Семейство Rnd представляет собой подгруппу Rho семейства малых GTP-связывающих белков и состоит из трех белков у человека: Rnd1/Rho6, Rnd2/Rho7 и Rnd3/Rho8/RhoE. Rnd белки наиболее близки к Rho белкам, чем к Rac, Cdc42 или др. членам Rho семейства1 (FIG. 1a), но они обладают необычными свойствами по сравнению с др. белками Rho-семейства. Самые маленькие G белки являются молекулярными переключателями, которые обеспечивают циклы между поящимся GDP-связанным состоянием и активным GTP-связанным состоянием. Их активация контролируется guanine nucleotide-exchange factors (GEFs), которые стимулируют высвобождение GDP, благодаря его замещению на GTP. Как только активная GTP-связанная форма взаимодействуют с эффекторами, то может быть запущена инактивация с помощью GTPase activating proteins (GAPs), которые способствуют гидролизу GTP до GDP, возвращая тем самым белок к его покоящемуся состоянию. Для большинства белков Rho-семейства, эта GDP-связанная форма является доминирующей в покоящемся состоянии и взаимодействует с guanine dissociation inhibitor (GDI) белком, покрывает C-терминальную geranylgeranyl половинку и стабилизирует её в виде цитозольного Rho-GDI комплекса. Напротив, Rnd1, Rnd2 и Rnd3 всегда связаны с GTP и не регулируются с помощью подобного типа эффекторов. Исследования нейронов предоставили важную информацию о механизмах контроля активности Rnd белков и показали. что их экспрессия, локализация и фосфорилирование контролируют их активность скорее, чем GDP/GTP переключение.
Как и др. члены Rho-семейства, Rnd белки контролируют актиновый цитоскелет. Однако, их сравнительно позднее появление во время эволюции (FIG. 1b) показывает, что они могут быть вовлечены в изощренные или специализированные функции цитоскелета, напр., в пластичность нейронов. Rnd белки обнаружены только у позвоночных - млекопитающих, птиц, лягушек (Xenopus laevis) и рыб - но Rnd ортологи не обнаружены у асцидий2,3. Напротив, Rho, Rac и Cdc42 присутствуют у Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, растений и грибов (FIG. 1b).
Structure and expression
Большинство белков сверхсемейства Ras состоит из одиночного стержневого домена, который связывается с GDP или GTP, и имеют структуру, которая высоко законсервирована у большинства членов семейства. Однако, каждый член обладает специфическими, короткими расширениями на N и C концах стержневого домена, которые вносят вклад в их специфическую клеточную локализацию. Белки из ветви Rho имеют инсерцию из 3-оборотов
α-спирали, которая выпячивается от стержневого домена. Rnd белки имеют стержневой GTP-связывающий домен, который структурно сходен с таковым у Rho. Однако, они имеют замещения в менее важных позициях, которые драматически изменяют их биохимические свойства (BOX 1), это указывает на то, что в противоположность большинству др. малых G белков, Rnd1 и Rnd3 не являются молекулярными переключателями4-7. Эти свойства указывают также на то, что обычные 'dominant negative' и 'constitutively active' мутантны, которые были использованы для изучения канонических G белков, могут не работать для Rnd белков (BOX 2). Выявлены новые механизмы, которые регулируют активность Rnd белков и которые могут быть приложимы и к большинству конвенционных малых G белков.
Большинство белков семейства Rho geranylgeranylated по своим С концам, это отвечает за их ассоциацию с мембранами, тогда как Rnd белки оказываются farnesylated. Большая фракция RhoA ассоциирует с GDI белком,
который экранирует geranylgeranyl половинку и, следовательно, удерживает большой пул RhoA в цитозоле. При эндогенных уровнях экспрессии Rnd белки в основном ассоциируют с мембранами и, по-видимому, не ассоциируют с GDI5.
Все три челна Rnd-семейства экспрессируются в головном мозге, а функциональные исследования показывают, что Rnd белки вовлекаются в нахождение путей аксонами нейронов и могут выполнять важную роль в развитии головного мозга. Rnd1 экспрессируется также в печени, тогда как Rnd2 экспрессируется в семенниках. Rnd3 экспрессируется повсеместно на низких уровнях и его экспрессия может быть индуцирована с помощью различных сигналов. Один из органов, в котором Rnd3 экспрессируется на самом высоком уровне, является простата, а пониженная экспрессия Rnd3 наблюдается при раке простаты (BOX 3).
В фибробластах и эпителиальных клетках, Rnd1 и Rnd3 белки ко-локализуются с cadherins в слипчивых соединениях5. Пока неизвестно секвестрированы ли и инактивированы в этих сайтах Rnd белки или они выполняют активную роль в поддержании слипчивых соединений. Rnd3 обнаруживается также в Golgi8.
Effects on the actin cytoskeleton
Функции Rnd белков были изучены на нескольких типах клеток - включая фибробласты, эпителиальные клетки и нейроны - и выявлена четкая роль этих белков в контроле актинового цитоскелета. В фибробластах обработка lysophosphatidic acid (LPA) вызывает быстрое образование контрактильных acto-myosin кабелей (стрессовых волокон). Однако, экспрессия Rnd1 ингибирует образование стрессовых волокон в ответ на LPA5. Стрессовые волокна теряются, но тонкая актиновая сеть сохраняется с точечными скоплениями из актиновых узелков этой сети (FIG. 2a). экспрессия Rnd1 индуцирует также потерю фокальных адгезий, которые закрепляют стрессовые волокна в extracellular matrix5 (ECM). Клетки, которые лишены своих фокальных адгезий не могут распластываться (spread) и стремятся стать округлыми, но они сохраняют немногочисленные контакты, которые придают им звездообразный фенотип (FIG. 2). Rnd1 экспрессия индуцирует также потерю базальных стрессовых волокон в эпителиальных клетках в местах адгезии с ECM. Rnd1 и Rnd3 оказывают сходные эффекты на актиновый цитоскелет фибробластов, в то время как Rnd2 не оказывает или оказывает незначительный эффект5. Кроме того, экспрессия Rnd3 может индуцировать клеточную миграцию9, возможно за счет увеличения пластичности (или оборота) фокальных адгезий и ассоциированных стрессовых волокон. Интересно, что Rnd белки противодействуют действию Rho на актиновый цитоскелет в нейронах - Rho активация способствует ретракции нейритов, в то время как Rnd1 участвует в выпускании нейритов10,11, а Rnd2 индуцирует ветвление дендритов.
Targets of Rnd proteins. Все морфологические эффекты Rnd белков, которые были описаны, связаны с ингибированием RhoA-обусловленных контракций, это указывает на то, что Rnd белки ингибируют Rho. Показано, что Rnd1 и Rnd3 взаимодействуют с p190 RhoGAP, и рекрутируют этот белок в места, где Rho д.быть ингибирован12 (FIG. 3a). Rnd3 может также повышать присущую GAP активность p190 RhoGAP12, а избыточная экспрессия Rnd3 снижает фракцию RhoA, которая связана с GTP. Кроме того, эффекты экспрессии Rnd1 или Rnd3 значительно менее выражены в p190 RhoGAP-нокаутных клетках. Следовательно, эффекты Rnd1 и Rnd3 в основном опосредованы p190 RhoGAP12.
Помимо p190 RhoGAP, Rnd3 может непосредственно соединяться с и ингибировать Rock I, один из главных эффекторов Rho, но не Rock II, это указывает на то, что эти два Rho эффектора регулируются по-разному8. Rnd1, который не соединяется с (или соединяется плохо) с Rock I, является эффективным в индукции потери актиновых стрессовых волокон, это открывает возможность того, что стимуляция p190 RhoGAP может быть наиболее универсальным объяснением эффектов Rnd1 и
Rnd3. Rnd1 взаимодействует также с Src-homology-2 (SH2) доменом Grb7 (REF. 13), адапторного белка, который участвует в миграции клеток. Это взаимодействие может вносить вклад в ингибирование образования стрессовых волокон в ламеллоподиях, где Grb7 частично локализован14. Rnd2 не обнаруживает очевидных эффектов на актиновый цитоскелет в NIH-3T3 фибробластах, это согласуется с наблюдением, что Rnd2 плохо взаимодействует с p190 RhoGAPs12. Однако, Rnd2 экспрессируется в нейрональных клетках15, где он регулирует актиновый цитоскелет. Этот контроль может быть опосредован с помощью rapostlin, Rnd2-специфического эффектора, который экспрессируется главным образом в головном мозге и участвует в Rnd2-индуцированном ветвлении дендритов16,17. Rapostlin обеспечивает эффекты Rnd2 на актиновый цитоскелет, но взаимодействует также с микротрубочками и может , следовательно, координировать эффекты Rnd2 на эти две структуры цитоскелета.
Интересно, что Rnd2 экспрессируется на значительно более высоких уриовнях в семенниках, чем в головном мозге. Socius18, еще один белок, который взаимодействует с Rnd2, преимущественно экспрессируется в семенниках и является прекрасным кандидатом на роль эффектора Rnd2 в этой ткани. Rnd2 соединяется также с Mgc RacGAP, RhoGAP, который экспрессируется на высоком уровне в тестисах; оба белка экспрессируются в ранних сперматидах и ко-локализуются в акросомных структурах19. Mgc RacGAP участвует в сборе контрактильного кольца во время цитокинеза20, и было бы интересно исследовать, играет ли в этом процессе роль Rnd2.
Evolution of Rnd targets. интересно, что ортологи p190 RhoGAP, Mgc RacGAP и Rock белки присутствуют у ascidians, D. melanogaster и нематод, которые лишены Rnd белков2,3. гены этих эффекторов были удвоены в ходе эволюции и некоторые из их белков д. использоваться для взаимодействия с Rnd белками, когда они появились позднее в ходе эволюции.
Rnds in axon guidance and neurite extension
Вовлечение Rnd белков в ведние аксонов достаточно хорошо изучено и описано для создания модели механизмов, которые контролируют активность Rnd белков. Наведение аксонов происходит путем направленного выпячивания ростового конуса. Сходные с филоподиями выпячивания нейритов, которые исходят из ростового конуса ощущают среду в нескольких направлениях. Нейриты убираются в ответ на отталкивающие сигналы и затем цитоскелет перестраивается, чтобы сориентировать ростовой конус в др. направлении, откуда он воспринимает привлекающие сигналы.
Semaphorins and plexins. Plexins являются рецепторами для
semaphorins, которые являются трансмембранными или секретируемыми белками, которые направляют клеточную миграцию или находят пути для аксонов. Распознавание semaphorin ведет к активации plexin и ретракции ростового конуса, благодаря Rho-зависимой контракции актина. Новый ростовой конус может затем сформироваться в др. положении, чтобы ре-ориентировать выпячивание аксона в др. направлении21.
Цитоплазматический хвост plexins содержит законсервированный домен с гомологией Ras GAPs. Plexin-B1, Sema-4D рецептор, может взаимодействовать одновременно с Rnd1 и R-RasoGTP и это взаимодействие стимулирует GAP активность plexin-B1 в отношении R-Ras (малого G белка, который участвует в клеточной адгезии и выростах нейритов22; FIG. 3b), который в результате инактивируется. Кроме того, С-терминалный конец plexin-B1взаимодействует с PDZ-домен-содержащим RhoGEF (PDZ-RhoGEF)
и активирует передачу сигналов Rho23 (FIG. 3b). В этом нейрональном контексте, и потеря адгезии благодаря инактивации R-Ras и контракция, которая обеспечивается активацией Rho, вносят вклад в ретракцию нейритов. Более того, plexin-B1 взаимодействует и возможно секвестрирует, Rac1, чтобы ингибировать передачу сигналов Rac. Rac1 д. стимулировать GAP активность plexin-B1 в отношении R-Ras, как это делает Rnd1 (FIG. 3b); фактически, Rac может соединяться с plexin-B1 лучше, чем Rnd1 (REF. 24). Plexin-A1, Sema-3A рецептор, также соединяется с Rnd1 и по-видимому, сходный механизм задействован при Sema-3A-индуцированном коллапсе ростового конуса25.
Хотя временные адгезивные комплексы, которые формируются во фронте ламеллоподий, необходимы для миграции клеток, стабильные фокальные адгезии обнаруживают тенденцию нарушать клеточную миграцию. Фокальные адгезии необходимы для закрепления стрессовых волокон, которые контрактируют, чтобы подтянуть вперед ядро и клеточное тело, но они д. разбираться в задней части, чтобы позволить отсоединение края и продвижение. Неожиданно в клетках COS7, активация plexin-B1 вызывает округление клеток (или коллапс) в течение минут, мешая базирующейся на интегринах адгезии и ингибируя миграцию клеток26. Во время округления клетки обладают тонкими, разветвленными отростками, фенотип сходен с тем, что наблюдается после избыточной экспрессии Rnd1 или Rnd3 (FIG. 2). Эти результаты указывают на то, что в разных контекстах, в ответ на экспрессию plexin-B1 в фибробластах, которые могут не экспрессировать некоторые мишени для plexin-B1 или ассоциированные белки, которые обнаруживаются в нейронах, активация plexin-B1может приводить к фенотипу, сходному с темя. что наблюдается после экспрессии Rnd белков. Округление клеток ассоциирует с потерей фокальных адгезий, но не известно, обусловлена ли эта потеря Rnd1 или Rnd3. Однако, эта потеря может быть обусловлена ингибированием R-Ras,
т.к. мутанты, лишенные активности R-RasGAP не могут индуцировать разборку фокальных адгезивных комплексов и последующий коллапс26. Эти исследования показали, что, по крайней мере, в этих не физиологических ситуациях коллапс может происходить в результате потери слипчивости без какой-либо потребности в RhoA-зависимой контракции стрессовых волокон. stress-fibre contraction. Фактически RhoA и Rock I или Rock II ингибирование может быть необходимо для коллапса.
Rnd1 также взаимодействует с plexin-A1 и это взаимодействие достаточно, чтобы активировать индуцированный plexin-A1 цитоскелетный коллапс, даже в отсутствие сигнала Sema-3A. Экспрессия RhoD ингибирует эффекты Rnd1 и оба белка. по-видимому, конкурируют за один и тот же сайт на plexin-A1, т.к. точковая мутация, которая, как было установлено, ингибирует связывание Rnd1, ингибирует также связывание RhoD25. Почему же взаимодействия с Rnd1 и RhoD дают противоположные эффекты, неясно, но они могут локализовать plexin-A1 в разных клеточных компартментах. Напр., RhoD, который в основном локализуется в эндосомах, может прекращать передачу сигналов Sema-3A после эндоцитоза своим рецепторам. GTP-связанный Rac1 также соединяется с той же самой областью plexin-B1, но не стимулирует PDZ-RhoGEF-обусловленной контракции (неизвестно, может ли Rac1 связывание ингибировать контракцию). В этом случае разные эффекты может быть обусловлены рекрутированием plexin-B1 в разные клеточные компартменты. В присутствии plexin-B1, добавление Rnd1
обнаруживает тенденцию стимулировать клеточные контракции благодаря активации RhoA с помощью PDZ-RhoGEF23 (FIG. 3b).
В нейронах взаимодействие plexin-B1 с Rnd1 служит для активации R-RasGAP и для ингибирования взаимодействия Rnd1 с p190 RhoGAP, что д. инактивировать Rho (FIG. 3a). Высвобождение p190 RhoGAP и взаимодействие с PDZ-RhoGEF необходимы в этом контексте, т.к. активация Rho участвует в ретракции нейритов. Интересно, что повышение концентрации cGMP может переключать отталкивание с помощью Sema-3A на привлечение27. Кроме того, известно, что cGMP может ингибировать передачу сигналов RhoA путем активации cGMP-dependent protein kinase (PKG), которая фосфорилирует C-терминальный serine на RhoA28. Можно предположить, что ингибирование RhoA с помощью фосфорилирования необходимо для переключения plexin-A1 на индукцию аттрактивных сигналов. Итак, возможно, что один и тот же белок может оказывать разные эффекты в зависимости от клеточного контекста - а именно, экспрессии разных белков, которые участвуют в эффекторном комплексе или активации параллельных сигналы передающих путей, которые модулируют или перенаправляют главный.
FGF receptor and neurite extension. FRS2β является закрепленным на мембране адапторным белком, который может взаимодействовать с активированным fibroblast growth factor-receptor-1 (FGFR1). В покоящемся состоянии Rnd1 взаимодействует с FRS2в и и оказывается более недоступным для др. взаимодействий (таких как с
p190 RhoGAP) (FIG. 4a). Однако, в присутствии FGF, рецептор FGFR1 фосфорилирует FRS2β по нескольким остаткам tyrosine и способствует взаимодействию growth-factor-receptor-bound-protein-2 (GRB2) адапторного и SH2-домен-содержащего-белка tyrosine phosphatase-2 (SHP2) с FRS2β. Rnd1 затем высвобождается и может взаимодействовать с p190 RhoGAP, чтобы ингибировать активацию Rho (FIG. 4b). Rnd1 взаимодействует с С-терминальной областью FRS2β, которая не фосфорилируется с покоящемся состоянии, тогда как SHP2 соединяется с той же самой областью только тогда, когда она фосфорилирована29. Фактически, в ответ на FGF, FRS2β фосфорилируется по двум тирозиновым остаткам С конца - очевидно, что фосфорилирование обоих тирозинов необходимо для полной диссоциации Rnd1 и связывания SHP2. Неизвестно, необходимо ли связывание SHP2, чтобы заместить Rnd1 или же связывание происходит только когда Rnd1 уже диссоциировал от комплекса. Функциональное значение Rnd1 в этом процессе было установлено, когда было показано, что knocking down Rnd1 супрессирует FGF-индуцируемые выросты нейритов в PC12 клетках29.
Хотя мишени, которые опосредуют эффекты Rnd1, еще охарактеризованы недостаточно, разумно предположить, что p190 RhoGAP является одной из мишеней, т.к. имеются уже строгие функциональные данные, указывающие на участие p190 RhoGAP в ведении аксонов, как у мух30, так и мышей31.
Rnd protein regulation
Экспрессия Rnd3 индуцируется с помощью Raf пути в Madin-Darby canine kidney (MDCK)клетках32 и с помощью platelet-derived growth factor (PDGF) в фибробластах8. В обоих случаях экспрессия Rnd3 может объяснить некоторые морфологические изменения, которые индуцируются с помощью этих сигналов. Кроме того, крупные исследования транскриптомов с использованием ДНК микромассивов показали, что экспрессия Rnd3 увеличивается в ответ на некоторые сигналы, такие как ultraviolet-B облучение33 и др. стрессовые стимулы. Экспрессия Rnd3 индуцируется также с помощью химиотерапевтического лекарства cisplatin, это указывает на то, что Rnd3 может играть роль в контроле ДНК повреждениями индуцируемых КПП (checkpoints)34.
RhoA участвует в контроле контракций гладких мышц, поэтому было бы интересно установить, как экспрессия Rnd3 увеличивается в ответ на физиологические сигналы, которые модулируют гладкомышечную сократимость. Экспрессия Rnd3 увеличивается в миометрии кроликов во время беременности, где она может ингибировать контрактильность м драматически снижается во время родов, когда экспрессия RhoA и Rock I увеличивается35. разные исследования показали, что Rnd1 индуцируется во время беременности в миометрии крыс, но усиление экспрессии Rnd3 не исключено36. АКроме того, Rnd1 ингибирует calcium sensitization гладких мышц37 и и это оказывает влияние на сократимость гладких мышц в варикозных венах38 - было установлено, что повышенная экспрессия Rnd1 и пониженная экспрессия Rock может вносить вклад в понижение сократимости гладких мышц38.
В кератиноцитах, связывание фактора VIIa с трансмембранным glycoprotein тканевым фактором. который инициирует свертывание крови, увеличивает экспрессию Rnd3. Поэтому было предположено, что это событие вместе с повышенной экспрессией некоторых др. генов, может вносить вклад в реакцию заживления ран39. Экспрессия Rnd1 и Rnd2 также иногда усиливается. Rnd1 индуцируется с помощью гипометилирования при раке желудка40 и во время воспаления в эндотелиальных клетках41, в то время как Rnd2 индуцируется в lipopolysaccharide-активированных моноцитах42.
Rnd3 phosphorylation. Некоторые намеки показывают, что Rnd3 может быть фосфорилирован43. Rock I, белок, который, как было показано, является мишенью для Rnd3, является киназой, поэтому время бы проверить, не может ли она в свою очередь фосфорилировать Rnd3. В само деле, Rock I, но не Rock II, соединяется и фосфорилирует эффективно Rnd3 по Ser11, но Rock I не фосфорилирует Rnd1 или Rnd2 (REF. 44). Однако, это фосфорилирование, по-видимому, не влияет на взаимодействие Rnd3 с Rock I или с p190 RhoGAP. Фосфорилированные формы Rnd3 были обнаружены только в цитозольных фракциях, тогда как не фосфорилированный Rnd3 обнаруживается ассоциированным с большинством мембран44. И Rock I и Rock II соединяются с и активируются с помощью RhoA, но мало известно о функциональных различиях между этими двумя киназами, которые очень сходны по своему киназному домену (92% идентичности). Наблюдение, что только Rock I, но не Rock II, соединяется и фосфорилирует эффективно Rnd3, является первым доказательством, что эти киназы имеют разные мишени и регулируются по-разному45. Сегодня физиологическое значение этих различий понимается плохо.
Некоторые исследования клеток тканевых культур показали, что Rnd3 может быть фосфорилирован in vivo. В голодающих NIH-3T3 клетках, PDGF стимуляция вызывает фосфорилирование Rnd3 по Ser11, но стимуляция с помощью LPA, которая активирует RhoA и Rock I, не оказывает того же самого эффекта. Это указывает на то, что активация Rock I с помощью RhoA не достаточна для стимуляции её киназной активности в отношении Rnd3. Однако, при некоторых условиях, Rock I эффективно фосфорилирует др. мишени, которые способствуют образованию стрессовых волокон, такие как myosin-light-chain phosphatase. PDGF активирует многочисленные пути, включая mitogen activatedprotein kinases (MAPKs), phosphatidylinositol
3-kinase (PI3K) и protein kinase C (PKC), но очевидно, что только PKC необходима для фосфорилирования Rnd3. которая индуцируется с помощью PDGF, в дополнение к активации Rock I. Однако, кинетика фосфорилирования Rnd3 в ответ на активаторы PKC, такие как PMA, значительно слабее, чем таковая для хорошо охарактеризованной непосредственной мишени PKC. Это указывает на то, что фосфорилирование Rnd3 в ответ на стимуляцию PKC может быть непрямым. Имеется consensus в сайтов PKC фосфорилирования на N конце Rnd3, а роль PKC в фосфорилировании Rnd3 ждет дальнейшего исследования. Более того, ингибирование Rock I не полностью блокирует фосфорилирование Rnd3 по Ser11, это указывает на то, что др. киназы могут быть вовлечены в этот процесс.
PDGF стимуляция индуцирует ruffling мембран в течение минут и быструю потерю акто-миозиновых волокон в течение первого часа. Эти эффекты коррелируют с увеличением экспрессии и фосфорилирования белка Rnd3, что может объяснить потерю акто-миозиновых волокон. LPA, которая мощно индуцирует акто-миозиновые кабели, не затрагивает стабильности или фосфорилирования Rnd3. Физиологически Rock I-обусловленное фосфорилирование Rnd3 может создавать негативную петлю обратной связи для ограничения активации Rock I. Дефосфорилирование и деградация Rnd3 может объяснить, почему Rnd3-экспрессирующие клетки возвращаются к нормальному фенотипу цитоскелета после нескольких часов44. Однако, точный механизм и локализация активации Rock I с помощью RhoA неизвестны. Т.к. активированный GTP-связанный RhoA преимущественно располагается на плазматической мембране, то активация Rock д. происходить здесь же, а активированный Rock д. затем действовать на свои субстраты (в основном myosin-light-chain phosphatase) в цитозоле.
Nobes et al.5 показали, что N-терминальная часть
Rnd1 или Rnd3 необходима для их собственной локализации на мембранах. Эта N-терминальная часть богата позитивно заряженными аминокислотами (Lys, Arg) и по-видимому, участвует в полярных взаимодействиях с негативно заряженными фосфатами phosphoinositides. Помимо фосфата на Rnd3, вблизи к этому базовому мотиву, по-видимому, индуцируется отталкивание от негативно заряженной мембраны и увеличивается цитозольный Rnd3. Сходный механизм описан для фосфорилирования C-терминального (Ser188) RhoA28.
Degradation by the ubiquitin/proteasome pathway. Несколько механизмов участвуют в гарантии тонкого и локального контроля активации small-G-белков, включая активацию с помощью GEFs, ингибирование с помощью GAPs и GDI обусловленную диссоциацию мембран. Др. механизм, который участвует, - это ubiquitin/proteasome-обусловленная деградация. Lemichez и др. показали, что конституитивно активный Rac1 обнаруживает повышенную чувствительность к ubiquitin/proteasome-обусловленной деградации и что эта деградация важна для клеточной подвижности46. Кроме того, E3 ubiquitin лигаза Smad ubiquitin regulatory factor-1 (Smurf1) рекрутируется на клеточные выпячивания, где он контролирует деградацию RhoA47. Локальная инактивация RhoA в ламеллиподиях может происходить в результате рекрутирования p190 RhoGAP, с помощью привлечения др. Rho GAPs посредством различных механизмов48 или с помощью целенаправленной деградации RhoA. Это изобилие ингибирующих возможностей может, по-видимому, является перегибом ('overkill'), но подчеркивает насколько важно гарантировать, что RhoA не будет активирован в том месте, где клетка расчитывает сформировать выпячивающиеся актиновые структуры, такие как филоподии, ламеллиподии или ростовые конусы нервов.
Интересно, недавно было показано, что фосфорилирование RhoA по Ser188 защищает его от ubiquitin/proteasome деградации49. Деградация Rnd3 также обеспечивается с помощью ubiquitin/proteasome, а фосфорилирование Rnd3 защищает его от деградации44; следовательно, можно предположить, что деградация Rnd3 контролируется сходным с RhoA образом. Rnd белки не регулируются с помощью GEFs и GAPs и , следовательно, они являются хорошими кандидатами на роль регуляции с помощью ubiquitin/proteasome деградации.
Rnd3 expression blocks cell-cycle progression
Хотя первые исследования, которые описывают эффекты Rnd3, были сфокусированы на регуляции актинового цитоскелета, однако группа Anne Ridley's недавно установила, что Rnd3 может участвовать в регуляции клеточного цикла. Они нашли, что среди молчащих фибробластов, стимулированных с помощью сыворотки, только 10% клеток, которые экспрессируют трансфицированный Rnd3, вступают S фазу спустя 20 ч после воздействия против 75% контрольных клеток. Это указывает на то, что гетерологичная экспрессия Rnd3 блокирует ход клеточного цикла в G1 фазе34. В фибробластах течение клеточного цикла нуждается в адгезии интегринов с ECM; следовательно, возможно, что Rnd3 может влиять на клеточный цикл путем снижения адгезии и индукции диссоциации базирующихся на интегринах фокальных адгезий. i
Недавно было показано, что Rnd3 может контролировать ход клеточного цикла с помощью ингибирования индукции циклина D1. Cyclin D1 индуцируется в G1 фазе, а пик приходится на среднюю и позднюю часть G150 и его экспрессия индуцируется с помощью различных митогенных сигналов - таких как ERK, PI3K-Akt или активации фокальных адгезивных киназ в ответ на образование интегриновых кластеров - но экспрессия Rnd3, по-видимому, не ингибирует какой-либо из этих путей (по крайней мере, не ранние ступени). Rac также индуцирует cyclin D1, но активация Rac в ответ на стимуляцию сывороткой не отличается в Rnd3-экспрессирующих клетках по сравнению с контрольными клетками. RhoA может активировать промотор cyclin-D1, однако экспрессия Rnd3 не влияет на активность промотора cyclin-D1 или уровни его мРНК. Фактически видно, что Rnd3 блокирует экспрессию циклина D1 на пост-транскрипционном уровне, т.к. экспрессия Rnd3 сильно снижает скорость биосинтеза cyclin-D134.
Экспрессия вируса папилломы E7 или аденовируса E1A - вирусные белки, которых обходят retinoblastoma (pRb) cell cycle checkpoint - достаточна для устранения ареста клеточного цикла, который индуцируется экспрессией Rnd3. Неожиданно эктопическая экспрессия одного cyclin D1 оказалась недостаточной, чтобы преодолеть арест, индуцированный с помощью Rnd3, это указывает на то, что экспрессия Rnd3 может также блокировать и др. мишени, которые участвуют в контроле клеточного цикла34.
Rnd3 экспрессия в клетках рака простаты вызывает арест роста (BOX 3). Интересно, что если DU-145 клетки рака простаты, которые лишены pRb, трансфицированы Rnd3 векторами, то Rnd3-экспрессирующие клетки арестовываются скорее в G2/M, чем в G1, а cyclin B1 и Cdc2 при этом подавлялись51. Эти данные указывают на то, что Rnd3 способен блокировать ход клеточного цикла на разных фазах. Более того, Villalonga et al. нашли, что в фибробластах экспрессия Rnd3 ингибирует Ras-индуцированные трансформации34. Это согласуется с наблюдением, что в эпителиальных опухолевых клетках молочных желез Rnd3 индуцирует образование плотных соединений52. Однако, повышенная экспрессия Rnd3 была найдена в некоторых опухолях человека, которые часто обладали Ras-активирующими мутациями: в опухолях поджелудочной железы53, в линиях клеток из рака толстой кишки54 или в опухолях, в которых активирован Raf путь, таких как меланомы (см. Cancer Genome Anatomy Project database in the Online links box). В самом деле активация пути Raf, как было установлено, увеличивает экспрессию Rnd3 в эпителиальных клетках почечного происхождения32. Следовательно, роль Rnd3 в трансформации может отличаться в эпителиальных клетках разного происхождения или в разных наборах трансформирующих событий как в случае самого
Rho50.
Conclusions and perspectives
Rnd proteins have important roles in the cytoskeletal
rearrangements required for axon guidance и
extensive studies in neurons helped to understand the
mechanisms that control the activity of Rnd proteins.
Candidate effectors of Rnd proteins in neurons, such
as p190 RhoGAP, Rock I, socius or rapostlin, need to
be studied in more detail. In addition, the functional
implications of Rnd proteins in brain development and
maturation remain to be determined55.
Several mechanisms might control the activity of
Rnd proteins. Transcriptional regulation of mRNA
levels has been described, most often for Rnd3, but the
molecular mechanisms are largely unknown. Therefore,
characterization of the transcription factors that control
Rnd3 expression is required. Translational regulation of
protein synthesis, possibly through the p70–S6-kinase
pathway, has to be studied too, as observed changes in
protein levels are often more dramatic than those in
mRNA levels. Sequestration in inactive complexes is
another possible mechanism; two examples have been
discussed in this review, but there are probably many
others that are still to be discovered. It has also been
shown that phosphorylation can change the activity,
localization or stability of the protein. To gain insight
into the role of phosphorylation in degradation, it would
be important to identify the E3 ligase that controls Rnd
degradation by the proteasome и to understand how
phosphorylation of specific sites protects Rnd3 from
degradation.
Defects in the RhoA–Rock pathway are associated
with several diseases that affect the smooth muscles.
Changes in Rnd protein expression have frequently
been found in these diseases и it is possible that Rnd
proteins are implicated in other diseases that result from
abnormal smooth-muscle function. The most convincing
data available so far indicate that Rnd3 protein expression
is often lost in prostate and breast cancer, consistent
with the observation that RhoC, with the opposite activity,
is frequently upregulated56. However, Rnd3 can also
favour cell migration и could therefore contribute
to tumour-cell invasion in tumours that have acquired
mutations that allow them to bypass the Rnd3-mediated
block of cell-cycle progression. This could explain why
Rnd3 is frequently expressed at higher levels in some
cancers57,58, along with constitutive activation of the
Ras–Raf pathway. Studies of Rnd protein expression in
many types of tumour will help to clarify the involvement
of Rnd proteins in cancer. Finally, the physiological
functions of Rnd2 expression in the testis и that of
Rnd1 in the liver, are not precisely understood. Studies
using small interfering RNA knockdown of Rnd proteins
or the generation of Rnd-knockout mice will shed light
on the main physiological functions of Rnd proteins in
these organs and in the brain.
Сайт создан в системе
uCoz 
