Итак, cohesin обеспечивает слипчивость сестринских хроматид, удвоившейся ДНК в S фазе. Крупная структурная перестройка хромосом начинается в профазе с инициального высвобождения cohesin и прогрессивной загрузки condensins, и достигается кульминация формированием метафазных хромосом с хорошо очерченными сестринскими хроматидами. Этот процесс вычленения сестринских хроматид является предварительным условием для финального разделения сестринских хроматид, которое запускается протеолитическим расщеплением cohesin в начале анафазы. Динамическое поведение cohesin и condensins может тонко регулироваться под контролем кухни клеточного цикла и не удивительно большое количество специализированных факторов в этой регуляции (Fig. 3). Далее мы обсудим ряд событий, которые гарантируют расхождение митотических хромосом во временной последовательности.
Остается неясным, как установление слипчивости может быть связано с репликацией ДНК на механистическом уровне. Растущее количество связанных с репликацией слипчивых факторов трудно примирить с моделью, согласно которой репликационная кухня (machinery) просто проходит через кольца cohesin, которые уже были загружены на родительскую хроматиду (Fig. 4B, model 1; Haering et al. 2002). Др. возможность заключается в том, что cohesin подвергается временному конформационному изменению, когда он встречается с репликационной вилкой. После прохождения вилки комплекс может возвращаться к исходной конформации (Fig. 4B, model 2) или может превращаться в новую структуру, которая облегчает слипчивость (Fig. 4B, model 3). Альтернативно, репликационная кухня может толкать cohesin в направлении сайтов терминации (Fig. 4B, model 4), аналогично тому, что предположено для транскрипционной кухни (Lengronne et al. 2004; see below). Репликация последнего участка ДНК, где накапливается может осуществляться без дополнительных факторов, но может заканчиваться более эффективно с помощью связанных с репликацией cohesion факторов, таких как альтернативный RF-C комплекс. Это могло бы объяснить, почему многие из этих факторов несущественны для клеточной жизнеспособности у дрожжей. Создание системы, в которой связанная с репликацией слипчивость может быть реконструирована in vitro поможет протестировать эту модель.
Pds5 (известный также как BimD или Spo76) является др. белком. которые модулирует динамическую ассоциацию cohesin с хроматином (Fig. 3B). Т.к. этот класс белков высоко законсервирован от дрожжей до человека, фенотипы, наблюдаемые у PdsS-дефицитных клеток являются до некоторой степени изменчивыми у разных организмов. Напр., Pds5 является существенным для жизнеспособности и необходим для поддержания слипчивости в ненарушенных митозах у
S. cerevisiae (Stead et al. 2003), в то время как он не существенен у
Schizosaccharomyces pombe и дефекты слипчивости наблюдаются только после продолжительного G2/M ареста (Tanaka et al. 2001; Wang et al. 2002). Идея, что Pds5 является важным для пересмотра слипчивости, подтвержбдается также некоторыми исследованиями на др. организмах (Storlazzi et al. 2003; Wang et al. 2003). Клетки позвоночных обладают двумя Pds5-подобными белками, Pds5A и Pds5B, и умеренные дефекты слипчивости наблюдаются, когда уровень этих белков снижается (Losada et al. 2005). Неожиданно метафазные хромосомы, собирающиеся в Pds5-истощенных яйцевых экстрактах
Xenopus сохраняют повышенное количество cohesin, подтверждая тем самым, что Pds5 позвоночных могут не только стабилизировать слипчивость в интерфазе, но и участвовать в её эффективном роспуске в раннем митозе (Fig. 4C). С механистической точки зрения, было бы интересно отметить, что подобно Scc2, Pds5 содержит множественные HEAT повторы (e.g., Neuwald and Hirano 2000). Одна из возможностей заключается в том, что Scc2 и Pds5 используют один и тот же мотив, чтобы модулировать SMC ATPase цикл cohesin, но делают они это противоположными способами. Напр., Scc2 дестабилизировать или мобилизовать cohesin's взаимодействие с хроматином посредством действия в качестве его "opener", в то время как Pds5 может стабилизировать это взаимодействие, действуя как "closer". Точный баланс действий Scc2 и Pds5 д. регулироваться тонко с помощью специфических для клеточного цикла модификаций, таких как sumoylation или фосфорилирование, каждого из компонентов (Stead et al. 2003; Gillespie and Hirano 2004; Losada et al. 2005). Существование этого замысловатого регуляторного механизма может быть частично ответственно за довольно сложные и разнообразные фенотипы , обнаруживаемые у Pds5-дефицитных клеток среди др. организмов.
Resolving and restructuring sister chromatids in early mitosis
Release of cohesin from chromosome arms
У позвоночных большинство cohesin диссоциирует с хроматина в профазе и только небольшая популяция обогащает перицентромерную область, оставаясь на хромосомах в метафазе (Losada et al. 1998, 2000; Waizenegger et al. 2000). Эта ступень не влечет за собой протеолиз cohesin и регулируется с помощью двух митотических киназ, polo и aurora B (Fig. 3C; Losada et al. 2002; Sumara et al. 2002; Gimenez-Abian et al. 2004). Эксперименты с экстрактами яиц Xenopus, истощенных по polo и aurora B киназам, показывают, что это первоначальное удаление cohesin не нужно для condensin-обусловленной компакции хромосом. Вместо этого, оно является критическим собственно для разрешения (resolution) сестринских хроматид (Losada et al. 2002). Haul et al. (2005) идентифицировали специфичные для митозов сайты фосфорилирования в cohesin субъединицах SA2 и Sccl в клетках HeLa, и получили стабильные клеточные линии, экспрессирующие неспособные к фосфорилированию версии обоих белков (SA2-12xA и SCCl-9xA). В то время как экспрессия SCCl-9xA не обнаруживает измеряемого эффекта, но профазное освобождение от cohesin комплексов, содержащих SA2-12xA, было тяжело нарушено. Интересно, что separase-обеспечиваемый путь удаления высокого уровня cohesin вдоль целых хромосом, ведет к внешне нормальному расхождению в анафазе. В этих экспериментальных условиях, однако, эндогенные cohesin комплексы, содержащие дикого типа SA12 ( и SAl), удаляются в обычное время, что делает трудным определение функционального значения освобождения от cohesin в профазе.
Two-step loading of condensins
Удаление cohesin с хромосомных плеч в основном совпадает с загрузкой condensins с профазы и в течение прометафазы. Недавние исследования показали, что пространственное и временное распределение condensins I и II дифференциально регулируется во время клеточного цикла в клетках HeLa (Hirota et al. 2004; Ono et al. 2004). Condensin II находится преимущественно в ядре во время интерфазы, в то время как condensin I секвестрирован в цитоплазме с интерфазы и в течение профазы и получает доступ к хромосомам только после разрыва ядерной оболочки в прометафазе. Предполагается, что последовательная активация cyclin A-cdkl и cyclin B-cdkl может быть ответственной за последовательную загрузку condensin II и condensin I, соотв. (Fig. 3D,E; Ono et al. 2004; Hirano 2005). Как condensins в действительности загружаются на хромосомы до конца неясно. Между тем как загрузка cohesin нуждается в белка с HEAT повторами Scc2, такой же специализированный фактор загрузки еще не идентифицирован для condensins. Можно предположить, что две врожденные субъединицы, содержащие HEAT повторы (напр., CAP-D2 и CAP-G для condensin I) могут осуществлять функцию, аналогичную Scc2. Фактически они находятся среди первых мишеней для cdkl-зависимого фосфорилирования и их существенная роль в клеточном цикле, зависимом от загрузки condensin I подтверждена как в яйцевых экстрактах Xenopus (Kimura and Hirano 2000) , так и клетках тканевых культур [Ball et al. 2002). Более того, очень вероятно, что cdkl-зависимое фосфорилирование непосредственно стимулирует активность condensins in vivo, так как это было продемонстрировано in vitro (Kimura et al. 1998).
Condensins and chromosome architecture
Недавнее исследование с помощью комбинированной световой и электронной микроскопии клеток тканевой культуры млекопитающих подтвердило, что структурные изменения хромосом в начале и середине митозов могут быть механистически разными (Kireeva et al. 2004). Простейшим предположением из этих наблюдений является то, что condensin II инициирует раннее состояние конденсации посредством "hierarchical folding." После nuclear envelope breakdown (NEBD), condensin I может сотрудничать с condensin II при создании формы, выделения и стабилизации хромосом путем формирования структуры "axial glue" внутри хроматид. Почти все субъединицы condensin I обнаруживаются среди основных компонент биохимически определяемой фракции известно как хромосомный каркас (scaffold) (Hudson et al. 2003; Maeshima and Laemmli 2003; Gassmahn et al. 2005). На уровне световой микроскопии, condensins I и II по-видимому, перемежаются вдоль оси метафазных хроматид (Ono et al. 2003, 2004). Дифференциальное распределение двух condensin комплексов, по-видимому, уникально для индивидуальных хромосом (T. Ono and T. Hirano, unpubl.), что предоставляет возможное молекулярное объяснение классическому banding хромосом. Очень важно определить, как дифференциальное распределение condensins I и II может быть специфицировано характерным для хромосом образом.
В соответствии с предсказаниями, представленными выше, конденсация хромосом внутри профазного ядра задерживается в клетках, истощенных по специфическим для condensin II субъединицам, но не истощенных по специфическим для condensin I субъединицам (Hirota et al. 2004; Ono et al. 2004). В метафазе истощение condensin I- или condensin II-специфических субъединиц дает отличающиеся, высоко характерные дефекты архитектуры хромосом, в то время как истощение SMC стрежневых субъединиц вызывает наиболее тяжелые дефекты (Ono et al. 2003). Отличающиеся роли condensins I и II в сборке хромосом были продемонстрированы также убедительно на свободных от клеток яйцевых экстрактах
Xenopus. Необходимо установить в точности, как два condensin комплекса участвуют в оформлении и структурной поддержке метафазных хроматид (Gassmann et al. 2004; Hirano 2005). Степень дефектов, наблюдаемых в condensin-дефицитных клетках, варьирует в зависимости от разных условий и разных организмов, что может приводить к разным интерпретациям (Hagstrom et al. 2002; Coelho et al. 2003; Hudson et al. 2003; Chan et al. 2004; Dej et al. 2004; Hirota et al 2004; Watrin and Legagneux 2005). Критическая оценка роли индивидуальных субъединиц
in vivo, вместе с лучшим пониманием их функции
in vitro, дело будущего.
Sister chromatid resolution promoted by cohesin release and condensins' action
Два события, рассмотренных выше, высвобождение cohesin с хромосомных плеч и загрузка condensins, необходимы для собственно сборки метафазных хромосом, которые становятся компетентными к сегрегации в анафазе. На Рис. 2C представлено довольно спекулятивное мнение о том, как cohesin и condensins могут вести себя и работать во время сборки хромосом. Т.к. высвобождение cohesin и загрузка condensin могут оказаться не связанными экспериментально в яйцевых экстрактах
Xenopus (Losada et al. 1998, 2002), то разумно предположить, что два события сцеплены на механистическом уровне. Фактически, слабая задержка в высвобождении cohesin наблюдается в клетках HeLa, истощенных по субъединице condensin I (Hirota et al. 2004). Третьим компонентом. важным для выделения сестринских хроматид является topoisomerase II (topo II), энзим, который катализирует временное прохождение двух дуплексов ДНК. Предполагается, что позитивное суперскручивание или chiral петлеобразование ДНК поддерживаются с помощью condensins и могут облегчать topo H-обусловленную разъединение сестринских ДНК (Hirano 2000).Альтернативно, condensin-обеспечиваемая сборка осей сестринских хроматид может создавать движущую силу, которая толкает равновесие topo II действия в направлении разъединения (напр., Maesliima and Laemmli 2003; Kireeva et al. 2004). Два механизма не являются взаимно исключающими, т.к. осевое распределение topo II в метафазных хроматидах зависит от функциональных condensins (Coelho et al. 2003). Мы также полагаем, что совместное действие condensins и topo II может быть достаточно мощным, чтобы "управлять" вычленением сестринских хроматид в отсутствие сил от веретена (Paliulis and Nicklas 2004; Machin et al. 2005). Такой независимый от веретена механизм может также лежать в основе SMC-обеспечиваемой сегрегации хромосом в бактериальных клетках (Hirano 2002).
Building sister centromeres/kinetochores in early mitosis
Фундаментальный вклад cohesin и condensins в сегрегацию хромосом не ограничивается хромосомными плечами. Имеется ряд доказательств, строго подтверждающих, что они играют важные роли в сборке центромерного гетерохроматина, который помогает создавать тесное соединение во время митозов, и в ориентации сестринских кинетохор, что позволяет правильно соединяться с веретеном (Fig. 3C-E).
Heterochromatin environment
Классические цитологические наблюдения подтверждают, что сестринские хроматиды наиболее тесно ассоциированы в гетерохроматиновых регионах (Gonzalez et al. 1991), это привело к предположению, что особая структура или состав гетерохроматина д. усиливать рекрутирование cohesin (Losada and Hirano 2001b). Фактически, было показано, что heterochromatin protein (HP)-l, гомолог Swi6, соединяется с метилированным Lys9 гистона H3 и способствует загрузке cohesin в центромерные повторы у S. pombe (Bernard et al. 2001; Nonaka et al. 2002). Более недавние исследования показали, что кухня RNA interference регулирует становление гетерохроматина, который в свою очередь рекрутирует cohesin в эту область, у S. pombe (Hall et al. 2003; Schramke and Allshire 2003) и в клетках позвоночных (Fukagawa et al. 2004). Интригующе, даже у S. cerevisiae, которые, по-видимому, лишены проксимального к центромерам гетерохроматина, функциональные центромеры индуцируют повышенные ассоциации cohesin в окружающей области. распространяющейся на 20-50 kb (Weber et al. 2004). Это наблюдение указывает на существование дополнительных механизмов, гарантирующих более сильную слипчивость центромер.
Role of Sgo/Mei-S332 in centromeric cohesion: protection or active reconstruction?
Самостоятельная регуляция слипчивости плеч и центромер даже более критическая в мейозе, чем в митозе. В мейозе слипчивость плеч устраняется в анафазе I, тогда как центромерная слипчивость персистирует вплоть до метафазы II (Nasmyth 2001). В отличие от митозов обе ступени устранения слипчивости в мейозе связаны с separase-обусловленным расщеплением cohesin, но остается один и тот же вопрос в обоих случаях: что защищает центромерный cohesin, когда исчезает слипчивость плеч? Исследования на Drosophila идентифицировали центромерный белок, известный как Mei-S332, который может осуществлять эту работу (Kerrebrock et al. 1995). Недавно в исследованиях на S. pombe и S. cerevisiae были повторно открыты белки, родственные Mei-S332, приведшие к вычленению семейства белков shugoshin (или Sgo) (Katis et al. 2004; Kitaiima et al. 2004; Marston et al. 2004; Rabitsch et al. 2004). Хотя вклад белков Sgo/Mei-S332 в сегрегацию митотических хромосом скромен у Drosophila или дрожжей, но истощение Sgol, одному из двух членов этого семейства у человека, в клетках HeLa вызывает преждевременное разделение сестринских хроматид во время митозов (Salic et al. 2004; Tang et al. 2004; Kitajima et al. 2005). Этот феномен частично супрессируется, когда слипчивость усиливается за счет экспрессии не способной к фосфорилированию формы субъединицы cohesin SA2 (McGuiness et al. 2005), это согласуется с моделью, согласно которой Sgol защищает центромерный cohesin от высвобождения в профазе (Fig. 5A). Белок checkpoint веретена Bublрегулирует локализацию Sgol на центромерах, а в его отсутствие, Sgol и Sccl не встречаются больше в большом количестве в этой области и вместо этого локализуются вдоль хромосомных плеч (Kitajima et al. 2005). В результате хромосомы обладают менее разделенными плечами сестринских хроматид и не имеют четких первичных сужений, морфология, наблюдаемая также в клетках, лишенных функции polo или aurora B (Gimenez-Abian et al. 2004; Ono et al. 2004; Hauf et al. 2005). Исчезновение первичного сужения может быть результатом отсутствия накопления cohesin в центромерах (Gimenez-Abian et al. 2004). Т.о., Buhl, polo и aurora B могут быть частью сети, которая регулирует локализацию и/или функцию Sgol, который в свою очередь управляет перераспределением cohesin, или даеж его de novo загрузкой на центромеры в профазе. В этом сценарии Sgol может выступать не только протектором, но и играть более активную роль в возникновении центромерной слипчивости во время митозов (Fig. 5B).
Слипчивость центромер противостоит отталкивающим силам от микротрубочек веретена и создает натяжение между сестринскими кинетохорами. Это натяжение в свою очередь стабилизирует соединения микротрубочки-кинетохоры с помощью механизма, который использует aurora B (rev. Hauf and Watan-abe 2004). Соответственно, истощение cohesin вызывает не только преждевременное разделение, но и также дефекты в выстраивании хромосом, которое сопровождается неправильным расположением хромосомного passenger комплекса, содержащего aurora B (Sonoda et al. 2001; Vass et al. 2003). Имеются также доказательства, что Sgo может взаимодействовать непосредственно с микротрубочками (Salic et al. 2004) и может действовать как сенсор, который отслеживает натяжение, накладываемое на сестринские центромеры (Indjeian et al. 2005). Нет сомнений, что будущий анализ поможет открыть механистическое общение между слипчивостью центромер и передачей сигналов checkpoint веретена.
Role of condensins in kinetochore orientation
Функция сondensin важна также для установления ориентации спина-к-спине сестринских кинетохор. Тяжелые дефекты во взаимодействиях кинетохоры-микротрубочки указывают на merotelic соединения, обнаруживаемые после истощения condensin в яйцевых экстрактах
Xenopus (Wignall et al. 2003), в клетках HeLa (Ono et al. 2004) и более значительные у
C. elegans (Hagstrom et al. 2002; Stear and Roth 20021. В голоцентрических хромосомах
C. elegens многочисленные кинетохоры собираются вдоль всей длины каждой из хроматид, формируя две "лини" на наружной поверхности метафазной хромосомы. Этот процесс обозначается как вычленение сестринских хроматид, он нуждается в condensin II, чья локализация в центромерах зависит от кинетохорного белка HCP-4/CENP-C (Moore et al. 2005) и aurora B (Hagstrom et al. 2002). В клетках человека субпопуляция condensin II усилена на или вблизи внутренней кинетохорной пластинки (Ono et al. 2004). Это обогащение, но не распределение condensin II вдоль плеч, находится под контролем aurora B. T.о., aurora B скорее всего вносит вклад би-ориентацию хромосом на множественных уровнях, которые включают специфическую поставку condensins на centromere/kinetochore область.
Separating sister chromatids in anaphase
Финальное устранение слипчивости происходит в анафазе, как только все хромосомы оказываются соответственно би-ориентироваными в метафазной пластинке, что удостоверяется checkpoint веретена. После активации anaphase-promoting complex or cyclosome (APC/C), cysteine protease separase освобождается от sccurin и расщепляет Sccl, запуская тем самым разделение сестринских хроматид (Fig. 3F; Uhlmann et al. 1999). Фосфорилирование Sccl с помощью polo облегчает его расщепление с помощью separase in vitro, но эта модификация может быть несущественной in vivo (Alexandru et al. 2001; Hornig and Uhlmann 2004; Hauf et al. 2005). Т.к. предполагаемый протектор центромерного слипания, Sgol's функция, также может быть инактивирована или негативно регулироваться в начале анафазы. Фактически, Sgol является субстратом для APC/C у позвоночных (Salic et al. 2004), но точное время или функциональное значение его деградации ещё предстоит определить. У Drosophila устранение Sgo/Mei-S332 с центромер в анафазе нуждается в двух разных путях: один использует функцию separase (Lee et al. 2004), а др. использует фосфорилирование с помощью polo (Clarke et al. 2005). Однако, мутанты polo способны разделять свои хромосомы несмотря на сохранение Mei-S332 на центромерах, следовательно, постулированная инактивация этого белка не нужна ни для его устранения с центромер, ни для его деградации.
Согласно слишком упрощенному мнению, преобладавшему в ранних исследованиях, слипчивость плеч полностью исчезает в метафазе. тогда как слипчивость центромер исчезает в начале анафазы (e.g., Waizencgger et al. 2000). Это не столь очевидно в ненарушенных митозах: слипчивость плеч теряется постепенно в анафазе после того как сестринские центромеры разделяются и сестринские хроматиды движутся к противоположным полюсам клетки (Gimenez-Abian et al. 2004; Paliulis and Nicklas 2004). Подтвержено, что определенные домены хромосом разделяются на более поздних стадиях в анафазе, возможно посредством уникальных механизмов. Напр., сегрегация rDNA у
S. cerevisiae происходит в средине анафазы и нуждается в Cdcl4, протеин фосфатазе, которая активируется с помощью FEAR (fourteen early anaphase release) сети (D'Amours et al. 2004; Sullivan et al. 2004; Wang et al. 2004). Condensin рекрутируется на локус rDNA в анафазе in a Cdc14-зависимым образом и обеспечивает конденсацию и вычленение rDNA на этой стадии (Lavoie et al. 2004). Дефекты расхождения, наблюдаемые у
cdcl4 мутантов, не вызываются инактивацией cohesin, это указывает на то, что существуют самостоятельные формы сцепления в этом локусе. В клетках млекопитающих разделение сестринских теломер может использовать др. механизм, с участием tankyrase 1, теломерного белка, который обладает poly(ADP-ribose) polymerase мотивом (Dynek and Smith 2004). В этом случае ещё предстоит установить, является ли сохраняющееся сцепление теломер в tankyrase 1-дефицитных клетках независимым от cohesin.
Cohesin and condensins in meiotic chromosome segregation
В мейозе два последовательных события расхождения хромосом сопровождают единственный раунд репликации ДНК. Гомологичные хромосомы разделяются в мейозе I, тогда как сестринские хроматиды разделяются в мейозе II. Этот факт выставляет специфические потребности по регуляции cohesion и скорее всего говорит о появлении мейоз-специфических изоформ субъединиц cohesin Sccl (известной как Rec8), Scc3/SA и даже SMC1 (see Table 1). В мейозе S. pombe Rec8 формирует два разных комплекса: один содержит Scc3 (обозначается как Psc3 у этого организма) локализующийся вблизи центромер, тогда как др. содержит мейоз-специфичную версию Scc3 (известна как Recll), обнаруживаемую вдоль плеч (Kitajima et al. 2003). Т.о., мейотические изоформы могут вносить вклад в дифференциальную чувствительность cohesin комплекса к расщеплению с помощью separase в мейозе I. Дополнительные мейоз-специфические функции предполагаются для мейотических cohesins; напр, они могут предпочитать инвазию между гомологами инвазии сестринских хроматид, облегчая тем самым формирование хиазм (Martston and Amon 2004). Млекопитающие имеют мейоз-специфичную изоформу SMC1, известную как SMClβ (Table 1). У мышей cohesin complex(es), содержащие канонический SMC1 (SMClα) скорее всего ответственны за установление слипчивости в премейотической S фазе, в то время как Smciβ обнаруживается на хромосомах только после зиготены. Smciβ-дефицитные мыши обоих полов стерильны, обнаруживают дефекты в синапсах, рекомбинации и сохранении слипчивости как хромосомных плеч, так и центромер (Revenkova et al. 2004). Rec8 был также обнаружен на осевых элементах синаптонемального комплекса (SC) в сперматоцитах крыс прежде чем SMC1β и SMC3, это указывает на то, что стержневая и регуляторные субъединицы комплекса могут быть поставляемы на хромосомы отдельно (Eijpe et al. 2003). Подтверждение этой идеи получено в наблюдении, что потеря функции TIM-1 у C. elegans предотвращает локализацию Rec8, но не SMC1 и SMC3, на мейотических профазных хромосомах (Chan et al. 2003). Дальнейший анализ позволит определить точную динамику разных cohesin комплексов, сосуществующих в мейотических клетках и их специфические вклады в функции мейотических хромосом (e.g., Parra etal. 2004).
Condensin субъединицы также играют критические роли в структурной и функциональной организации мейотических хромосом. У
S. cercvisiae condensin субъединицы локализуются на осевой сердцевине пахитенных хромосом и вносят вклад в их аксиальную компакцию и инидивидуализацию (Yu and Koshland 2003). SC собственно не собирается у condensin мутантов, приводя к дефектам в гомологичном спаривании и в процессинге double-strand breaks (DSBs). Имеются также доказательства, что condensin участвует в разрешении зависимого от рекомбинации сцепления между гомологами в мейозе I и вообще в сегрегации сестринских хроматид в мейозе II тоже (Yu and Koshland 2003). Потребность в функции condensin в мейозе I и II согласуется с результатами на
Arabidopsis (Siddiqui et al. 2003) b
C. elegans (Chan et al. 2004). В отличие от
S. cerevisiae, condensin субъединцы ассоциируют с хромосомами только после выхода из пахитены у
C. elegans. Это различие может быть связано с тем фактом, что
S. cerevisiae и C. elegans содержат только condensin I или condensin II, соотв. Однако, не-SMC компоненты комплекса дозовой компенсации у
C. elegans также необходимы для мейотической (но не митотической) сегрегации хромосом (Lieb et al. 1996), что создает дополнительный уровень сложности для этой проблемы. Предстоит ещё выяснить, напр., существуют ли специфичные для мейоза субъединицы condensin? Локализуются ли у позвоночных и растений condensins I и II дифференциально на мейотических хромосомах и выполняют ли они не перекрывающиеся функции в отношении рекомбинации и сегрегации?
Expanding roles of cohesin and condensins outside chromosome segregation
Cohesin and DNA repair
В поздней S и G2 фазах, когда две сестринские хроматиды доступны, клетки предпочитают репарировать DSBs с помощью homologous recombination (HR). результаты исследований на дрожжах (Birkenbihl and Subramani 1992; Sjogren and Nasmyth 2001) и клетках позвоночных (Sonoda et al. 2001) подтверждают, что репарация DSB нарушена в отсутствие cohesin. Было также показано, что cohesin накапливается в местах индуцированных лазером повреждений ДНК Mrell/Rad50-зависимым образом в клетках млекопитающих (J.S. Kim et al. 2002). Два недавних исследования на S. cerevisiae уточнили эту идею, выяснив, что субъединицы cohesin рекрутируются в область ~100 kb, окружающую одиночный DSB (Strom et al. 2004; Unal et al. 2004). Это вызванное DSB рекрутирование cohesin является зависимым от Scc2 и нуждается в фосфорилировании H2AX с помощью checkpoint ДНК повреждений киназ Mecl/ATM и Tell/ATR (Unal et al. 2004). Важно, что cohesin, загруженный в ответ на DSBs устанавливает de novo сцепление между поврежденной хроматидой и и её неповрежденной сестринской хроматидой, облегчая тем самым репарацию DSB (Strom et al. 2004). Такое "избыточное" количество cohesin д.быть удалено, чтобы закончить процесс репарации, возможно посредством separase-зависимого механизма (Nagao et al. 2004). В клетках млекопитающих SMC1 фосфорилируется с помощью ATM в ответ на ионизирующее облучение (IR) (S.-T. Kim et al. 2002; Yazdi et al. 2002). Мышиные клетки, экспрессирующие неспособную к фосфорилированию форму SMC1, обнаруживают пониженную жизнеспособность только после повреждений ДНК, подтверждая, что эта модификация cohesin необходима для её роли в репарации ДНК, но не существенна для слипчивости (Kitagawa et al. 2004). Тем не менее возможно, что слипчивость может рутинно усиливаться во время или после S фазы благодаря этому DSB-индуцированному механизму загрузки, т.к. DSBs могут возникать естественным образом во время репликации ДНК. Более того, если повторяющиеся последовательности гетерохроматина более склонны к остановившимся вилкам и DSBs, чем к одно-копийным последовательностям эухроматина, то DSB-индуцированная загрузка cohesin д. предоставлять способ генерации более высокой плотности cohesin в гетерохроматине. Во всяком случае, эти новые исследования вносят свежий взгляд на загрузку и действие cohesin.
Cohesin regulators and development
Снижение дозы Scc2, ортолога Nipped-B, негативно влияет на активацию гомеозисного гена cut посредством удаленного экхансера у Drosophila (Rollins et al. 1999). Наблюдение, что Nipped-B и cohesin оказывают противоположные эффекты на эту дальнодействующую регуляцию, подтверждает модель, что Scc2/Nipped-B действует как загрузчик, так и разгрузчик cohesin, и тем самым облегчает энхансер-промотор коммуникации (Rollins et al. 2004). Определенные онтогенетические гены могут быть особенно чувствительны к присутствию cohesin вблизи своих промоторов и тем самым редуцируют уровни Scc2. Это может объяснить, почему мутации одной копии Nipped-B like [NIPBL] гена человека вызывают синдром Cornelia de Lange, нарушение развития, характеризующееся задержкой роста и познавательной способности (Krantz et al. 2004; Tonkin et al. 2004). Остается определить, однако, в самом ли деле эти онтогенетические дефекты возникают в результате неправильной регуляции cohesin или возможно Scc2 может обладать cohesin-независимой функцией, которая и влияет на динамику др. транскрипционных регуляторов. Интересно, что в недавнем исследовании было показано, что мутации в ESC02, гене, кодирующем один из гомологов Ecol/Ctf7 у человека, вызывает Roberts syndrome, рецессивное нарушение, также характеризующееся задержкой роста и черепно-лицевыми аномалиями. В данном случае дефекты слипчивости центромер наблюдались в хромосомах затронутых индивидов (Vega et al. 2005).
Condensins, checkpoint responses, and gene repression
Потенциальное участие condensin в checkpoint повреждений ДНК было предположено в генетическом исследовании
S. pombe, которое показало, что мутантный condensin не способен активировать checkpoint kinase Cdsl/Chkl в присутствии hydroxyurea (Aono et al. 2002). Однако, молекулярный механизм лежащий в основе этого наблюдения остается неизвестным. Роль condensin субъединиц в транскрипционной репрессии описана у
S. cerevisiae (Bhalla et al. 2002; Machin'et al. 2004) и
Drosophila (Lupo et al. 2001; Dej et al. 2004; Jager et al. 20051. У
Arabidopsis, редукция экспрессии SMC2 вызывает дефекты в развитии семян или меристемы (Liu et al. 2002; Siddiqui et al. 2003). Хотя глобальные дефекты в структуре хроматина, особенно в гетерохроматине или повторяющихся последовательностях генома, могут быть достаточны для объяснения этих разнообразных фенотипов, более специфическое вовлечение condensin субъединиц в транскрипционную регуляцию нельзя исключить. Напр., сообщалось, что субтракция condensin может взаимодействовать с эпигенетической кухней, такой как DNA methyl-transferase в клетках млекопитающих (Geiman et al. 2004). У
C. elegans, специализированный condensin-подобный комплекс, как известно, действует как главный регулятор дозовой компенсации (rev. Hagstrom and Meyer 2003). Особенно интересно бы определить механизм. с помощью которого этот dosage compensation complex (DCC) реконфигурирует Х хромосому, чтобы ограничить вдвое (и только вдвое) экспрессию генов по всей хромосоме. Дальнейший анализ этой системы может помочь выявить потенциальное участие канонических condensins в репрессии митотических генов и определить, как некоторые гены могут частично избегать такой репрессии (Xing et al. 2005).
The third man: linkers for DNA repair composed of SMC5 and SMC6
Эукариоты имеют третий SMC комплекс. который состоит из SMC5-SMC6 гетеродимера и 4 не-SMC субъединиц, Nse1-Nse4 (Table 1, McDonald et al. 2003; Har-very et al. 2004; Morikawa et al. 2004; Sergeant et al. 2005). Клеточная функция этого комплекса понятна не до конца, но она связана с реакцией на повреждения ДНК. Фактически ген, кодирующий SMC6/Radl8 был первоначально идентифицирован при генетическом скрининге радиочувствительных мутантов у S. pombe (Lehmann et al. 1995). Генетические исследования показали, что гипоморфные мутации в др. субъединицах комплекса также вызывают гиперчувствительность к повреждениям ДНК (e.g., McDonald et al. 2003), и это подтверждает роль комплекса в HR-обеспечиваемой репарации, а также в мейозе (Morikawa et al. 2004; Pe-bemard et al. 2004). Установление G2 checkpoint после облучения кажется нормальным у smc6/radl8 мутантных клеток, но они выходят из под ареста не репарировав повреждения ДНК (Harvery et al. 2004). T.о., накопление не репарированных повреждений ДНК после множественных раундов делений могут объяснить клеточную летальность, наблюдаемую у этих мутантов (Lehmann 2005). Недавно описана специфическая роль SMC5 и SMC6 в сегрегации повторяющихся регионов хромосом (Torres-Rosell et al. 2005).
Несмотря на многочисленные генетические исследования у дрожжей биохимическая характеристика комплекса SMC5-SMC6 только начинается (Sergeant et al. 2005). У S. pombe, SMC5 b SMC6 димеризуются посредством своих шарнирных доменов, подобно др. SMC белкам. Nse2 соединяется со сверхскрученным доменом SMC5, который в свою очередь рекрутирует субкомплекс из Nscl, Nse3 и Nse4/Rad62, скорее всего посредством Nsc2-Nse3 взаимодействия (Fig. IB, panel d). Важно отметить. что предполагаемая архитектура SMC5-SMC6 комплекса отличается существенно от таковой в cohesin и condensins (Fig. IB, panels a-c). У S. cerevisiae, две дополнительные субъединицы (YML023C и Kre29) были идентифицированы в том же самом комплексе (Zhao and Blobel 2005) или во вторичном комплексе, содержащем SMC5 и SMC6 (Table 1; Hazbun et al. 2003).
Первичная структура не-SMC субъединиц SMC5-SMC6 комплекса представляет важные указания на их возможную функцию. Nsel содержит RING-finger мотив, который законсервирован в E3 ubiquitin ligases (Fujioka et al. 2002; McDonald et al. 2003). Nse2 содержит др. RING-finger мотив, характерный для SUMO ligases, и способна sumoylate
in vitro некоторые субъединицы комплекса. включая SMC6 (Andrews et al. 2005). Мутация в RING-finger мотиве устраняет
in vitro sumoylation активность и снижает уровень SMC6 sumoylation
in vivo. Эти мутантные клетки чувствительные к ДНК повреждающим агентам, но жизнеспособны, указывая тем самым, что sumoylation активность SMC5-SMC6 комплекса важна для его функции по репарации ДНК, но не является критической для его существенной функции. Более того, мутация в SUMO ligase домене
S. cerevisiae Nse2/Mms21 ведет к формированию нерегулярных ядрышек и дефектов в функции теломер (Zhao and Blobel 2005). Этот фенотип может быть результатом дефектной sumoylation белков вне комплекса SMC5-SMC6, участвующей в поддержании структуры ядрышков и теломер. Альтернативно, комплекс SMC5-SMC6 может играть роль в предупреждении разнородной рекомбинации между повторяющимися последовательностями, так что области, содержащие повторы ДНК, такие как рДНК или теломеры, д.быть особенно чувствительны к потере его функции. По крайней мере, два др. SMC-родственных комплекса, cohesin и Rad50-содержащий комплекс MRX, играет роль в рекомбинационной репарации. Почему клетки нуждаются во столь многих "сходных" комплексах для выполнения одной и той же работы?
Bacterial SMC linkers
Recent technical improvements in cell imaging combined with powerful bacterial genetics have uncovered a number of similarities in the chromosome segregation machineries of bacteria and eukaryotes (for review, see Sherratt 2003). The appreciation of SMC proteins as major chromosome organizers from bacteria to humans is one of the best examples. Disruption of the smc gene in Bacillus subtilis causes decondensation and mis-segregation of chromosomes (e.g., Britton et al. 1998), indicating that the bacterial SMC protein shares related, if not identical, functions with the eukaryotic SMC complexes in vivo. More recent studies show that the bacterial SMC dimer forms a complex with two regulatory subunits called Sep A and ScpB (Fig. IB, panel e; Mascarenhas et al. 2002; Soppa et al. 2002; Volkov et al. 2003; Hirano and Hirano 2004). ScpA belongs to the kleisin superfamily, further extending the similarity between bacterial and eukaryotic SMC complexes (Schleiffer et al. 2003). It is most likely that the SMC-ScpA-ScpB complex contributes to chromosome segregation by "pulling" duplicated DNA strands to opposite poles of the cell using a mechanism that may involve DNA supercoiling (Lindow et al, 2002a). These results imply that the bacterial SMC complex may be much closer to condensins than cohesin. Nevertheless, evidence is also available that B. subtilis-SMC (or its distant relative MukB in E. coli] may have cohesin-like functions such as keeping together the newly replicated sister DNAs tSunako et al. 2001; Lindow et al. 2002b) or promoting DNA repair (Dervyn et al. 2004). From an evolutionary point of view, bacterial SMC. proteins belong to the main branch of the SMC family that includes SMC1, SMC2, SMC3, and SMC4 but not SMC5 or SMC6 (Cobbe and Heck 2004). Thus, the bacterial SMC could be the common ancestor of condensins and cohesin. Further analysis of these primitive forms of SMC protein complex will continue to make great contributions to- our understanding of the basic mechanisms of SMC action as well as the evolution of the SMC-mediated segregation machinery.
Future directions
A decade has parsed since the first set of research papers reported the identification of SMC proteins and their crucial involvement in higher-order chromosome organization and segregation. Subsequent work has extended our knowledge about their fundamental roles in many aspects of chromosome functions and revealed the essential features of their unique architecture. What might be the major challenges in the coming years? First, we are only beginning to get a glimpse of the mechanism of action of SMC protein complexes. We wish to know, for example, whether a single cohesin complex is indeed able to hold two sister chromatids within its coiled-coil space, and how the postulated enzymatic and structural functions of condensins might be coordinated and coupled to their ATPase cycle. Second, a genome-wide mapping of preferred binding sites of these complexes, as has been initiated in yeast, must be applied to more complex genomes including that of humans. Advanced imaging approaches should complement such efforts to decipher the dynamics of cohesin and condensins during the cell cycle or other events such as DNA repair. Third, it has become increasingly clear that analyses of SMC proteins in a variety of systems create a fertile playground for exploring the common themes and variations in chromosome architecture and dynamics. It will continue to be important to compare and contrast monocen-tric and holocentric chromosomes, mitosis and meiosis, and the eukaryotic and bacterial systems. Other critical questions to be addressed include the potential crosstalk of SMC proteins with the epigenetic machinery, and the essential function of the SMC5-SMC6 complex in maintaining genome stability. There is no doubt that answering these questions will not only advance our understanding of chromosome biology but will also have a great impact on other areas such as cancer biology, genome biology, and evolutionary biology.
Сайт создан в системе
uCoz
