Members of the structural maintenance of chromosomes (SMC) family share a characteristic design and configuration of protein domains that provides the molecular basis for the various functions of this family in
chromosome dynamics. SMC proteins have a role in chromosome condensation,
sister-chromatid cohesion, DNA repair and recombination, and gene dosage
compensation, and they function in somatic and meiotic cells. As more is
learned about how their unique design affects their function, a picture of
a dynamic and varied protein family is emerging.
(Рис.1.) | General structure of structural maintenance of chromosomes (SMC) proteins.
(Рис.2.) | Two modes of structural maintenance of chromosomes (SMC) protein folding and heterodimerization.
(Рис.3.) | Interaction of cohesin or condensin with DNA.
(Рис.4.) | Hypothetical roles of SMC1–SMC3-type complexes in recombinational repair.
(Рис.5.) | Association of SMC1–SMC3 complexes with chromosomes throughout meiosis.
(Табл.1) | Representative eukaryotic SMC proteins and complexes
Boxes
Box 1 | Just over the fence — the SMC-like Rad50 protein
Like structural maintenance of chromosomes (SMC)
proteins, Rad50 has a bipartite ATPase located at its amino and
carboxyl termini, separated by a long stretch of antiparallel
coiled-coil. The protein folds onto itself and the termini interact.
Two molecules of the Mre11 nuclease act together with Rad50 and Nbs1/Xrs2 in DNA DOUBLE-STRAND BREAK
REPAIR. They associate close to the amino/carboxyl globular
domains of two Rad50 molecules to form a heterotetrameric head
domain with a dimeric coiled-coil linker.
This arrangement indicates that ATP-controlled DNA binding and
nuclease activity are likely to occur.
The structure of the hinge domain, which, in Rad50, is rather a
short kink in the coiled-coil region, differs from that of canonical
SMC proteins. Interaction between the two Rad50 monomers is
facilitated by the hooking of the hinge kinks onto each other, and
depends on Zn2+ ions coordinated by crucial
cysteines.
Scanning-force microscopy confirmed much of this structure and
showed that the Rad50–Mre11 oligomer can link the ends of two linear
DNA molecules — for example, at a DNA double-strand break.
The terminal globular domains could bind DNA, and the hook-like ends
of the coiled-coil region could provide the link to the partner
Rad50–Mre11 molecule. This structure might tether DNA ends of the
same DNA molecules in non-homologous recombination, but it might
also support linkage between sister chromatids, and so homologous
recombination.
Немногие белки обладают и струткрными и динамическими свойствами подобно structural maintenance of chromosomes (SMC) белкам. Эти белки в основном не поддерживают определенную структуру хромосом (напр., конденсированное состояние), а скорее создают структуры и вызывают их динамическое изменение.
Белки SMC играют роль в когезии сестринских хроматид, конденсации хромосом, рекомбинации и репарации ДНК, и в компенсации дозы гена. Все SMC обладают общими характерными признаками, которые позволяют им осуществлять эти 4 различных, хотя и родственных функции в прокариотических и эукариотических клетках — это два глобулчрных домена на каждом конце аминокислотной цепочки, фланкируя расширенные суперскрученные (coiled-coil) области, которая разделена в центре шарнирным доменом (Рис. 1). У эукариот, известно 6 членов семейства SMC белков, а также 'SMC-подобные' белки (такие как Rad50; Box 1), которые обладают общими доменами и архитектурой в целом белков SMC. 6 классов эукариотических SMC белков названны SMC1–SMC6 у большинства организмов (Табл. 1), м.б. сгруппированы в соответствии с тремя типами гетеродимеров, которые они формируют: SMC1 и SMC3; и ; и и SMC6. У Saccharomyces cerevisiae ген SMC1 был выявлен впервые.
Внутри семейства SMC, SMC1 и SMC4 являются эволюционно близкими др. др., также как SMC2 и SMC3. Белки SMC5 и SMC6 (spr18 и rad18 у Schizosaccharomyces pombe) принадлежат к более родоначальному семейству. Все гетеродимеры составляют стержневой компонент больших мультибелковых комплексов, которые выполняют специфические функции. Существуют некоторые вариации: имеется два SMC4 белка у Caenorhabditis elegans, напр., и мейоз-специфическая изоформа SMC у высших эукариот, которая высоко гомологична SMC1,и поэтому названа (а каноническая SMC1 обозначена ).
Molecular features of SMC proteins
Свойства SMC белков определяются специфическими свойствами их 5 доменов (Рис. 1). N-терминальный домен всегда содержит box и NTP-связывающий мотив (консенсусную последовательность GXXGXGKS), a SMC1—SMC4 имеют также законсервированну. 4-х аминокислотную последовательность с неясной функцией (consensus FKSY). С-конец имеет DA box с -подобной последовательностью и LSGG signature
мотив, который являтся типичным для семейства ABC ATPase белков. Шарнирный домен харатеризуется набором из 4 вымоко законсервировнных глициновых остатков, которые обычно типичны для гибких областей белков, с консенсусной последовательностью G(X)6G(X)3GG (5 глицинов у некоторых прокариот).
Прокариотические SMC белки образуют гомодимеры, которые, как было установлено, являются антипараллельными, напр., у Bacillus subtilis BsSMC гомодимерами. Поэтому считается, что все SMC белки соединяются антипаралельными образом тлт по всей их длине (Рис. 2a) или они заваорачиваются назад на самих себя и соединяются своими шаринирами (Рис. 2b). Антипараллельное расположение SMC белков имеет важные следствия для их индивидуальных доменов — напр., N- и С-терминалный домены м. оказаться в тесной близости и м. взаимодействовать др. с др. Когда ко-экспрессируются у Escherichia coli, они формируют растворимые комплексы, тогда как большие фракции этих доменов остаются нерастворимыми, когда они экспрессируются индивидуально. В зависимости от способа упаковки — на самих себя или антипараллельно по всей длине — их оказывающиеся рядом терминальные домены будут или от одного и того же или от двух разных SMC белков (Рис. 2).
Определены функциональные и структурные аспекты глобулярных доменов.
Amino- and carboxy-terminal domains.
Хотя N-терминальные домены SMC белков неспособны соединяться с ДНК, их С-концы обнаруживают высокую специфичность к двунитчатой double-stranded (ds)ДНК, которая или богата A–T или м. принимать вторичную структуру, например, крестообразную.
Эксперименты по показали, что компоненты SMC1–SMC3-based комплекса когезии соедеиняются преимущественно с A–T-богатыми центромерными областями у дрожжей и часто секвестрируются в межгенных областях. С-терминальные домены способствуют ATФ-независимому повторному отжигу (re-annealing) комплементраных нитей ДНК и они, по-видимому, снижают искривленность ДНК. ATф-независимая re-annealing активность выявлена для некоторых SMC комплексов.
Кристаллические структуры высокого разрешения описаны для N-терминального домена E. coli SMC-подобного белка MukB и для слитой молекулы, которая образуется при соединении N- и С-концов термостабильного Thermotoga maritima SMC белка с коротким пептидом. Последний назван SMChd за его 'head domain' — который как полагают представлен глобулярной головкой, присутствующей у антипараллельных SMC гомодимеров.
Структура N-терминального домена MukB, с его расположенным на поверхности Walker A мотивом, указывает на тесное взаимодействие N- и С-концов, необходимое для образования функционального ATФase домена. Выделеные N-терминальные домены от некоторых эукариотических SMC белков м. связывать ATФ, но они не гидролизуют их. Пре-сформированный гетеродимер из N- и С-терминальных доменов, полный SMC димер, или даже SMC мультипротеиновый комплекс, по-видимоу, необходимы для эффективного гидролиза АТФ, что м. зависеть от ДНК. И в самом деле, SMChd агрегирует ДНК способом, который частично зависит от АТФ. Однако, гидролиз АТФ не выявлен и агрегация ДНК очень слабо стимулируется АТФ — в меньшей степени, чем сходный catalytic head domain (cd) прокариотического SMC-подобного белка, Rad50 (Rad50cd). Тем не менее, кристаллическая структура выявила, что два домена у SMChd образуют одиночный глобулярный домен и подтвердила еще раз антипараллельность SMC димеров.
Hinge domain.
Шарнирный домен, как полагают, отвечает за гибкость SMC молекул, т.к позволет структуре из двух плеч открываться или смыкаться. Гибкость м.б. достигнута за счет устранения α-спиральной структуры четырьмя законсервированными глициновыми остатками. Мутационный анализ BsSMC шарнирного домена показал, что потеря гибкости у мутантов в шарнироном доемене делает невозможным образовние дмеров с помощью BsSMC белка. Так, белки с аланином вместо 4-х из 5 глициновых остатков оказываются одноплечевой структурой. Важность шарнирного домена для димеризации подтверждается и кристаллической структурой T. maritima шарнирной области и систематическим анализом взаимодействий шарнирных областей S. cerevisiaeSmc1 и .
How do individual SMC proteins dimerize?
До сих пор не было ясн, какя же модель димеризации верна (Рис. 2).Эксперименты с различно меченными S. cerevisiae Smc1 или Smc3 мутантными шарнирынми доменами, экспрессируемыми в клетках насекомых. инфицированных baculovirus, представляют строгие доказательства в пользу модели fold-back (перегиба назад). У дрожжей не наблюдается гомодимеризации SMC белков и формирование димеров зависит строго от присуствия двух разных шарнирных областей — это, один Smc1 шарнирный домен и один Smc3 шарнирный домен. Замещение шарнира Smc1 на Smc3 шарнир устраняет образование гетеродимеров, как и замещение одного из шарниров коротким пептидом. Замещение Smc1 шарнироного домена на Smc3 позволяет этому мутанту димеризоваться с неизмененным Smc3. Итак, шарнирные домены необходимы и достаточны для специфической димеризации между разными SMC белками.
Дальнейшим подтверждением fold-back модели явился анализ кристалов из T. maritima SMC шарнирных гомодимеров, с которыми соседствуют суперскрученные области. Показано, что суперскрученные области, которые происходят из одного и того же белка расположены на одной и той же стороне димера. Бактериальный шарнирный гомодимер — и соотв. SMC шарнирные гетеродимеры — приобретают пирожок(doughnut)-образную структуру с N- и С-концами на одной стороне. Это сохраняет гибкость плеч SMC димеров и позволяет им легко приобретать V-образную структуруe. Это согласуется с тем фактом, что V-структура наиболее часто наблюдается при электронной микроскопии. Все это подтверждает модель, согласно которой гетеродимеры, образуемые SMC белками сложенными напополам, сцеплены своими шарнирными доменами и в принципе м. захватывать ДНК между своими плечами (Рис. 3).
Coiled-coil domains.
Менее известно о суперскрученных (coiled-coil) доменах. По крайней мере одна суперскрученная область — которая в SMC3 млеокпитающих — , как было показано, связыывается с ДНК, это открывает возможность того, что терминальные домены SMC белков являются не единственными частями, которые контактируют с ДНК. Взаимодействие coiled-coil доменов с ДНК наиболее вероятно с точки зрения 'embrace model' (Рис. 3a). Т.к. точно неизвестно, как ДНК проникает внутрь SMC кольца, то эта модель позволят сделать допущение множества потенциальных сайтов взаимодействия между доменами SMC бклка и хроматином, включая взаимодействия с С-терминальными доменами и, вообще, с coiled-coil доменами.
Теоретический анализ суперскрученных областей из SMC белков от дрожжей до человека выявил характерные паттерны устранения участков суперскрученности (Рис. 1). Позиция областей устранения суперскрученности, как полагают, создает гибкость в этих районах и должна, напр., вносить вклад в локальные перегибы в гетеродимере. Относительный вклад шарнирных областей и областей суперскрученности в общую гибкость SMC молекул еще необходимо определять. Однако, есть наблюдения специфических перегибов в суперскрученных плечах SMC в cohesin комплексах (хотя подобные перигибы не обнаруживаются в др. SMC комплексе, condensin.
Др. функции расправленных суперскрученных участков заключаются в их специфических последовательностях. Хотя их позиции законсервированы в подгруппах SMC их последовательности нет. Так, петли, формируемые в этих местах, м. представлять собой сайты взаимодействия с не-SMC белками. Однако, большинство этих белков взаимодействует с головочными доменами, а не с суперскрученными доменами. Во всяком случае, SMC суперскрученные домены, по-видимому, имеют специфическое функциональное значение.
SMC protein complexes
Наиболее впечатляющими комплексами, образуемыми за счет комбинации SMC1 и SMC4 белков, является cohesin, базирующийся на SMC1–SMC3,и condensin, с его SMC2–SMC4 сердцевиной. Гетеродимеры SMC5–SMC6 также образуют мультипротеиновые комплексы. Известно существование и некоторых др. комплексов, таких как комплексы млекопитающих, называемые RC-1, которые участвуют в репликации и репарации ДНК, комплекс компенсации дозы гена у C. elegans , который содержит гомологи SMC2 и SMC4, и по крайней мере два (возможно больше) мейоз-специфических комплекса SMC белков (Табл1.).
Cohesin
Когезивный комплекс существенен для слипания сестринских хроматид. По крайней мере два не-SMC белка — –Mcd1– и –SA — ассоциируют с SMC1–SMC3 гетеродимером в этом комплексе.Высшие эукариоты имеют два варианта соматического cohesin, которые отличаются по одной не-SMC субъединице, SA (Scc3) белок; они м. сожержать или SA1 или .
У дрожжей, cohesin существенен: S. cerevisiae мутанты разделяют свои сестринские хроматиды преждевременно и теряют хромосомы с высокой частотой. Эксперименты по экспрессии индивидуальных когезиновых субъединиц в разных комбинациях в клетках насекомых и анализ формирования комплексов с помощью pull-down подхода, показали, что Scc1 соединяется с головными доменами Smc1 и Smc3, образуя мостик между двумя N/C-терминальными головными доменами. Не выявлено связи Scc1 с белками, когда оба головных домена делетированы, и связывание Scc1 не зависит от шарнирного домена, в противоположность более ранним моделям. Др. не-SMC субъединица дрожжевого cohesin, Scc3, по-видимому, не соединяется непосредственно с Smc1–Smc3 гетеродимером, но связывается с ними через Scc1.
Картирование cohesin-association regions (CARs) у S. cerevisiae не только показало предпочтительное связывание с A–T-богатыми и центромерными последовательностями, но и выявило, что CARs не исключаются из теломерных областей и часто лежат вблизи транскрипционно молчащих областей — напр., на границе HMR локуса. Это вместе с данными о возможной роли Smc1 в ограничении распространения молчащего хроматина указывает на то, что cohesin или очень сходный комплекс м. предопределять границы сайленсеров (silencers).
Cohesin соединяется с хромосомами дрожжей в G1 фазе, обеспечивая слипание сестринских хроматид в S фазе и поддерживая его в течение всей G2 вплоть до перехода от метафазы к анафазе митоза. У дрожжей загрузка cohesin на хромосомы поддерживается с пощью независимого комплекса, который состоит из и . Устранение слипания сестринских хроматид нуждается в отщеплении не-SMC субъединицы cohesin, Scc1–Mcd1, с помощью separase Esp1, которая является цистеиновой протеазой. Первоначально, инактивирована благодрая ассоциации с , известным как securin, который высвобождается после деградации с помощью ubiquitin-зависимого пути протеолиза, чтобы активировать Esp1. У дрожжей cohesin диссоциирует от хромосом при переходе от метафазы к анафазе, но в клетках позвоночных примерно 95% cohesin уже диссоциировано перед вступлением в митоз. Остальные остаются ассоциированными с центромерной областью и диссоциируют при переходе от метафазы к анафазе, это позволяет хроматидам отделиться. Диссоциация cohesin нуждается в Polo/ киназе, которая фосфорилирует Scc1.
Cohesin агрегирует ДНК и стимулирует -зависимую межмолекулярную циркулярного ДНК субстрата. Это согласуется с предполагаемой ролью cohesin в межмолекулярном сцеплении двух молекул dsDNA.
Если cohesin соединяется с ДНК в G1, то как ДНК реплицируется по этим сайтам? Установлена роль белков, которые участвуют в репликации ДНК — таких как replication factor-C (RF-C), proliferating cell nuclear antigen () или — в переключении с одиночных dsDNA молекул на пострепликативную обеспечиваемую cohesin когезию двух дочерних dsDNAs.
Гипотетически, д. облегчать синтез ДНК поверх мест прикрепления cohesin, которые трудно преодолеваются стандартной кухней (machinery) репликации ДНК.
Альтернативная идея вытекает из embrace модели взаимодействия cohesin's
с ДНК (Рис. 3a). Cohesin м. связываться с пререпликативной ДНК в качестве кольца, который своим большим диаметром примерно в 40 nm, позволяет репликативной machinery проскальзывать поверх. Тогда необходим альтернативный репликативный аппарат для прохождения через сайт приклепления cohesin. Однако, на сегдодня нет данных в пользу этой модели.
Condensin
Функция condensin в конденсации хромосом при начале митоза. В клетках позвоночных condensin является в основном цитоплазматическим во время интерфазы, но ассоциирует с хроматином в митозе, обнаруживаясь вдоль всей митотической хромосомы. Condensin является комплексом из 5 субъединиц, содержащим SMC2–SMC4 гетеродимер (называемый также CAP-E и ), а также из не-SMC белков CAP-D2, и CAP-H (Табл. 1>). Все единицы комплекса важны для конденсации хромосом и клеточной жизнеспособности. Соотв. комплекс у C. elegans, который содержит MIX-1 (SMC2) и , лишь частично отвечает за конденсацию хромосом у этого организма, но он также поддерживает ориентацию центромер относительно полюсов веретена.
Однако, субъединичный состав этого holocomplex неизвестен. Это и тот факт, что происходит лишь частичная потеря конденсации у D. melanogaster SMC4 мутантов указывает на то, что condensin является не только фактором, который конденсирует хромосомы in vivo.
How does condesin condense chromosomes?
Condensin собирает митотические хромосомы в бесклеточной системе, полученной из яиц Xenopus laevis. Condensin важен для этой системы, т.к. когда экстраты лишаются condensin, сборка хромосом прекращается. Более того, добавление в такие деплетированные экстракты очищенного condensin, восстанавливает конденсацию хромосом.
Condesin м. также вызывать позитивное суперскручивание в реляксированной циркулярной ДНК, с помощью АТФ-зависимой реакции, которая зависит от присутствия и holocomplex. Однако, ни SMC2–SMC4 гетеродимер, ни не-SMC субъединицы сами по себе не активируются при этом подходе или при бесклеточном хромосом-конденсирующем методе. Если присутствует topoisomerase II, то разрезанная циркулярная ДНК превращается узловатую (knotted) структуру и упорядоченная, глобально скорченная вносится в ДНК. На базе ATф-зависимой реакции суперскручивания condensin's, предложена модель, в которой глобулярные головчатые домены condensin оборачиваются вокруг ~190 н.п. ДНК и тем самым создает две суперскурученные области в удаленном месте. Эти динамические взаимодействия с ДНК иллюстрируют потенциал condensin сворачивать ДНК внутримолекулярно и тем самым обеспечивать конденсацию хромосом в метафазе. Однако, необходимо подтвердить, могут ли эти in vitro активности быть необхоимыми и in vivo при функционировании condensin.
Knotting frnbdyjcnm condensin существенно стимулируется за счет фосфорилирования не-SMC субъединиц с помощью cyclin-B– кинащы, которая фосфорилирует также S. pombe cut3 (SMC4) и способствует ядермному импорту комплекса во время митоза. Необходимость в митотической, хромосом-ассоциированной киназе для рекрутирования condensin в митотические хромосомы наблюдалась и при изучении D. melanogaster и C. elegans condensin. Однако, неясно необходима ли эта киназа в системе Xenopus. Более того, помимо condensin и некоторые др. белки — такие как фосфорилированный гистон H3 и topoisomerase II — по-видимому, участвуют в конденсации хромосом.
Atomic-force микроскопия S. pombe condensin или его SMC гетеродимера cut3–cut14 в ассоциации с ДНК выявила, что все глобулярные домены димера располагаются в одном мемте — в виде большой одиночной головки, от которой отходят суперскрученные области. Все три не-SMC субъединицы condesin ассоциируют с головкой, образуя комплекс, сходный по виду с 'головастиком'. Предложена модель (Рис. 3b), которая, подобно embrace модели, использует связывание condensin комплекса посредством его димерных SMC шарнирных доменов (хвост головастика) с одной областью dsDNA молекулы. Сondensin захватывает и др. участок той же самой молекулы ДНК манжетка-подобным образом, замыкая манжетку и тем самым формируя большую петлю dsDNA, которая концы которой плотно сведены у ее основания. Сходная молеь манжетки для действия SMC в condensin комплексе предлагалдась и ранее.
The relationship between condensin and cohesin.
Мутации компонентов cohesin, таких как Scc1, или в др. белках, которые участвуют в когезии сестринских хроматид (напр., или Trf4/), не только затрагивает слипчивасть сестринских хроматидЮ но и нарушает конденсацию хромосом. Однако, cohesin не является необходимым для condensin-обусловленной конденсации хромосом. Более того, cohesin и condensin не ко-локализуются.
Баланс между cohesin и condensin присутствует в митотических хромосомах, как полагают, для определения состояния компакции хромосом. Постепенное замещение cohesin на condensin, начиная с хромосомных плеч, увеличивает конденсацию хромосом. Регуляторная сеть киназ предположительно координирует диссоциацию cohesin от хромосом и ассоциацию condensin с хромосомами в профазе. Возможные компоненты регуляторной сети включают Polo-подобные киназы, которые фосфорилируют и запускают даградацию Scc1 и последующую диссоциацию cohesin; cdc2–cyclin-B, которая фосфорилирует cohesin in vitro и снижает его сродство с хроматином, а также фосфорилирует одну из субъединиц condensin, чтобы активировать комплекс; и др. киназы, такие как Aurora B.
A gene-dosage compensation complex
Еще одной функцией SMC белков — которая выявлена только у нематоды C. elegans — это компенсация дозы гена. Комплекс, образуемый SMC2-типа белком MIX-1 и SMC4-типа белком , вместе с не-SMC белковыми субъединицами, снижает уровни транскрипции X-хромосомы у гермафродитов (XX) нематод на 50% за счет связывания с X хромосомой. Соотв. уровни X-хромосомных транскриптов у гермафродитов те же самые, что и у X0 самцов.
Два SMC ассоциируют с некоторыми из не-SMC белков, включая , , и DPY-28. SDC-2 возможно отвечает за поставку комплекса к Х хромосоме. У нематод, MIX-1 имеет и вторую функцию по сегрегации хромосом, которая не зависит от SDC-2 и SDC-3. В этом случае MIX-1 ассоциирует с SMC-4, но не с DPY-27, чтобы сформировать condensin комплекс, который вероятно содержит др. субъединицы, пока неидентифирированные. C. elegans имеет один SMC2 ген, MIX-1, но два SMC4 гена, DPY-27 и SMC-4. КогдаMIX-1 или SMC-4
удаляются из эмбрионов с помощью (RNAi) экспериментов, то хромосомы становятся как тонкие волокна во время прометафазы. Позднее, в метафазе, однако,обнаруживается существенная конденсация, которая указывает на то, что др. активности также м. вносить вклад в конденсацию хромосом у C. elegans. Сходным образом у D. melanogaster condensin локализуется как и у C. elegans, чтобы конденсировать митотические хромосомы в зависимости от Aurora B/AIR-2 киназы. Итак, у C. elegans MIX-1 участвует в разных,специфических функциях за счет смены партнеров по взаимодействию.
DNA recombination and repair complexes
RC-1.
В 1993, белковый комплекс млекопитающих, названный RC-1 был очищен. В бесклеточной реакции, RC-1 способствует рекомбинационной репарации двухнитчатых пробелов или делеций. Помимо делеции dsDNA субстрата — реципиента — реакция нуждается в гомологичной, интактной 'донорской' dsDNA молекуле.
Две субъединицы RC-1 комплекса были идентифицированы как SMC1 и SMC3. Комплекс катализирует несколько реакций, связанных с рекомбинацией, таких как зависимый от гомологии перенос ДНК между двумя dsDNA молекулами, повторный отжиг одиночной нити ДНК, формирование соединенных молекул, расщепление циркулоярных ДНК и репарация пробелов или делеций в dsDNA субстрате. , и неидентифицированная structure-специфичная ДНК эндонуклеаза ассоциированы с SMC1–SMC3 гетеродимером в жтом комплексе и этим комплексом катализируется купированный (coupled) ДНК синтез и реакция лигации.
Учитывая взаимодействие между cohesin и факторами репликации, м. предположить, что взаимодействия, обнаруживаемые в RC-1 между SMC1–SMC3 и ДНК полимеразой ε отражают сходство (и возможно временное) взаимодействий. ДНК полимераза ε вероятно вовлекается в репликацию ДНК как полимераза lagging-нити ДНК, но она участвует также и в репарации ДНК — особенно в — и возможно в рекомбинационной репарации. Возможно, что SMC гетеродимер действует сочетанно с полимеразой, чтобы поддержать репарацию разрывов double-strand DNA breaks (DSBs), которые возникают во время репликации ДНК.
SMC5–SMC6.
Еще один SMC гетеродимер — SMC5–SMC6 — также, по-видимоу, участвует в репарации ДНК. Изучение rad18-X мутантов S. pombe показало, что ген rad18, SMC6 ген, действует на вторичном пути пострепликативной репарации повреждений ДНК, такжи как индуцированные УФЛ (UV)повреждения, который отличается от стандартного пути нуклеотид-эксцизионной репарации. Ген rad18 и его гомолог у S. cerevisiae, RHC18, важны для пролиферации, а мутации чувствительны и ионизирующей радиации и УФЛ. Потребность в rad18 или его гетеромерном партнере spr18 (SMC5) для жизнеспособности также проистекает от их роли в репликации, репарации и митоическом контроле.
У S. pombe rad18 и spr18 белки образуют мультипротеиновые комплесы, которые содержат около 6 дополнительных белков и имеют мол. массу минимум 1.6 MDa.
Образование комплекса не нарушенису у мутантов rad18-X, затрагивающих шаринирный домен. Интересно, что экспрессия др. мутации, S1045A, которая располагается в LSGG signature мотиве, который сильно законсервирован во всех SMC белках, устраняет летальность rad18 делеционных линий, но не репарирует нехватки. Получены мутации separation-of-function, что было неожиданным, т.к. мутации затрагивают сильно законсервированный мотив.
У S. pombe, rad18 действует сочетанно с вновь обнаруженным белком репарации, rad60, для репарации DSBs. Мутации rad60 и rad18 являются . Недавно установлен не-SMC белок у S. cerevisiae, Nse1, ассоциирующий с SMC5–SMC6 гетеродимером. Мутации NSE1 гена,который важен для пролиферации клеток, являтся сверхчувствительными к ДНК-повреждаюещим воздействиям, это согласуется с прдеполагаемой ролью SMC5–SMC6 комплекса в репарации ДНК. Известен человеческий гомолог S. pombe rad18–spr18 гетеродимера.
Еще один SMC6 белок — белок MIM у Arabidopsis thaliana — участвет в рекомбинационной репарации у этого растения. Мутация mim гиперчувствительна к mitomycin C (DNA-cross-linking agent), methyl methane sulphate (an alkylating agent), UV-C и рентгеновским лучам. Кроме того mim мутанты дефектны также по соматической внурихромосомной гомологической рекомбинации, ген MIM еще одним примером, когда белок SMC участвует в репарации ДНК посредством гомологической рекомбинации.
Cohesin and DNA repair.
Cohesin факторы и белки, которые поддерживают ассоциацию cohesin с хроматином, участвуют также в копировании повреждений ДНК. Напр., S. cerevisiae smc1, scc1, scc3 или pds5 мутации гиперчувствительны к γ-иррадиации. Более того, эффективная репарация DSBs в G2 нуждается в Smc1 или Scc1, и в прохождении через S фазу в присутствии cohesin. Однако, передача сигналов от cell-cycle-checkpoint, по-видимому, не затронута у scc1 мутантов, т.к. клетки арестовываются, если облучаются в поздней S фазе. Авт. полагают, что чем больше cohesin присутствет в эукариотических клетках, тем больше нужды в слипчивости сестринских хроматид, некоторые из них м. участвовать в репарации ДНК во время поздней S и G2 фазах.
Делеция гена Scc1 в pre-B-клетках line DT40 кур не только выявляет недостаок в разделении сестринских хроматид, но и обнаруживает нарушение репарации спонтанных и индлуцированных радиацией DSBs, а также снижает частоты обменов сестринских хроматид. Это согласуется с исходным описанием Rad21 (Scc1) мутации у S. pombe как белка, связанного с репарацией DSB.
How do SMC proteins contribute to DNA repair?
Известные SMC белковые компоненты DNA-damage checkpoint, создают ли они структуры ДНК — такие как расположенные вдоль сестринские хроматиды — которые способствуют рекомбинационной репарации? Действуют ли они преимущественно связывась и , следовательно, маркируя сайты повреждения ДНК, или они взаимодействуют с или даже рекрутируют белки для рекомбинации и репарации ДНК? Или они действуют сами по себе в реакции репарации? Нет ответов на эти вопросы.
Возможно, что расположение вдоль и размещение радом двух гомологичных сестринских хроматид происходит быстро после того как они сиентезируются, становится возможной эффективная репарация посредством гомологичной рекомбинации между сестринскими хроматидами. Рекомбинационная репарация, которая используется в интактных сестринских хроматидах в качестве донора, происходит намного чаще, чем рекомбинация между гомлогичными хромосомами. Итак, наиболее вероятной функцией SMC белков в этой реакции является обеспечение структурной поддержки рекомбинационной репарации (Рис. 4). Помимо связи сестринских хроматид SMC белки через свои флексибельные шарнирыне домены и благодрая свой способности двигать ДНК, м. поддерживать рекомбинационные реакции путем сведения двух dsDNA молекул вместе, облегчая тем самым спаривание гомологичных ДНК.
Известно, что домены SMC белков преимущественно связываются с необычными структурами ДНК, такими как крестообразная ДНК, палиндромная ДНК и структурами ствол-петля. Предполагается, что SMC белки соединяются преимущественно с опреденными сайтами поврежденной ДНК — которые также имеют 'необычную' структуру — хотя м.б. и не столь хорошо выраженную (Рис. 4b). Еembrace model' для связывания cohesin's с ДНК ставит вопрос, м. ли SMC кольцо двигаться водоль ДНК. Это в свою очередь вызывает вопрос, м. SMC кромплексы двигаться вдоль ДНК и оценивать повреждения ДНК. Кольцо SMC м. также стабилизировать спаренные структуры, как те, что возникают, когда одна из сестринских хроматид несет делецию (Рис. 4c).
Кроме того SMC комплекс м. потенциально взаимодействовать с определенными белками репарации и помогать строить или поддерживать 'repairosome' (Рис. 4d>). Активности, обнаруженные у некоторых SMC белков — такие как повторный отжиг (reannealing) одиночных нитей ДНК, образование D-петель или их участие в бесклеточной реакции рекомбинации ДНК — м. указывать даже на более активное вовлечение SMC белков в рекомбинацию ДНК. Однако, пока отсутствуют in vivo доказательства, это остается спекулятивным.
Еще одна потенциальная роль, связанная с рекомбинацией, белков SMC или cohesin - это защита. Присутствие CARs в повторяющихся ДНК м. гарантировать, что рекомбинация между повторяющимися элементами ДНК — которая как известно обусловливает геномную нестабильность — будет происходить преимущественно между сестринскими хроматидами, а не между разными хромосомами. Изучение мутаций рекомбинации ДНК у млекопитающих показало, что за счет направленной рекомбинации сестринских хроматид скорее, чем разных хромосом, вероятность поддержания геномной интеграции будет увеличиваться — напр., за счет снижения вероятности транслокаций.
Получены доказательства эффекторной функии SMC1 в ответ на повреждения ДНК. Облучение клеток дрожжей или млекопитающих рентгеновскими лучами, но не УФЛ запускает фосфорилирование SMC1. Это фосфорилирование зависит от , которая в ответ на ионизирующее облучение необходима для активации КПП (checkpoints). Клетки, которые несут мутации в сайте фосфорилирования SMC1, обнаруживают повышенную чувствительность к ионизирующей радиации. Итак, SMC1 м. функционировать на пути ответа на повреждения ДНК, обеспечиваемого ATM киназой.
Эффекторная роль SMC1–SMC3 м.б. прояснена с помощью генетических данных от серии двойных мутантов S. cerevisiae, которые дефектны по Smc1 и одному из нескольких генов рекомбинации и репарации ДНК, которые защищают гомологичную рекомбинацию или пути негомологичного соединения концов при репарации DSB. Полученные результаты указывают на то, что Smc1 действует скорординированно с жтими разнообразными путями и что он вносит специфический вклад в гомологичную рекомбинацию ДНК.
SMC proteins in meiosis
Не сюрприз, что SMC и ассоциированные белки важны для мейоза, т.к. слипчивость сестринских хроматид, рекомбинация и репарация ДНК, а также конденсация хромосом , все они необходимы для хода мейотического цикла.
S. cerevisiae
Smc3 и Rec8, которые являются мейотическими гомологами Scc1 и необходимы для слипания сестринских хроматид и рекомбинации во время мейоза. Формирование — продольных структур, которые идут вдоль (SC), который формируется в мейотической профазе I — зависит от присутствия Smc3. Smc3 тесно ассоциирован с SCпо всей его длине вплоть до поздней профазы, когда белок, подобно Rec8, диссоциирует из хромосомных плеч, но остается ассоциированным с центромерами.
Сходный паттерн хромосомной локализации устанолвен для SMC3 млекопитающих. Используя мышей, дефицитных по SCP3, компоненту SC, было показано, что сборка SMC1 и SMC3 не зависит от SC. Вместе с др. компонентами cohesin, SMC1 и SMC3 формируют митотическую хромосомнцю поддерживающую структуру — хромосомный стержень — которая не зависит от SCP3. Однако, SMC1 (SMC1α) более рыхло и менее униформно распределен водль профазных хромосом, чем SMC3. Это ведет к предположению, что SMC1α, вместе с SMC3 и др. компонентами cohesin, м. в основном участвовать в слипчивости сестринских хроматид в хроматиновых петля во время мейотической профазы.
Гипотетическая модель, отражающая участие SMC белков в мейозе показан на Рис. 5. SMC3 и Rec8 обладают дополнительными функциями помимо профазы I — в центромерном слипании сестринских хроматид, которое необходимо для перехода от метафазы к анафазе мейоза II. Поэтому SMC3 обнаруживается вплоть до анафазы II в центромерах сперматоцитов. Установлено, что SMC1β имеет паттерн хромосомной локализации, более сходный с таковым SMC3. SMC1β , следовательно, м.б. специфичным для мейоза, и SMC1β (but not SMC1α) cо-участвует в центромерном слипании сестринскрих хроматид во время мейоза.
Эти результаты указывают также на существование, по крайней мере, двух разных содержащих SMC cohesin-подобных комплексов со специализированными функциями в мейотических клетках. Состав SMC1α- и SMC1β-комплексов еще низвестен. Мейоз-специфический Scc3-подобный белок (SA3, по-видимому, замещает Scc3 (или SA1, SA2) субъединицу, которая обнаруживается в митотическом cohesin, и исчезает из мейотических хромосом в анафазе I, сходно с SMC1α. Составы мейотических комплексов также м.б. изменены по ходу мейоза.
Недавно было показано, что cohesin Rec8 ассоциирует с хромосомами в мейозе раньше, чем SMC3 или SMC1β — в ранней лептотене. Это сходно с потребностью у S. pombe в rec8 в хроматине, в частности в центромерах, в пре-мейотической S фазе. Итак, Rec8 м.б. первым белком, ассоциирующим с ранним мейотическим хроматином. Согласно расширенной на мейоз embrace модели, это м. указывать на то, что кольцо-формирующий SMC гетероодимер быстро защелкивается в результате присоединения к Rec8, который уже ассоциирован с ДНК. Итак, Rec8 — а не SMC белки — должен предопределять место присоединения cohesin.
У C. elegans, удаление REC8 с помощью RNAi вызывает недостаток синапса хромосом в пахитене и преждевременное расщепление хромосом на сестринские хроматиды в диакинезе. Частые DSBs, чье появление зависит от присутствия мейоз-специфической endonuclease Spo11, обнаруживаются в диакинезных хромосомах у Rec8-depleted животных. Это указывает на то, что Rec8 участвует — или непосредственно или косвенно — в процессиннге мейотических meiotic DSBs, которые генерируются, чтобы инициировать мейотическую гомологическую рекомбинацию.
Мейоз I и I нуждаются в конденсации хромосом, поэтому следует ожидать, что condensin будет действоватьи в мейотических клетках. Устранение у C. elegans MIX-1–SMC-4 condensin не обнаруживает больше митотического фенотипа: нарушена сегрегация сестринских хроматид во время мейоза II, это согласуется с его локализацией в центромерах мейотических хромосом. Однако, сегрегация гомологичных хромосом в анафазе мейоза I нормальная, это указывает на то, что MIX-1–SMC-4 комплекс один не м.б. ответственным за конденсацию мейотических хромосом. Скорее он играет более специализированную роль.
Conclusion
Despite the rapid progress, many intriguing questions remain. These
apply to the many roles of the SMC proteins and their molecular
properties. The surface has only been scratched for some of these roles.
Questions that centre around the regulation of complex assembly, the
interactions of the complexes with chromatin in living cells, and the
flexibility of these interactions, or the enzymatic activities of SMC
proteins and their complexes, remain to be answered. What is the potential
of SMC complexes to react to a given need of a cell — for example, to cope
with lack of growth factors or with DNA damage? Can SMC proteins associate
with specific non-SMC proteins in response to the relevant signals? How
exactly is the interplay between cohesin and condensin regulated?
Clearly, if processes as central as those mediated by SMC complexes go
wrong, the cell might either die or become dysregulated and cancerous.
Translocations or other interchromosomal rearrangements in place of
cohesin-directed intersister recombination, miscoordinated DNA DSB repair
pathways, deficiency of the SMC5–SMC6-mediated postreplicative DNA-repair
pathway, or a failure to act properly in the ATM-dependent DNA-damage
response, are all dangerous avenues for the cell to enter. The ability to
transform fibroblasts just by overexpression of SMC3 illustrates how delicate a balance has to be maintained. Some of the meiotic failures, with their consequences of sterility or mis-segregation syndromes, might potentially be caused by deficiencies in SMC-based machineries and would be further examples of how important these complexes
are.
