Structural maintenance of chromosomes (SMC) proteins are ubiquitous in organisms from bacteria to humans, and function as core components of the condensin and cohesin complexes in eukaryotes. SMC proteins adopt a V-shaped structure with two long arms, each of which has an ATP-binding head domain at the distal end. It is important to understand how these uniquely designed protein machines interact with DNA strands and how such interactions are modulated by the ATP-binding and -hydrolysis cycle. An emerging idea is that SMC proteins use a diverse array of intramolecular and intermolecular protein–protein interactions to actively fold, tether and manipulate DNA strands.
Рис.1. | The architecture of SMC proteins and SMC–protein complexes.
Рис.2. | Structure and action of SMC protein subdomains.
Structural maintenance of chromosomes (SMC) белки сегодня считаются как один из наиболее фундаментальных классов белков. которые регулируют структурную и функциональную организацию хромосом от бактерий до человека1,2. Два свойства SMC белков особенно привлекательны. Во-первых, различные функции хромосом, в которых они участвуют. Серии генетических и клеточно-биологических исследований продемонстрировали, что SMC белки играют критическую роль в сегрегации хромосом (во время митозов и мейза), в регуляции генов по всем хромосомам и рекомбинационной репарации.
Во-вторых, интригующим свойством SMC белков является их уникальная белковая архитектура. Хотя белки SMC первоначально считались 'chromatin motors'3, но накапливаются доказательства, что они представляют полностью новый тип белковых машин, которые функционируют как динамические линкеры генома. Несмотря на существенные усилия, мы имеем только некоторые представления на механизмы действия этого класса хромосомных ATPases (Refs 4-7).
Architecture of SMC proteins
General architecture. SMC белки являются крупными полипептидами (из 1,000-1,300 аминокислот) с уникальной доменовой организацией. Два канонических нуклеотид-связывающих мотива, известных как , располагаются отдельно в N-терминальном и С-терминальном доменах, соотв. Между двумя мотивами два длинных суперскурченных () мотива, которые соединены с не спиральными последовательностями. Возможность антипараллельной укладки длинных суперскрученных мотивов впервые была предположена Saitoh et al.8; последующие ЭМ и биохимические исследования9-11 установили, что SMC мономер складывается назад на самого себя посредством антипараллельных coiled-coil взаимодействий, создающих ATФЫ-связывающий 'head' домен на одном конце и 'hinge' домен на др. Два мономера ассоциируют др. с др. в шарнирном домене и формируют V-образную молекулу (Fig. 1a).
Длина каждого плеча составляет приблизительно 50 nm, что эквивалентно примерно 150 п.н. double-stranded DNA (dsDNA). Конформация SMC димеров чрезвычайно изменчива и выявляется широкий круг структур с помощью ЭМ, включая открытую-V, закрытую-V и кольце-подобную молекулу9 (Fig. 1b). Хотя большинство очищенных SMC белков присутствует в виде свободных димеров в растворе, описаны редкие примеры мультимерных образований. Напр., выявлены розетко-образные структуры в которые ассоциируют 4-8 димеров, возможно посредством своих головных доменов12,13.
Большинство, если не все, бактериальные геномы содержат по одному smc гену, чей продукт формирует гомодимер. У эукариот имеется, по крайней мере, 6 разных SMC белков, которые формируют гетеродимеры в специфических комбинациях. Пара - образует стержень cohesin комплекса, который обеспечивает слипчивость сестринских хроматид5, тогда как - является компонентом condensin комплекса, который существенен для сборки и сегрегации хромосом4. Оставшиеся два SMC белка, и , чьи последовательности существенно отличаются от таковых в SMC1-4, формируют третий комплекс, который участвует в репарации ДНК и checkpoint реакциях6. Каждый из димеров далее ассоциирует с разными наборами non-SMC регуляторных субъединиц, чтобы сформировать функциональный комплекс (Fig. 1c).
Интересно, что хотя и cohesin и condensin обладают двухплечей структурой, которая характерна для SMC белков, их конформации довольно различны, как показывает ЭМ. Шарнирный домен condensin закрытый, а суперскрученные плечи помещаются тесно др. к др. Три non-SMC субъединицы condensin формируют субкомплекс и соединtys с одним (или обоими) из головных доменов, формируя 'lollipop-like' (леденец на палочке) структуру14,15 (Fig. 1d, left panels). Напротив, шарнир cohesin широко открыт и плечи широко разведены. Non-SMC субъединицы cohesin, по-видимому, соединяют мостиком два головных домена, создавая кольце-образную структуру14 (Fig. 1d, right panels). Анализ взаимодействий между субъединицами показал кольцеобразную конфигурацию cohesin и объяснил её на молекулярном уровне, продемонстрировав, что N- и C-терминальные домены Scc1 соединяются с головными доменами Smc3 и Smc1, соотв.10. Сходным образом, бактериальные SMC (MukB у Escherichia coli) димеры ассоциируют с non-SMC субъединицами посредством своих головных доменов12,16-18. Важные линии доказательств указывают на то, что non-SMC субъединицы модулируют каталитический цикл SMC белков, а также их внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия.
Head structure. С-терминальный домен SMC белков содержит высоко законсервированные последовательности, которые характеризуются LSGG(E/Q)(K/R) мотивом8. Близко родственная последовательность, часто обозначаемая как (или С мотив), обнаруживается в крупном семействе ATP-binding cassette (ABC) ATPases, включая и double-strand break (DSB)-репарации белок Rad50. Недавние структурные исследования продемонстрировали, что соединение АТФ с головными доменами SMC управляет образованием nucleotide-sandwich димера19,20 (Fig. 2a), как это было показано для Rad50 (Ref. 21) и ABC транспортеров22,23. В этих структурах АТФ соединяется с карманом, формируемым Walker A и Walker B мотивами одной из SMC субъединиц и обеспечивает контакт с С мотивом второй субъединицы. Мутационный анализ этих ключевых остатков в Bacillus subtilis SMC белке (< a href="http://us.expasy.org/uniprot/P51834">BsSMC) подтвердил идею, что встреча головка-головка существенна для гидролиза АТФ; мутация в мотиве Walker A устраняет связывание АТФ, тогда как мутация в С мотиве делает возможным связывание АТФ, но блокирует встречу головка-головка и гидролиз АТФ24. Замена остатка Glu в мотиве Walker B на Gln (часто обозначаемая как мутация переходного состояния ) стабилизирует взаимодействие головок путем замедления гидролиза АТФ16. Итак, три мутации составляют мощный набор инструментов для выяснения механохимического цикла SMC белков (Fig. 2b; see below).
Учитывая гетеротримерную природу эукариотических SMC белков, может думать, что вовлечение SMC головных доменов всегда происходит гетеротипическим образом (напр., SMC1-SMC3, но не SMC1-SMC1 или SMC3-SMC3). Поэтому было сюрпризом обнаружить, что два SMC1 головных домена гомодимеризуются в белковый кристалл19. Хотя это может быть артефактом белковой кристаллизации, но нельзя исключить возможность, что это отражает способность SMC1 головных доменов от соседних комплексов взаимодействовать др. с др. и формировать крупные ансамбли белков.
Hinge structure. Аминокислотные последовательности SMC шарнирного домена уникальны для этого класса белков и отличны от Rad50 (Ref. 25). Нет указаний на то, что цинк или любой др. специфический катион необходим для обусловленной шарниром димеризации SMC белков. Кристаллическая структура SMC шарнирного домена у бактерий Thermotoga maritima показывает, что шарнирный мономер состоит из двух доменов, которые обладают псевдо-двухскладчатой симметрией10 (Fig. 2c). В этой структуре N-терминальная область одного мономера ассоциирует с С-терминальной областью того же самого мономера, формируя антипараллельную скрученную спираль. Димеризация достигается прежде всего за счет взаимодействий beta-слоя между мономерами, продуцируя торо-образную структуру, которая выпячивает два суперскрученных плеча в противоположных направлениях (Fig. 2c). Эта кристаллическая структура предоставляет неотразимые доказательства, что каждое плечо SMC димера состоит из внутри-субъединичной скрученной спирали скорее, чем из меж-субъединичной скрученной спирали (Fig. 1a).
В отличие от головка-головка контакта, который динамически регулируется с помощью АТФ и гидролиза, шарнир-шарнир взаимодействие очень сильное и происходит независимо от АТФ. Изучение с BsSMC показало, что мутации в законсервированных Gly остатках, которые локализуются в интерфейсе димеризации, дестабилизируют, обусловленную шарнирами димеризацию24. Замена 4-х Gly остатков в разных комбинациях вызывает прогрессивные изменения в свойствах седиментации BsSMC, это указывает на постепенное открытие шарнира. Наиболее тяжелый мутант, известный как DDDD, полностью нарушает димеризацию, продуцируя одно-плечевые мономеры11. Сходное мутационное исследование с использованием SMC1 и SMC3 головных доменов млекопитающих показало, что Gly остатки в обеих субъединицах д.б. мутированы, чтобы нарушить гетеротипическое взаимодействие шарнир-шарнир26. Учитывая, что последовательности шарнира SMC5 и SMC6 отклоняются существенно от тех. что в SMC1-4 и BsSMC, можно предсказать, что их димеризованная структура будет отличной от шарниров 'canonical' SMC белков. Тем не менее недавнее исследование идентифицировало аминокислотные остатки, которые, если мутантны, устраняют стабильную димеризацию SMC5 и SMC6 (Ref. 27). Становится ясным, что шарнирный домен SMC является не просто доменом димеризации; но он функционирует и как существенный детерминант динамического взаимодействия между ДНК и SMC белками11,28.
Hypothetical actions of SMC proteins
Как уже упоминалось, SMC белки принимают уникальную и беспрецендентную структуру, в которой центральный шарнирный домен соединяет два длинных суперскрученных плеча, каждое из которых имеет 'sticky' АТФ-связывающую головку на дистальном конце. С механистической точки зрения эта архитектура SMC белков очень интересна и указывает на то, что их механизм действия может использовать разные и динамические наборы внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий (Fig. 3). В принципе, могут быть рассмотрены два типа контактов головка-головка. Если два головных домена внутри димера соединяются др. с др. (внутримолекулярное соединение), то это будет приводить к формированию кольце-образной или закрытой V-образной молекулы (Fig. 3a). Если контакт головка-головка происходит между разными димерами (межмолекулярный контакт), то эжто д. создавать разнообразные структуры: такие как кольца двойных размеров, филаментозные или розетко-образные структуры (Fig. 3b). Возможно также, что длинные суперскрученные домены (stalks) участвуют в межбелковых взаимодействиях, предположительно АТФ-зависимым образом. Опять же такие взаимодействия могут происходить или внутримолекулярно (Fig. 3c) или межмолекулярно (Fig. 3d).
Сегодня имеющиеся линии доказательств указывают на то, что межмолекулярные межбелковые взаимодействия могут происходить в присутствии ДНК, но лучше обнаружимы в её отсутствие24. Даже если предположить, что все SMC димеры и комплексы, обладают общим базовым механизмом действия, они д. структурно и функционально дифференцироваться, чтобы осуществлять свои уникальные роли в хромосомной динамике. Сначала опишем базовую энзимологию бактериальных SMC белков и затем обсудим SMC комплексы, такие как condensin и cohesin, которые более сложные и со сложнфым действием.
Bacterial SMC proteins: understanding the basics
The mechanochemical cycle of SMC proteins. Энзимология SMC белков лучше всего была изучена на примере BsSMC в качестве модельной системы. BsSMC гомодимер взаимодействует с single-stranded DNA (ssDNA) и dsDNA, и обладает внутренне присущей (т.е., ДНК-независимой) АТФазной активностью, также как и ДНК-стимулируемой АТФазной активностью24,29. Когда обусловленная шарниром димеризация нарушена, то возникающие в результате одноплечие мономеры полностью теряют свою способность взаимодействовать с ssDNA и dsDNA11.
Эксперименты с укороченными конструкциями демонстрируют, что головной домен не существенен для базового связывания ДНК и что шарниром-обеспечиваемая димеризация двух суперскручыенных плеч определенной длины является минимальной потребностью для BsSMC, чтобы взаимодействовать с ДНК (). Соответственно, АТФ обладает незначительным, если вообще, влиянием на связывание ДНК BsSMC полной длины, как подтверждено стандартными gel-shift подходами. Однако, когда вносятся transition-state мутации (Glu1118Gln в BsSMC), которые стабилизируют головка-головка контакты за счет уменьшения гидролиза АТФ, то АТФ-стимулированное связывание ДНК становится легко обнаружимым16. Использование не-гидролизуемых или слабо гидролизуемых аналогов АТФ лишь частично воспроизводит такое стимулируемое нуклеоидом связывание ДНК. Слабая реакция SMC АТФаз на аналоги нуклеоида напоминает таковую у большинства ABC транспортеров22,30. Итак, хотя и скрытый при стандартных экспериментальных условиях, ATPase цикл SMC белков всё же играет важную роль в их динамическом взаимодействии с ДНК за счет модуляции цикла соединения и рассоединеняи головка-головка.
Недавно было показано, что шарнирный домен BsSMC выполняет критическую функцию по модуляции его механохимического цикла28. Шарнирный домен обладает двумя позитивно заряженными 'basic patches' (BP1 и BP2) , которые располагаются вблизи интерфейса димеризации симметричным образом: каждый из них состоит из критического остатка Lys (Lys565; BP1) в одной субъединице и трех последовательных остатков Lys (Lys666-Lys667-Lys668; BP2) из др. субъединицы (Fig. 2c). BP2, но не BP1, является существенным для инициального взаимодействия с ДНК. Хотя такой 'sitting' способ связывания ДНК не нуждается в рассоединении головка-головка (Fig. 4a, stage 1), он ведт к открытию плеч за счет запуска гидролиза АТФ, который связан с головным доменом, и который располагается приблизительно 50 nm от шарнирного домена (Fig. 4a, stage 2). Это конформационное изменение позволяет критическому остатку Lys BP1 экспозироваться, приводя к его стабильному взаимодействию с ДНК путем 'hooking' способа (Fig. 4a, stage 3). Хотя ни sitting, ни hooking способ не нуждаются в АТФ, но АТФ связывание оказывает негативный эффект на hooking способ из-за рассоеднения головка-головка, что является обязательным условием для этого способа связывания ДНК.
На соединение, достигнутое с помощью hooking способа, связывание АТФ оказывает позитивный эффект на взаимодействие SMC димера с ДНК путем управления соединением между свободными головными доменами. Такой контакт д. происходить или внутри димера ('trapping'; Fig. 4a, stage 4) или между разными димерами ('gathering'; Fig. 4a, stage 5), сводя тем самым две разные нити ДНК или два сегмента одной нити ДНК вместе. Межбелковое поперечное связывание и эксперименты по доминантно-негативной супрессии АТФазы показали, что разные димеры SMC на самом деле взаимодействуют др. с др. в присутствии ДНК16,24,28. Несмотря на это сценарий, описанный здесь, остается спекулятивным и нуждается в дальнейшем тестировании, он прекрасно объясняет 'mechanistic logic' двухплечевой структуры SMC белков и создает базисный каркас для понимания кажущихся сложными действиями SMC белков.
Интересно, что недавнее исследование с использованием предоставило доказательство др. примера удаленных коммуникаций посредством суперскрученных плеч в действии Rad50 (Ref. 31). В отличие от SMC белков димеризация Rad50 в первую очередь обеспечивается посредством его головных доменов (частично путем их взаимодействий с Mre11), в то время как взаимодействие между суперскрученными верхушками (известными как цинковые крючки25) является гибким. В отсутствие ДНК две верхушки ассоциируют др с др. внутримолекулярно, формируя кольцеобразную молекулу (Fig. 4b, stage 1). Когда ДНК взаимодействует с головными доменами, то внутримолекулярное apex-apex взаимодействие ослабляется (Fig. 4b, stage 2), что позволяет высвободиться верхушкам, что взаимодействовать с с таковым из др. комплекса, связанного с др. молекулой ДНК (Fig. 4b, stage 3). Роль цикла АТФ-связывания и -гидролиза в этой серии конформационных изменений и вообще изучена плохо. Итак, хотя инициальные сайты взаимодействия с ДНК могут быть разными у Rad50 и SMC белков, но предполагаемые способы коммуникаций на дальних расстояниях между двумя концами длинных молекул обнаруживают заметное сходство. Чрезвычайно интересно сравнить и выявить различия механистических действий двух разных классов белковых машин связывания ДНК, которые обладают ABC-ATPase доменами.
A tight gate-keeping mechanism. BsSMC взаимодействует специфически с двумя non-SMC субъединицами, ScpA и ScpB, как in vivo, так и in vitro16,17,32-34. ScpA принадлежит к сверхсемейству SMC-взаимодействующих белков, известных как , которое включает субъединицу из cohesin комплекса эукариот35. Было показано, что N- и C-терминальные домены kleisins содержат общий складной (folding) мотив, известный как winged-helix домен, соединяющийся непосредственно с головным доменом SMC9 (Fig. 5a). ScpB также содержит два winged-helix мотива и димеризуется посредством своего С-терминального half 37. ScpB соединяется с головным доменом BsSMC только в присутствии ScpA, и два белка кооперируются, чтобы стабилизировать BsSMC головка-головка контакт путем супрессии его АТФазной активности16.
Все эти результаты указывают на то, что АТФ, и составляют 'triple locking' систему, которая гарантирует тонкую регуляцию цикла соединение-рассоединение (engagement-disengagement) (Fig. 5b). Подобно роли АТФ вклад ScpA-ScpB в функцию BsSMC может быть или негативным или позитивным. Напр., стабилизация внутримолекулярных контактов головка-головка в растворе предупреждает открытие плеч и блокирует стабильное связывание dsDNA. Как только BsSMC связывается с dsDNA, то последующее действие ScpA-ScpB стабилизирует dsDNA связывание путем предупреждения рассоединения головка-головка16. Такой тонкий затворный механизм, по-видимому, важен для поддержания своевременной загрузки и разгрузки BsSMC-ScpA-ScpB, комплекса, который в противном случает д. вызывать абортивную компакцию нуклеоида.
Структурные и механические параллели между суперскрученными плечами SMC белков и трансмембранными доменами ABC транспортеров обсуждались ранее2,38. Короче, конформационные изменения ABC-ATPase доменов передаются субстрат-специфическим доменам и vice versa. Среди ABC транспортеров, транспортер maltose MalK является уникальным тем, что он имеет не-трансмембранный домен, который препятствует циклу соединения-рассоединения ABC доменов39. Относительное расположение этого С-терминального регуляторного домена MalK напоминает расположение эквивалентного домена в ScpA-ScpB (или kleisins в целом), указывая тем самым на дополнительную механистическую параллель между двумя классами ABC ATPases (Fig. 5c). Всплывшая тема заключается в том, что пара ABC доменов функционирует как получатель, передатчик и модулятор конформационных изменений белковой машины, которая поддерживает векторный транспорт или малых молекул через мембрану (в случае ABC транспортеров), или нитей ДНК в и из суперскрученной (coiled-coi) петли (в случае SMC белков).
Condensins: folding individual DNA duplexes
Condensins являются комплексами, состоящими из 5 субъединиц, которые играют центральную роль в сборке и сегрегации хромосом во время митозов и мейоза в клетках эукариот4 (Fig. 1c). У позвоночных SMC2-SMC4 гетеродимер составляет основу двуъ типов конденсиновых комплексов, condensin I и condensin II (Ref. 40).
Cooperative DNA binding by SMC2-SMC4 dimers. Димер SMC2-SMC4, по-видимому, соединяется с dsDNA кооперативным способом15,41. АТФ оказывает незначительный, если вообще, эффект на связывание dsDNA, это указывает на то, что кооперативное связывание dsDNA может обеспечиваться АТФ-независимым stalk-stalk взаимодействием скорее, чем АТФ-зависимым взаимодействием головка-головка. ЭМ исследования показали, что в условиях насыщения SMC2-SMC4 может собираться в две разные нуклеопротеиновые структуры - длинные гибкие филаменты и кольцеобразные тороиды ('doughnuts')42. Димер может также превращать комплементарные ssDNAs в dsDNA43 с помощью динамических межбелковых взаимодействий44; сходная активность была обнаружена и у BsSMC29. В противоположность BsSMC, димер SMC2-SMC4 обладает только слабой ATPase активностью, которая не усиливается в присутствии ssDNA или dsDNA41,45.
ATP-dependent supercoiling and looping. Голокомплекс Xenopus laevis condensin I, который состоит из SMC2-SMC4 и трех не-SMC субъединиц (Fig. 1c), обладает стимулируемой ДНК АТФазной активностью in vitro46. Два функциональных подхода показали, что голокомплекс может индуцировать позитивное суперскручивающее (superhelical) натяжение в dsDNA зависимым от АТФ-гидролиза способом. При одном подходе комплекс превращал расслабленную циркулярную ДНК в позитивно supercoiled ДНК в присутствие 46. Суперскручивающая активность не обеспечивается только за счет SMC2-SMC4 гетеродимера42,45; она нуждается в non-SMC субъединицах, которые фосфорилируются зависимым от митозов способом47. Это наблюдение согласуется с идеей, что активность in vitro может вносить непосредственный вклад в сборку и конденсацию митотических хромосом in vivo. Сходная активность была выявлена в фракции condensin, очищенной из эмбрионов Caenorhabditis elegans48, которая, как предполагается, представлена condensin II, который содержит др. набор non-SMC субъединиц. При втором подходе, комплекс condensin I превращал надрезанную (nicked) циркулярную ДНК в позитивно knotted форму ДНК (т.е., позитивный three-noded узел, известный также как трилистник) в присутствии 49. Эта вторая активность указывает на то, что condensin I не только вносит позитивные supercoils в ДНК, но и что он также обладает способностью организовывать (по крайней мере) две supercoils в упорядоченную, соленоидную форму.
Визуализация реакции суперскручивания с помощью показала, что одиночный конденсиновый комплекс может быть способен вызывать две supercoils ДНК, возможно посредством механизма 'wrapping'50. Наноманипуляции с одиночной молекулой ДНК с использованием показали, что condensin I может физически делать компактной ДНК зависимым от гидролиза АТФ способом51. Реакция компакции происходит высоко динамическим и обратимым образом и нуждается в относительно высоких концентрациях белков. Это поведение лучше всего может быть объяснено кооперативными действиями множественных комплексов condensin I на одиночную молекулу ДНК. Если позитивное суперскручивание ДНК использует часть этой реакции компакции, то может ожидать, что разные матрицы одиночной молекулы ДНК, суперскрученные позитивно или негативно, будут обладать различной кинетикой во время компакции. Однако, этого не наблюдается, по крайней мере, в сегодняшних экспериментальных условиях51.
A working model for the action of condensin. Хотя имеющиеся сегодня данные фрагментарны и трудны для полного увязывания др. с др., они начинают выявлять высоко динамические действия конденсина. Предполагая, что конденсин обладает некоторыми, если не всеми, из основных свойств BsSMC, то может предложить рабочую модель действия конденсина. Согласно этой модели закрытая форма конденсина делает его инициальный контакт с хроматином в виде sitting mode (Fig. 6, stage 1). Последующий гидролиз связей АТФ облегчает открытие плеч, которое ведет к более стабильному возаимодействию с хроматином посредством hooking способа (Fig. 6, stage 2). На следующих ступенях возможны два разных сценария. Согласно первому сценарию АТФ-зависимый контакт головка-головка между разыми молекулами конденсина может поддерживать упорядоченную сборку филаментозной структуры, которая создает и удерживает superhelical натяжение ДНК в самой себе (Fig. 6, stage 3). Альтернативно, локальное оборачивание ДНК , сопровождаемое контактом головка-головка внутри индивидуального комплекса может приводить к формированию chiral петель (Fig. 6, stage 3'). Такие структуры в дальнейшем д. организовываться в розетка-подобные конфигурации (Fig. 6, stage 4), чье спиральное наложение (stacking) возможно облегчается stalk-stalk взаимодействиями, приводя к сборке прометафазных волокон хроматина (Fig. 6, stage 5). Наконец, свертывание спиралью этих прометафазных волокон может превращать их в метафазные хроматиды (Fig. 6, stage 6).
Было предсказано, что эта серия событий достигается с помощью комбинированного действия межбелковых взаимодействий и superhelical натяжения ДНК, которое накапливается внутри нуклеопротеиновой структуры. Хотя по общему признанию высоко спекулятивная эта модель согласуется с цитологическими наблюдениями, согласно которым субъединицы конденсина ассоциируют сначала с периферической областью профазного хроматина52 и прогрессивно увеличиваются в количестве в центральной оси метафазных хроматид40,52-54. Кооперативное действие нескольких молекул конденсина, предположенное здесь, также может помочь объяснить механизм распространения, используемый комплексами дозовой компенсации у C. elegans55, condensin-подобными комплексами, которые специфически рекрутируются на Х-хромосомы и которые снижают наполовину экспрессию их генов.
Ясно, что дальнейшие исследования необходимы для тестирования или совершенствования этой и др. моделей действия конденсина. В частности, важно определить, до какой степени индивидуальные конденсиновые комплексы могут поддерживать одну или более из наблюдаемых реакций и как кооперативные взаимодействия между несколькими конденсиновыми комплексами могут вносить вклад в высший уровень организации и стабилизации. Важно также помнить, что физиологическим субстратом конденсина является хроматиновое волокно скорее, чем голая нить ДНК. Гигантские размеры комплексов и их плотность на хромосомах необходимо учитывать, стобы нарисовать полную молекулярную картину (Supplementary information S2 (figure)). Наконец, нельзя забывать специфическую роль non-SMC субъединиц, особенно тех субъединиц, что с двумя повторами HEAT40,56, в функционировании конденсина, которые ещё неизвестны. Т.к. формируют solenoidal, свежие (spring-like) структуры57, то возможно, что этот мотив предоставляет дополнительную структурную гибкость обусловленной конденсином сборки хромосомных структур высшего порядка.
Cohesins: linking sister DNA duplexes
Cohesins являются комплексами из 4-х субъединиц с центральной ролью удерживания сестринских хроматид вместе во время митозов и мейозов в клетках эукариот5 (Fig. 1c). Гетеродимер SMC1-SMC3 составляет основу cohesin комплекса.
The ring model for the action of cohesin. Модель действия cohesin, которая часто обозначается как 'ring' или 'embrace' модель, была предложена Nasmyth с коллегами (Fig. 7a) и базируется на наших знаниях об молекулярной архитектуре комплекса10 и ключевом регуляторном событии, которое связано с протеолитическим расщеплением kleisin субъединицы Scc1 (Ref. 58). Биохимическое вычленение10 и данные электронной микроскопии14 согласуются с идеей, что Scc1 соединяет мостиком головные домены Smc1 и Smc3, формируя тем самым состоящую из трех частей кольце-образную структуру (Fig. 1c). Согласно этой модели индивидуальные cohesin комплексы обнимают два ДНК дуплекса внутри их суперскрученных пространств, чтобы удержать сестринские хроматиды вместе вплоть до метафазы. Протеолитическое отщепление Scc1 с помощью в начале анафазы запускает открытие кольца и тем самым способствует разделению сестринских хроматид.
Модель далее предсказывает, что установление слипчивости сестринских хроматид возникает естественно, когда репликационная вилка проходит через кохезиновое кольцо, которое предварительно загружается во время G1 фазы клеточного цикла. В согласии с этой моделью и искусственное расщепление cohesin субъединиц in vivo, приводящее к диссоциации cohesin с хроматина и потери слипчивости сестринскими хроматидами59. Разработан биохимический подход для очистки реплицируемых циркулярных минихромосом из дрожжевых клеток60. Сohesin комплекс, соединённый с этими минихромосомами, высвобождается с помощью протеолитического расщепления его субъединиц in vitro. Напротив, линеаризация ДНК вызывает диссоциацию cohesin с минихромосом, указывая тем самым, что взаимодействие между cohesin и хроматином использует топологическое сцепление.
Biochemical studies of SMC1-SMC3 and cohesin. Несмотря на простоту и элегантность кольцевой модели биохимический анализ очищенного cohesin in vitro является менее успешным по сравнению с таковым бактериальных SMC белков и condensin компонент. Очищенный комплекс обладает слабым сродством к ДНК или хроматину и не выявляется АТФ-зависимой активности44,61,62. Важны два заметных различия между cohesin и condensin. Во-первых, cohesin стимулирует межмолекулярное сцепление закрытой молекулярной ДНК в присутствии типа II topoisomerase, в то время как condensin управляет внутримолекулярным образованием узелков (knotting) при том же самом методе61. Это наблюдение подчеркивает самостоятельность клеточных функций двух комплексов и согласуется с идеей, что cohesin функционирует в качестве межмолекулярного crosslinker ДНК, тогда как condensin функционирует как внутримолекулярный crosslinker ДНК63. Во-вторых, в отличие от димера SMC2-SMC4 или димера BsSMC, димер SMC1-SMC3 не поддерживает повторный отжиг (re-annealing) ssDNA44. Физиологическое значение этого наблюдения менее ясно, но оно указывает на то, что межбелковые взаимодействия между разными cohesin комплексами, если они вообще существуют, могут быть значительно слабее, чем те что между condensin комплексами. Во всяком случае, прямые доказательства кольцевой модели еще предстоит собрать с помощью in vitro исследований по реконституции с использованием очищенных компонентов.
Одно потенциальное затруднение, которое связано с биохимическим анализом cohesin, может быть таковым, что взаимодействие этого комплекса с ДНК регулируется более тонко, чем condensin. Напр., загрузка cohesin на хроматин in vivo нуждается в отдельном Scc2-Scc4 комплексе64, хотя подобный специализированный загрузочный фактор ещё не был идентифицирован для condensin. Комплекс Scc2-Scc4 д. фактически регулировать каталитический цикл cohesin, как это вытекает из генетических исследований, тестировавших поведение ATPase-дефектных SMC мутантов in vivo65,66. Итак, включение Scc2-Scc4 может быть необходимым для восстановления эффективных cohesin-ДНК взаимодействий in vitro.
Static rings or dynamic rings? Необходимы дальнейшие эксперименты для решения, по крайней мере, двух важных предсказаний кольцевой модели. Во-первых, оригинальная модель предсказывает, что взаимодействие cohesin с ДНК или хроматином является чисто топологическим. Такой способ соединения может быть верен для cohesin, но очевидно не для condensin или бактериальных SMC белков. Напр., SMC2-SMC4 димер и BsSMC димер могут соединяться с ДНК без управляемого АТФ контакта головка-головка или без non-SMC субъединиц, что может вызывать 'closure' суперскурученных плеч. Остается протестировать, происходит ли специфическое шарниром-обусловленное связывание ДНК, как это показано для BsSMC, приложимо к действию cohesin (и condensin).
Во-вторых, исходная кольцевая модель предсказывает, что одиночный cohesin комплекс обнимает две сестринские хроматиды внутри суперскрученных плеч. Это наиболее трудно тестировать. Сегодня имеющиеся доказательства не исключают возможность, что множественные cohesin комплексы взаимодействуют др. с др., чтобы собирать структуры высшего порядка (напр., двойное кольцо или спиральную филаменту) что важно для кохезии. Показано, что cohesin может ассоциировать с молчащим хроматином (в HMR локусе дрожжей) способом, который отличен от предсказаний, сделанных оригинальной моделью67. Сходным образом также возможно, что cohesin поддерживает кохезию по центромерам и регионам плеч механически разными способами, т.к. плотность и механизмы доставки cohesin в эти два региона отличаются существенно68-71. Некоторые примеры альтернативного расположения cohesin показаны на Fig. 7b. Учитывая разнообразие и гибкость структур cohesin и его участие в разнообразных наборах хромосомных функций, не является неожиданностью находка, что комплекс использует ряд различных вариаций в своем действии72.
Др. важный вопрос находится в области, как обусловленная cohesin кохезия может устанавливаться и модулироваться во время репликации ДНК и др. трансакций ДНК. У бактерий SMC белки могут быть загружены на ssDNA области, созданные позади репликативной helicase во время репликации ДНК28. Т.к. нет признаков, что cohesin обладает строгим предпочтением в связывании ssDNA, то такая модель не может быть непосредственно применима к эукариотическим видам. Фактически загрузка cohesin (и загружающего его фактора Scc2) на хроматин из бесклеточных экстрактов X. laevis зависит от сборки , но не от инициации репликации ДНК73,74. У Saccharomyces cerevisiae, cohesin соединяется с хроматином во время G1 фазы даже до сборки пререпликационного комплекса в местах репликации75.
Даже с помощью ряда факторов, связанных с репликацией, которые были идентифицированы и которые необходимы для собственно установления кохезии in vivo, остается полностью неизвестным, как они могут участвовать в купировании репликации с кохезией на механическом уровне. Более того накапливаются линии доказательств, показывающие, что взаимодействие cohesin с хроматином очень динамично и д.б. скоординировано с др. активностями хромосом, такими как активная транскрипция76-80 и репарация DSB81,82. В будущем будет существенно развита экспериментальная система. в которой функциональные связи между кохезией и др. трансакциями ДНК смогут быть в точности реконструированы
in vitro.
Conclusions and perspectives
Recent advances in biochemistry, genetics, electron microscopy, structural biology and biophysics have just begun to reveal the unique architecture of SMC proteins, and their highly dynamic and flexible actions. A common theme is that SMC proteins are ATP-modulated molecular linkers of the genome that actively fold, tether and manipulate DNA strands. Central to the actions of SMC proteins are ATP binding and hydrolysis by the ABC-like head domains, which regulate closing and opening, respectively, of the gigantic V-shaped molecules. It has become increasingly clear that the central hinge domain has an equally important role in modulating the mechanochemical cycle of SMC proteins. A number of basic questions remain to be answered, however. For example, how many DNA duplexes (or segments) do individual SMC complexes interact with simultaneously? Exactly how is the mechanical cycle of SMC proteins coupled to their catalytic cycle? How crucial are intermolecular protein–protein interactions in the action of SMC proteins? The emerging high-resolution approaches that allow us to visualize and to monitor protein actions in real time (that is, time-resolved atomic force microscopy and single-molecule nanomanipulation) will be instrumental in addressing these questions. The use of chromatin templates will also be one of the big challenges in the field. The crucial comparison of ABC transporters, Rad50 and SMC proteins will continue to enhance our understanding of the mechanics of this class of ubiquitous ATPases.
It will also be important to dissect the structural and functional variations among different SMC protein machines. Different SMC dimers display different biochemical properties in vitro. Distinct sets of non-SMC subunits confer additional levels of functional divergence to individual complexes. Whereas genetic and biochemical data are consistent with a gate-keeping role for the kleisin subunits, specific functions of other non-SMC subunits are completely unknown. The less-conserved subunits of condensin and cohesin are apparently unique to eukaryotes and could have more active roles, rather than the currently postulated regulatory roles in the dynamic organization of chromosomes.
Finally, it will be of great interest to study the mechanics of SMC proteins from an evolutionary point of view. The origin of SMC proteins precedes that of histones, and most, if not all, bacterial and archaeal species probably use SMC proteins as fundamental organizers of their genomes. Evolutionarily, the differentiation and functional specialization of SMC protein machines might parallel the changes of DNA polymerases, RNA polymerases and DNA-repair machineries, that would have contributed to modifying the size, content and dynamics of an organism's genome. It is therefore reasonable to anticipate that comparative analyses of SMC proteins might shed new light on the mechanism of genome evolution from the perspective of higher-order chromosome architecture and dynamics.
