Главной темой биологии развития, которая возникла в последние 20 лет, является вопрос, как осуществляется контроль генов в онтогенезе, сильно законсервированный в ходе эволюции. Гены, с критическими ролями во время развития у Drosophila, часто выполняют важные роли и во время развития позвоночных, даже если онтогенетические механизмы существенно дивергировали у этих организмов. Семейство генов Zic у позвоночных тому пример. Члены семейства генов Zic являются у позвоночных гомологами Drosophila odd-paired (OPA) гена (1). У Drosophila, OPA является существенным для подразделения на парасегменты раннего эмбриона дрозофилы (2). Хотя не существует сравнимого процесса в развитии позвоночных, но у мышей Zic гены, как было установлено, существенны для широкого круга онтогенетических программ, включая развитие нервной системы, мышц и скелета. и установление лево-правосторонней асимметрии у ранних эмбрионов (3-7). Не удивительно, что мутации членов семейства ZIC также лежат в основе многих клинически важных врожденных аномалий у людей (8-10).

Существует 5 Zic генов у людей и мышей. Т.к. является широко распространенными для многих генов позвоночных события геномных удвоений в ходе эволюционной истории, поэтому один ген OPA у дрозофилы имеет у них множественных гомологов. Название ''Zic'' происходит от zinc fingers в мозжечке, характеризующих экспрессию в мозжечке всех 5 Zic генов у взрослых мышей. Каждый из генов Zic кодирует транскрипционный фактор с цинковыми пальчиками, каждый состоит из 5 Cys2His2 zinc-finger доменов. Домены zinc-finger генов Zic обнаруживают наивысшую гомологию последовательностей с Drosophila OPA, хотя они обладают также общими последовательностями с Gli1 и Gli3 млекопитающих и Drosophila cubitus interuptus, а также с C. elegans Tra1 (1). Первый Zic1 был клонирован Aruga et al. при скрининге кДНК, богатой в мозжечке (11). Zic2, Zic3, Zic4, и Zic5 были последовательно идентифицированы при low stringency скрининге библиотеки кДНК мозжечка с использованием Zic1 кДНК в качестве зонда (1, 12, 13).

Все 5 Zic гена имеют трех-экзонную структуру с доменами zinc-finger, кодирующими C-терминальную половину каждого гена. Первая intron-exon граница законсервирована у всех 5 генов, тогда как вторая intron-exon граница законсервирована у Zic1, Zic2, и Zic3, но не у Zic4 или Zic5, указывая тем самым, что последние два гена наиболее дивергентны. Геномная организация Zic генов в геноме мышей и человека также сходна (Fig. 1). Zic1 и Zic4 тесно сцеплены на хромосоме 3 человека (хромосома 9 у мышей) и транскрибируются в противоположных направлениях



Fig. 1. Comparison of the genomic organization of the human ZIC genes - ZIC1 and ZIC4 are tightly linked on human chromosome 3 and are transcribed in opposite directions with about 15Kb of intergenic sequence separating them. Co-deletion of ZIC1 and ZIC4 is involved in Dandy-Walker malformation (DWM). ZIC2 and ZIC5 are similarly located in a paired configuration on human chromosome 13. Mutations in ZIC2 cause holopresencephally (HPE). No human ZIC5 mutations have yet been described. ZIC3 is unpaired and located on the X chromosome. Mutations at the ZIC3 locus cause heterotaxy. The unfilled boxes represent the untranslated regions with arrows indicating the origin and direction of translation. Filled black boxes represent 50-and 30 coding regions, filled gray boxes represent zinc finger domains two through five and the unique first zinc-finger of each gene is shown as a patterned gray region.

примерно с 15Kb межгенной последовательностью, их разделяющей. Сходным образом, Zic2 и Zic5 располагаются парной конфигурации на хромосоме 13 человека и хромосоме 14 мыши, подтверждая геномные дупликации родоначального генного комплекса. Zic3 не имеет пары и локализован на X хромосоме у обоих видов.

Между членами семейства, zinc-finger доменов 2-5 имеется существенное сходство аминокислот. Напротив, первый zinc-finger наиболее отличающийся и уникальный у каждого члена (Fig. 2). N-терминальная и C- терминальная кодирующие области вне доменов цинковые пальчики также уникальны для каждого члена семейства. Существует широкое разнообразие врожденных дефектов у человека, ассоциированных с гетерозиготными мутациями в генах, членах семейства ZIC. Тщательный анализ Zic мутантных мышей привел к пониманию онтогенетических основ этих нарушений. Хотя у взрослых экспрессия генов Zic ограничена мозжечком, у эмбрионов Zic гены обнаруживают динамические паттерны экспрессии (4, 8, 14). Все Zic гены ко-экспрессируются в дорсальной срединной линии эмбриона в самостоятельных, но существенно перекрывающихся, доменах. Кроме того, каждый член имеет уникальные домены экспрессии вне ЦНС, включая развивающиеся сомиты, конечности и глаза. Получены мутации в каждом из Zic генов у мышей с использованием gene-targeting технологий (4, 6-8, 15). Кроме того, описан гипоморфный enu-индуцированный аллель Zic2, названный kumba (5). Также существует спонтанная мышиная мутация, Bent tail, вызванная делецией в Zic3 (16, 17). Фенотипический анализ этих мутантов показал, что несмотря на их существенную ко-экспрессию, эти гены не обнаруживают существенного функционального перекрывания. В частности, внутри их общих доменов экспрессии в ЦНС каждый Zic ген дает разные фенотипы, когда мутантен - в пределах от гипоплазии мозжечка до holoprosencephaly (HPE), до дефектов закрытия нервной трубки. Во многих случаях даже гетерозиготная потеря функции гена у мышей имеет серьезные фенотипические последствия, указывающие на то, что доза гена является критической для нормального развития (8, 18). Здесь мы рассмотрим клинические находки у людей, ассоциированные с мутациями ZIC и родственные аномалии у мышей.

Недавно мы продемонстрировали, что гетерозиготные делеции в ZIC1 и ZIC4 участвуют в Dandy-Walker malformation (DWM) (8). DWM является одной из наиболее широко распространенных врожденных аномалий мозжечка, затрагивающей примерно 1/5000 новорожденных (19). DWM идентифицируется с помощью brain-imaging исследований, таких как MRI и определяется по гипоплазии и ротации вверх vermis мозжечка, сопровождаемых retrocerebellar кистой, которая сообщается с четвертым желудочком (20-22). Полушария мозжечка в основном не затронуты. DWM пациенты обычно представлены в раннем детстве с широким спектром клинических проявлений в пределах от нормального развития до умственной отсталости с моторной и/или глобальной задержкой развития. В большинстве случаев DWM является изолированной ЦНС находкой. Однако, иногда она сопровождается гидроцефалией, повышенным внутричерепным давлением и еще реже частичным или полным агенезом corpus callosum (23). DWM является генетически гетерогенным нарушением и, хотя, несколько локусов вовлечено в DWM, т.к. в отдельных случаях обнаруживались крупные делеции и дупликации, и до недавнего времени не были известны



Fig. 2. Percent identity of zinc-finger domains in the Human ZIC proteins as compared with Drosophila OPA. Percent identity is noted by total amino acid identity across all five zinc fingers over the percent identity of amino acids in zinc fingers two through five. Zinc-finger domains two through five share significant amino-acid identity and are highly conserved across species and between family members. In contrast, the first zincfinger is more divergent and unique to each member.

специфические гены, вызывающие это нарушение (24). Риск повторного возникновения не синдромальной DWM оценивается приблизительно в 1-2%(25) и указывает на то, что простое Менделевское наследование вряд ли возможно. Более реалистичной является полигенная модель, когда несколько генов предопределяют исход. Недавно мы картировали de novo интерстициальную делецию хромосомы 3q2 у 8 пациентов с DWM (8). Этот анализ выявил область в 1.9-Mb минимального перекрывания в 3q24-25.1, которая делетирована у всех этих пациентов. Непосредственно проксимальнее на 250Kb от этой области расположены гены ZIC1 и ZIC4, экспрессирующиеся на высоком уровне развивающегося мозжечка и делетированные у всех, кроме одного пациента. Функция гена Zic1 интенсивно изучалась у мышей. Гомозиготная делеция Zic1 у мышей ведет к гипоплазии мозжечка и к дефектам слоистости (foliation). Кроме того, гранулярные клетки мозжечка уменьшены в числе, а созревание клеток Пуркинье задержано (15). Избыточная экспрессия Zic1 в развивающемся спинном мозге мышей и кур приводит к снижению нейрональной дифференцировки и соотв. к большей экспансии нейральных предшественников (26). Всё это указывает на то, что Zic1 поддерживает гранулярные клетки мозжечка в состоянии предшественников и что потеря Zic1 ведет к гипоплазии из-за ранней дифференцировки этих предшественников.

На базе этой известной роли Zic1 у мышей и нашего наблюдения, что Zic4 также экспрессируется в развивающемся мозжечке, мы высказали гипотезу, что гетерозиготная делеция этих двух родственных генов у людей достаточна. чтобы вызвать DWM у пациентов с 3q2 делецией. Чтобы проверить эту гипотезу мы получали Zic4 гетерозиготных мутантных мышей, а также мышей с одновременной делецией Zic1 и Zic4 (8). 15% этих двойных гетерозиготных мышей имели тяжелую гипоплазию vermis мозжечка и дефекты foliation, которые никогда не обнаруживались у Zic4 или Zic1 гетерозиготных мышей в отдельности. Как и у пациентов с DWM полушария мозжечка у таких мышей оставались относительно незатронутыми. Эти данные подтверждают, что гетерозиготные делеции ZIC1 и ZIC4 в самом деле ответственны за мозжечковый фенотип, наблюдаемый у пациентов с делецией 3q. Тот факт, что не все double-гетерозиготные мыши имеют мозжечковый фенотип указывает на то, что как и у людей у мышей локусы модификаторы предопределяют тяжесть фенотипа. Сейчас проводятся дополнительные исследования для определения пропорции людей DWM, которым может быть приписана потеря этих двух генов.

Хотя все гены ZIC экспрессируются во взрослом мозжечке, у людей мутации в генах этого семейства ассоциированы не только с аномалиями мозжечка. Напр., мутации ZIC2 объясняют небольшой процент HPE, довольно широко распространенной врожденной аномалии переднего мозга (10). HPE возникает 1:16000 живых новорожденных (27), с частотой 1 на 250 эмбрионов (28). Величина эмбриональной смертности подчеркивает тяжесть этого нарушения. Фенотипический спектр HPE варьирует в пределах от тяжелой alobar HPE, при которой два полушария мозга не разделяются и присутствует небольшой головной мозг только с одним желудочком, до lobar HPE, при которой два самостоятельных полушария присутствуют, но соединяющая структура, corpus callosum, отсутствует, также меньше и др. структур ЦНС; с semilobar HPE, вклинивающейся иногда между ними (29). Лицевые дисморфии также изменчивый признак HPE, варьирующий от циклопии до нормально развитого лица (30).

Подобно DWM, HPE высоко гетерогенна и ассоциирует со многими цитогенетическими локусами (31, 32). Хотя описаны случаи наследственно HPE, которые обнаруживают аутосомно рецессивный, доминантный и X-сцепленное наследование, но большинство HPE является спорадическим (33). Интересно, что описаны клинически нормальные облигатные носители в семьях с аутосомно доминантной формой HPE, указывающие на то, что множественные гены и вообще ген-среда взаимодействия играют роль в развитии этого нарушения. Первая информация о генетической этиологии HPE получена при цитогенетическом картировании хромосомных перестроек для определения критического интервала, который оказался рядом с геном Sonic Hedgehog (SHH) на хромосоме 7q (34). Последующее секвенирование пациентов с семейной формой этого нарушения показало, что мутации в гене SHH ответственны за примерно четверть аутосомно доминантной формы HPE (35).

Вскоре после сообщения об участии SHH в HPE, был картирован второй генетический локус при анализе 17 гетерозиготных делеций на длинном плече хромосомы 13 у пациентов с или без нарушений головного мозга. В этом исследовании была установлена в 1-Mb критическая область для развития HPE (10). Дальнейший анализ сузил эту область до минимального региона в 300Kb, соответствующего открытой рамке считывания ZIC2. Анализ последовательностей ZIC2 у HPE пациентов с и без цитогенетических находок подтвердил роль гетерозиготных мутаций в ZIC2 для 3-4% пациентов с HPE. Эти мутации распадались на разные категории, включая nonsense, frameshift, missense и polyalanine expansion, без видимой фенотип-генотип корреляции (36).

В большой фракции мышей с пониженной экспрессией Zic2 кора головного мозга полностью неспособна разделиться на два полушария из-за неправильного образования дорсальной срединной линии (5). Эта недостаточность дорсальной срединной линии вторично приводит к агенезу corpus callosum и гипоплазии др. дорсальных структур переднего мозга. Помимо HPE фенотипа, Zic2 мутантные мыши обнаруживают также задержку нейруляции, приводящей в дефектам закрытия нервной трубки, затрагивающим как задние, так и передние сегменты, в результате возникает spina bifida и exencephaly/anencephaly, соотв. (6). Было предположено, что вариации в ZIC2 гене человека лежат в основе чувствительности к дефектам нервной трубки. Brown et al. (2002) (37) описали потенциальную ассоциацию с легкими альтерациями ZIC2, такими как histidine tract polymorphisms и дефекты нервной трубки. Эти исследования далеки от того, чтобы быть подтвержденными большими выборками, но результаты в самом деле интригующие.

Фенотипические эффекты генов семейства Zic ограничены не только ЦНС. Мутации в гене ZIC3 человека обусловливают heterotaxy в дополнение к дефектам нервной трубки (9, 38). Laterality дефекты, затрагивающие лево-правостороннюю асимметрию распадаются на несколько разных категорий. Позиционирование лево-правосторонней оси может быть рандомизировано в отношении индивидуальных органов, с учетом не-стереотипичного расположения лево-правосторонней оси (situs ambiguus) или оно может быть полностью обратным для всех органов (situs inversus) (39). Хотя полностью обратное положение органов не создает клинического риска для пациента, частичное обратное положение (situs ambiguus) обычно приводит в результате к болезненности и гибели и иногда сопровождается различными врожденными дефектами. В 1993, Casey et al. (40) описали анализ сцепления для локуса на Х хромосоме для situs abnormalities с некоторыми пороками сердца в большой семье. Эта область позднее была картирована более тщательно до региона в 1.3-Mb и была найдена субмикроскопическая делеция у неродственных лиц мужского пола (41). Та же группа затем позиционно клонировала ZIC3 из этой области и подтвердила его роль в situs abnormalities благодаря идентификации нескольких мутаций в случаях семейного и спорадического situs ambiguus (9). Т.к. Zic3 является Х-сцепленным у людей и мышей, то самцы, несущие Zic3 мутации часто более тяжело затрагиваются, чем самки с гетерозиготными мутациями. Мутации в ZIC3 также были найдены у пациентов с изолированными врожденными пороками сердца, это указывает на то, что эти дефекты являются результатом ошибок образования лево-правосторонней оси (38, 42).

Анализ мышиных моделей продемонстрировал, что Zic3 мутации вызывают laterality дефекты, т.к. Zic3 существенен для установления лево-правосторонней асимметрии у эмбрионов на очень ранних стадиях гаструляции (43). Билатеральная симметрия эмбрионов млекопитающих нарушается с помощью зависимой от ресничек передачи сигналов от эмбрионального узелка, midline-организующего центра во время гаструляции. Реснички на вентральной поверхности узелка движутся в направлении по часовой стрелке, создавая ток в левом направлении вне-эмбриональной жидкости, содержащей сигнальные молекулы, поперек срединной линии. Этот узелковый ток обусловливает в результате асимметричную экспрессию генов на разных сторонах узелка. Асимметричная лево-стронняя экспрессия nodal, члена семейства сигнальных молекул transforming growth factor β (TGF β), сопровождается лево-сторонней экспрессией nodal и др. генов соседней латеральной пластинки мезодермы (44). Zic3 экспрессируется симметрично в узелке и внури первичной полоски во время гаструляции. У Zic3 мутантов экспрессия nodal у узелке инициируется, но не поддерживается и поэтому последующая экспрессия nodal в латеральной пластинке мезодермы рандомизируется (7). Это указывает на то, что экспрессия Zic3 в срединной линии является критической для лево-правосторонней спецификации; однако, молекулярные и клеточные детали остаются неизвестными.

Zic3 нулевые мышиные эмбрионы имеют тяжелые врожденные дефекты сердца, а также situs abnormalities, что приводит к их гибели до рождения (7). Эти дефекты являются результатом аномального образования сердечной петли и расположения органа из-за неправильного формирования лево-правосторонней оси в раннем развитии. При рождении более чем у половины выживших Bent tail самцов мыши, которые являются результатом субмикроскопической делеции менее чем в 170Kb на Х хромосоме, включающей открытую рамку считывания Zic3 и более трети Bent tail самок обнаруживают situs ambiguus с рандомизированным положением органов (17). Кроме того, почти 12% Zic3 нулевых мышей имеют мышиный эквивалент anencephaly из-за дефектов закрытия в заднем мозге, а некоторые кроме того обнаруживают spina bifida, хотя и очень редко (7,16). Дефекты нервной трубки описаны также у Bent-tail мышей (16). Интересно отметить, что некоторые пациенты с мутациями ZIC3 были также описаны, как имеющие дефекты нервной трубки (9). Изменчивость в локусе ZIC3 может лежать в основе чувствительности к спорадическим дефектам нервной трубки, но это необходимо еще проверить. Гипоплазия мозжечка также описана у гемизиготных ZIC3 мутантных мужчин, хотя природа этого фенотипа неясна (9). Фенотип мозжечка у Zic3 мышей еще предстоит описать.

Пока не описаны мутации ZIC5 у людей. Потеря Zic5 у мышей вызывает многочисленные аномалии, включая дефекты нервной трубки и гипоплазию производных клеток цефалического нервного гребня, вызывающих черепно-лицевые аномалии (4). Приблизительно 15% Zic5 нулевых эмбрионов обнаруживают дефекты передней части нервной трубки, хотя не отмечалось spina bifida. ZIC5 может , т.о., также являться локусом чувствительности для дефектов нервной трубки у людей. Интересно отметить, что некоторые сообщения литературы намекают на возможную роль Zic5 и Zic2 взаимодействие в развитии мозжечка, т.к. пациенты с и без известных делеций 13q иногда имеют и HPE и DWM (45-48). Это привело к гипотезе, что потеря ZIC5 вместе с ZIC2 может давать DWM фенотип в дополнение к HPE, тогда как потеря ZIC2 вызывает только HPE.

Высокие уровни экспрессии ZIC1 гена были обнаружены в medulloblastoma, в наиболее частой раковой опухоли posterior fossa в педиатрии (49, 50). Это новообразование, как полагают, обусловливается фокальной избыточной пролиферацией мозжечковых наружных гранулярных клеток, нейрональных предшественников зрелых мозжечковых гранулярных клеток. Усиление активности Zic1 в этих опухолях, следовательно, может быть связано с его нормальной ролью в пролиферации предшественников гранулярных клеток. Недавно описано несколько случаев присутствия антител к ZIC белкам у пациентов с дегенерацией мозжечка, паранеопластическими нейрологическими нарушениями и мелкоклеточным раком легких (51-53). В большинстве из этих случаев, ZIC антитела присутствовали до диагноза опухоли, это привело авт. к предположению, что антитела к этим генам м.б. использованы для предсказания определенных новообразований.

ZIC gene family members clearly have interesting and physiologically relevant roles in both normal development and when mutated, in congenital malformations, and disease states. The spectrum of congenital malformations associated with mutations in these genes serves to emphasize just how widely ZIC genes have been recruited to direct various developmental programs during embryogenesis. Mouse models with decreased or absent Zic expression have been an invaluable resource for gaining insight into the etiology of the pertinent congenital malformations. Although single gene mutations can cause developmental abnormalities, the overlapping expression domains of the five genes suggest that cooperative actions between family members are likely. This has already been demonstrated in mice where Zic2^+/Kd; Zic1^+/- double heterozygotes have a cerebellar phenotype that is unlike either of the single heterozygous mutants (18). In addition, we have also demonstrated that single Zic1^+/- or Zic4^+/- heterozygous mutant mice do not have a cerebellar phenotype similar to human DWM, but rather, this phenotype is revealed only by heterozygous loss of both genes (8). Additional interactions are likely to be reported in the future for other Zic genes in both mice and humans. Analysis of Zic mutant mice has also begun to identify the molecular pathways regulated by the Zic genes. These additional interacting genes provide further candidate genes to be tested for their involvement in human congenital malformations and will also provide insights into the molecular and developmental basis of these important malformations.