и скелетных мышцах мышей RORαsg/sg [Lau et al., 2008; Wada et al., 2008a]. Это ассоциирует с супрессией некоторых генов мишеней для SREBP1c, включая fatty acid synthase (FAS). LXRs и carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) считаются критическими факторами в регуляции SREBP1c [Cha and Repa, 2007; Pegorier et al., 2004; Wagner et al., 2003]. Однако экспрессия LXRs и ChREBP не изменяется существенно в печени RORαsg/sg vsitq. ChIP и промоторный анализ показали, что транскрипция SREBP1c находится под избирательным контролем RORα4, превалирующей изоформы RORα в печени [Lau et al., 2008]. Был сделан вывод, что RORα позитивно регулирует липогенез за счет увеличения экспрессии SREBP1c. Последнее может , по крайней мере, частично объяснить снижение тучности у RORαsg/sg мышей.
Экспрессия estrogen-related receptor α (ERRα) и peroxisome proliferators-activated receptors (PPARs) α, β, и γ, которые участвуют и в контроле липидного гомеостаза, не изменены у RORαsg/sg мышей [Desvergne et al., 2006; Tremblay and Giguere, 2007]. Однако экспрессия коактиваторов PGC-1α и β, которые участвуют в регуляции оксидативного метаболизма и глюкогенеза, была повышена в печени и коричневой жировой ткани, соотв. [Liu et al., 2008]. Экспрессия lipin 1, который выполняет множественные функции в липидном метаболизме и гомеостазе глюкозы в некоторых тканях, увеличена в печени и жировой ткани RORαsg/sg мышей [Lau et al., 2008]. Потеря функции lipin 1 ведет к печеночному steatosis и hypertriglyceridemia, но редуцирует печеночную ткань [Peterfy et al., 2001]. Lipin 1 взаимодействует непосредственно с ядерным рецептором PPAR-1α и коактиватором PGC-1α в комплексе, который модулирует экспрессии гена окисления жирных кислот в гепатоцитах [Finck et al., 2006]. Т.о., повышенные уровни PGC-1 и lipin 1 в RORαsg/sg печени могут усиливать метаболизм окисления и объясняют повышенную экспрессию acyl-coenzyme A dehydrogenase ACADM. Однако экспрессия carnitine palmitoyltransferases 1A и 1B (CPT1A/B), которые участвуют также в окислении жирных кислот, затрагивается незначительно в печени RORαsg/sg мышей. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять сложные взаимоотношения между RORα, его регуляцией липидного метаболизма и его эффектами на тучность и уровни триглицеридов.

Regulation of CYP7b1 and sulfotransferases


Некоторые гены, регулируемые с помощью RORs кодируют белки, участвующие в Phase I и II энзимах, которые важны для метаболизма xenobiotics, лекарств, средовых химикалий и различных эндогенных соединений, включая стеролы и желчные кислоты [Kang et al., 2007; Wada et al., 2008a]. Эти энзимы играют важную роль в элиминации и детоксификации эндогенных и экзогенных соединений. Один из генов, регулируемый с помощью RORs это oxysterol 7alpha-hydroxylase (Cyp7b1), который играет роль в альтернативном пути метаболизма холестерола, тогда как экспрессия Cyp7a1 и Cyp27, которые играют роль в основном метаболическом пути холестерола, не затрагиваются у ROR-дефицитных мышей. Cyp7b1, который преимущественно экспрессируется в печени самцов мышей, подавляется у RORαsg/sg мышей и затрагивается лишь в незначительной степени у RORγ-/- мышей [Kang et al., 2007; Wada et al., 2008a]. RORα регулирует экспрессию Cyp7b1 непосредственно путем связывания RORE в nt -951 в промоторной регуляторной области гена Cyp7b1. Этот RORE преимущественно соединяется с RORα скорее, чем с RORγ. Эти наблюдения указывают на то, что RORα функционирует как позитивный модулятор экспресси Cyp7b1. Недавние исследования идентифицировали CYP2C8, который играет важную роль в метаболизме лекарств, в качестве предположительно гена мишени для ROR в гепатоцитах человека [Chen et al., 2009]. И RORα и RORγ были способны усиливать активацию посредством RORE в промоторе CYP2C8 и усиливать экспрессию CYP2C8 в первичных гепатоцитах человека.
Sulfotransferase 1e1 (Sult1e1) находится среди генов, наиболее драматически индуцируемых в печени RORαsg/sg мышей, тогда как экспрессия изменяется незначительно у RORγ-/- мышей, указывая тем самым, что она находится под селективным контролем пути передачи сигналов RORα [Kang et al., 2007]. Экспрессия Sult1e1 в печени ограничена самками мышей. Она катализирует sulfonation эстрогена и estrone, увеличивая тем самым их растворимость и облегчая их транспорт и экскрецию [Duanmu et al., 2006]. Экспрессия Sult2a1 индуцируется в печени и RORαsg/sg и RORγ-/- мышей, указывая, что и RORα и RORγ действуют как негативные модуляторы экспрессии Sult2a1. Она катализирует sulfonation проканцерогенов, ксенобиотиков, гидроксистеролов и желчных кислот, включая dehydroepiandrosterone и lithocholic кислоту [Kitada et al., 2003]. В дополнение к этим sulfotransferases, экспрессия некоторых членов семейства hydroxysteroid dehydrogenase, многие из которых участвуют в биосинтезе или инактивации стероидных гормонов, регулируются с помощью RORs [Kang et al., 2007]. Эти наблюдения указывают на то, что RORs и особенно RORα, играют важную роль в регуляции специфических ступеней метаболизма желчных кислот и стероидов. Контроль некоторых sulfotransferases с помощью RORα интересен в отноршении сообщений, показавших, что cholesterol sulfate действует в качестве лиганда для RORα [Kallen et al., 2004; Kallen et al., 2002]. Возможно и др. сульфатированные стероиды или метаболиты холестерола могут действовать как лиганды высокого сродства для RORα и являются частью регуляторной петли обратной связи, которая контролирует специфические ступени метаболизма стероидов и холестерола.
Некоторые метаболические гены, регулируемые с помощью RORs описаны в качестве генов мишеней для др. ядерных рецепторов [Akiyama and Gonzalez, 2003; Kalaany and Mangelsdorf, 2006; Kliewer, 2003; Qatanani and Moore, 2005; Runge-Morris and Kocarek, 2005]. Напр., экспрессия Sult2a1 регулируется несколькими рецепторами, включая constitutive androstane receptor (CAR), hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) и pregnane X receptor (PXR) [Fang et al., 2007; Maglich et al., 2004]. Перекрывание между генами, регулируемыми с помощью RORα и liver X receptors (LXRs) особенно впечатляет [Gong et al., 2007; Wada et al., 2008b]. CD36, Sult1e1 и Sult2a1 индуцируются. тогда как экспрессия Cyp7b1 ингибируется с помощью активированного LXR, паттерн, который обратен наблюдаемому для RORα [Kang et al., 2007; Wada et al., 2008a; Wada et al., 2008b]. Это открывает возможность потенциально взаимодействия между путями RORα и LXR. Однако этого взаимодействия не происходит на уровне регуляции экспрессии LXR или ROR, поскольку экспрессия LXRα и β не меняется в печени RORαsg/sg мышей,тогда как экспрессия RORα остается неизменной в печени LXR DKO мышей [Lau et al., 2008; Wada et al., 2008a]. Хотя в культивируемых клетках наблюдается конкуренция между LXR и RORα за связывание общих коактиваторов, неясно, играет ли эта конкуренция физиологически важную роль. In vivo, противоположная регуляция общих мишеней с помощью RORα и LXR может использовать несколько механизмов, включая взаимодействие между ROR и LXR транскрипционными комплексами, связанными со своими соотв. чувствительными элементами в промоторе одного и того же гена мишени.

RORs and muscle


RORα и RORγ vHYR экспрессируется на высоком уровне в скелетных мышцах, указывая на регуляторную роль этих рецепторов в миогенезе или в функции мышц [Becker-Andre et al., 1993; Hirose et al., 1994; Lau et al., 1999]. Это подтверждается наблюдениями, показывающими, что RORαsg/sg мыши обнаруживают мышечную атрофию; , однако механизм, лежащий в основе этого фенотипа, четко не идентифицирован. C2C12 клетки скелетных мышц были использованы для проверки функции RORα и RORγ в миогенезе и липидном гомеостазе. Экспрессия доминантно-негативного RORα, лишенного LBD, задерживает морфологическую дифференцировку мышечных трубок и индукцию мышце-специфических генов, таких как helix-loop-helix транскрипционные факторы MyoD и myogenin, транскрипционные факторы, которые являются критическими для дифференцировки мышечных трубок [Lau et al., 1999]. Кроме того, экспрессия fatty acid translocase (FAT/CD36) и fatty acid binding protein 3 (FABP3), которые участвуют в потреблении липидов и жирных кислот, и lipoprotein lipase (LPL), CPT-1 и acyl-CoA-synthetase-4 (ACS4), участвующих в гидролизе и гидроксилировании триглицеридов, соотв., была снижена в этих клетках [Lau et al., 2004]. Экспрессия RORγ в C2C12 в клетках увеличивает экспрессию некоторых генов, включая CD36, FABP4, LPL, UCP3, fructose transporter GLUT5, adiponectin receptor 2 (ADPR2) и IL-15, указывая тем самым на роль RORγ в регуляции липидного метаболизма в мышцах [Raichur et al., 2007].

RORs and cancer


RORs and increased cancer susceptibility


Ряд исследований предоставил доказательства роли RORs при раке. Мыши, дефицитные по экспрессии RORγ обнаруживают высокий показатель тимусных лимфом, которые часто метастазируют в печень и селезенку [Jetten and Ueda, 2002; Ueda et al., 2002a]. В результате продолжительность жизни RORγ нулевых мышей сильно снижена. iПовышенное образование лимфом может быть связано с изменениями в гомеостазе тимуса, наблюдаемым у RORγ KO мышей [Kurebayashi et al., 2000; Sun et al., 2000]. Хотя молекулярный механизм. лежащий в основе усиленного образования лимфом ещё не установлен, он может быть связан с дерегуляцией дифференцировки и пролиферации в RORγ-/- тимоцитах. Интересно, что type B leukemogenic virus (TBLV), который вызывает T-клеточные лимфомы у мышей, часто обнаруживатся интегрированным на локусе RORγ [Broussard et al., 2004]. Однако в противоположность RORγ нулевым мышам экспрессия RORγ позитивно коррелирует с лимфомами. Участвует ли RORγ в лимфомах человека, пока неясно.
Др. потенциальная связь между RORγ и раком выявляется в исследованиях, показавших, что повышенная экспрессия Th17-ассоциированных генов, включая RORγ, IL-17 и IL-23, в опухолях желудка, возрастает в популяции циркулирующих Th17 клеток у пациентов с раком желудка [Zhang et al., 2008a], и высокий показатель Th17 клеток наблюдается в местах рака яичников [Miyahara et al., 2008]. Эти повышенные уровни провоспалительных цитокинов могут вносить вклад в патогенез рака. Альтерации в экспрессии или активности RORγt могут вызывать изменения в популяции Th17 клеток и в продукции провоспалительных цитокинов, влияя тем самым позитивно или негативно на прогрессирование рака.
Хотя нет явных связей между RORα и раком, в ряде исследований указывается на возможную роль RORα в развитии рака. Ген RORα занимает геномную область в 730 kb, которая расположена в средине ломкого сайта FRA15A в хромосомном диске 15q22.2 [Smith et al., 2006; Zhu et al., 2006]. Общие фрагильные сайты являются очень нестабильными регионами генома, обнаруживаемыми у всех индивидов, и являются они горячими точками для возникновения делеций и др. генетических альтераций, которые могут приводить к изменению экспрессии и функции генов, колируемых этими регионами. Общие ломкие сайты участвуют в некоторых заболеваниях человека и ассоциированы с рядом разных типов раковых опухолей [Smith et al., 2006]. Геномная нестабильность в FRA15A может приводить к изменениям экспресси RORα и играет роль в развитии определенных раковых опухолей. Эта гипотеза согласуется с наблюдениями, показавшими, что экспрессия мРНК RORa;часто подавлена в опухолевых клеточных линиях и первичных выборках раковых опухолей[Zhu et al., 2006]. Более того, исследования профилей генной экспрессии в разных раковых опухолях идентифицировали RORα в качестве гена обычно подавляемого в некоторых типах опухолей, особенно при раке груди и легких [Lu et al., 2007]. Анализ статуса метилирования ряда генов идентифицировал RORα в качестве одного из замалчиваемых за счет метилирования генов в линии клеток из рака желудка [Yamashita et al., 2006]. Последнее согласуется с концепцией, что пониженная экспрессия RORα позитивно скоррелирована с образованием опухолей.

RORs, hypoxia and stress


Некоторые исследования выявили связь между экспрессией RORα и гипоксией. Гипоксия важна в нормальной физиологии и при некоторых патологиях, включая ишемию, инсульты, сердечные атаки, хронические болезни почек и прогрессирование раковых опухолей [Pouyssegur et al., 2006; Semenza, 2000]. Восприятие кислорода является ключевым контрольным механизмом васкулогенеза и роста опухолей. Гипоксия запускает многочисленные клеточные реакции, в которых транскрипционный фактор hypoxia-inducible factor HIF-1α играет центральную роль. Некоторые исследования сообщают, что экспрессия RORα4, но не RORα1, индуцируется на высоком уровне в условиях гипоксии в разных типах клеток [Besnard et al., 2002; Chauvet et al., 2004; Chauvet et al., 2002; Miki et al., 2004]. Условия, которые воспроизводят эффекты гипоксии, включая воздействие cobalt chloride и iron chelator, desferrioxamine, также увеличивают и экспрессию RORα4 [Chauvet et al., 2002]. Помимо гипоксии некоторые др. стрессы индуцируют экспрессию RORα4, включая H2O2 и некоторые индукторы стрессов endoplasmic reticulum (ER) , включая farnesol, thapsigargin, tunicamycin и brefeldin [Joo et al., 2007; Zhu et al., 2006]. Эти наблюдения указывают на регуляторную роль RORα4 в реакции на гипоксию и стрессы. Исследования in vivo продемонстрировали, что ишемией вызываемый ангиогенез усиливается у RORα-дефицитных мышей [Besnard et al., 2001]. Эти наблюдения указывают на то, что RORα действует как важный негативный модулятор ангиогенеза. Ангиогенез контролируется с помощью про- и анти-ангиогенных факторов. Воспалительные клетки и цитокины также участвуют в регуляции ангиогенеза. Т.о., изменения в экспрессии про- и анти-ангиогенных или воспалительных генов у RORαsg/sg мышей могут объяснить наблюдаемое усиление ангиогенеза. Экспрессия про-ангиогенного vascular endothelial growth factor (VEGF) не изменяется при индуцированном ишемией ангиогенезе у RORαsg/sg мышей; , однако уровень interleukin 12 (IL-12), анти-ангиогенного цитокина, снижен.
Индукция экспрессии RORα4 с помощью гипоксии опосредуется через HIF-1α благодаря взаимодействию с hypoxia response element (HRE) в проксимальной части промоторного региона RORα4 [Chauvet et al., 2004]. Последующие исследования показали, что активация RORα4 с помощью гипоксии зависит от взаимодействия между HIF-1α и транскрипционными факторами Sp1/Sp3, связанными с GC-богатой последовательностью рядом с HRE [Miki et al., 2004]. Недавно было показано, что экзогенная экспрессия RORα повышает уровень белков HIF1α и VEGF, тогда как нокдаун экспрессии RORα с помощью siRNAs снижал экспрессию HIF1α и VEGF [Kim et al., 2008]. Более того, RORα усиливал образование капиллярных трубок с помощью эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Эти наблюдения указывают на то, что RORα может действовать как усилитель HIF1α- опосредованной реакции на гипоксию. RORα стимулировал и hypoxia response element (HRE)-зависимую активацию транскрипции репортера. Усиление HIF1α-опосредованной трансактивации с помощью RORα увеличивает стабильность белка HIF-1α и влияет на непосредственное взаимодействие между HIF-1α и DBD в RORα [Kim et al., 2008]. Некоторые эксперименты этого исследования базировались на активации RORα с помощью melatonin, довольно противоречивым предполагаемым лигандом RORα. Т.о., необходимы дополнительные исследования роль RORα и melatonin при гипоксии.
RORα1 and RORγ1 участвуют и в др. регуляторных функциях, связанных со стрессами. RORα1 обеспечивает защиту от апоптоза, индуцируемого оксидативным стрессом в кортикальных нейронах за счет увеличения экспрессии антиоксидантных белков glutathione peroxidase 1 (GPX1) и peroxiredoxin 6 (Prx6), редуцируя тем самым накопление связанных со стрессом reactive oxygen species (ROS) [Boukhtouche et al., 2006b]. Эктопическая экспрессия RORγ в C2C12 клетках усиливала экспрессию UCP3 и снижала продукцию ROS [Raichur et al., 2007]. Идентификация генов, регулируемых с помощью RORα может пролить свет на его точную роль в реакциях на гипоксию и стрессы.

Summary


Recent studies of RORs have greatly widened our understanding of the physiological roles of this nuclear receptor subfamily and provided exciting clues about their critical functions in embryonic development, cellular differentiation and proliferation, immunity, cellular metabolism, and circadian rhythm. The rhythmic pattern of expression of RORs in certain tissues and the regulation of several components of the circadian clock and metabolic pathways by RORs are consistent with the emerging view that the controls of these processes are coupled. RORs function as a subcomponent of the circadian oscillator and integrate the control of the circadian clocks and the rhythmic pattern of expression of (metabolic) genes and, as such, regulate the cyclic nature of several physiological processes, including energy homeostasis, lipid and xenobiotic metabolism. The reduced susceptibility of ROR?-deficient mice to hepatic steatosis and obesity suggests a role for ROR? in energy homeostasis. The critical regulatory roles that RORs have in thymopoiesis, development of several secondary lymphoid tissues, and Th17 lineage specification are highly relevant to a variety of immune responses and inflammatory disorders, including autoimmune diseases and asthma. The greatly decreased susceptibility to allergic airway inflammation, experimental autoimmune encephalomyelitis, and colitis in ROR-deficient mice raises the possibility that RORs might serve as potential novel targets for chemotherapeutic strategies to intervene in these disease processes. The discovery that ROR activity can be modulated by ligands strongly supports this prospect. Hopefully, the next decade will see the discovery of ROR-specific, clinically-useful (ant)agonists.
Сайт создан в системе uCoz