DRFs | FH | DAD

Актиновые филаменты вносят вклад во многие процессы в клетках эукариот, включая поляризацию, выпячивания, контракции, расхождение ядер, цитокинез и доставку пузырьков. Каждый из этих процессов использует различные актин-связывающзие белки и разные устройства актиновых филамент.

Актиновые филаменты являются полярными, имеют быстро растущий `колючий' конец и медленно растущий `заострённый' конец. Удлиннение актина в клетках происходит в основном, если не исключительно, на колючем конце. И в самом деле белки и малые молекулы, такие как capping белок и cytochalasin, которые образуюжт шапочку над колючими концами филамент (Caldwell et al., 1989; Tellam и Frieden, 1982) блокируют сборку актина in vivo. Т.о., клетки м. осуществлять сборку актина на непокрытом шапочкой колючем конце филамент, заставляя филаменты создавать новые колючие концы или вызывать зарождение (nucleation) de novo актиновых филамент.

Nucleation ряда филаментозных актиновых структур зависит от активации комплекса Arp2/3. Напр., Arp2/3 даёт начало (nucleates) разветвленной сети, которая содержит короткие актиновые филаменты, обнаруживаемые в lamellipodia подвижных клеток (Higgs и Pollard, 2001>; Pollard et al., 2000; Pollard et al., 2001). Актиновые веточки образуются под углом 70° и являются, как полагают, опитимальными для обеспечения выпячивания (protrusion) (Рис. 1). Комплекс Arp2/3 является также критическим компонентом участков кортикального актина у дрожжей, которые, по-видимому, контролируют эндоцитоз (Pruyne и Bretscher, 2000), и рекрутируются с помощью патогенных бактерий (таких как Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium и enteropathogenic Escherichia coli) и вирусов (таких как Vaccinia), которые используют полимеризацию актина хозяина для перемещения (Higgs и Pollard, 2001).

Генетические доказательства указывают на то, что комплекс Arp2/3 не является nucleator всех актиновых филамент. Его делеция у почкующихся дрожжей разрушает сборку участков кортикального актина, но не затрагивает сборку актиновых кабелей или актинового контрактильного кольца (Evangelista et al., 2002; Tolliday et al., 2002; Winter et al., 1999). У Drosophila melanogaster мутации в Arp2/3 или в его активаторах не влияют на цитокинетические контрактильные кольца, актин-зависимые цитоплазматические мостики и кольцевые каналы, которые появляются в питающих клетках в раннем развитии, на упорядоченные актиновые пучки, которые, которые формируются в питающих клетках в позднем развитии или на актиновые пучки в щетинках (Рис. 1) (Miller, 2002; Hudson и Cooley, 2002). Более того, пониженные уровни Arp2 у Caenorhabditis elegans не влияют на цитокинез или сборку кортикальных микрофиламент, необходимых для установления передне-задней оси (Severson et al., 2002).

Formins: multidomain proteins controling actin assembly

Formins являются семейством высоко законсервированных белков эукариот, участвующих в широком круге поцессов, связанных с актином, включая поляризацию , цитогенез клеток, формирование стереоцилий волосковых клеток, образование акросом спермиев и эмбриональное развитие (напр., морфогенез конечностей и почек) (см. Table 1) (Ridley, 1999; Wasserman, 1998; Zeller et al., 1999). Ген limb deformity (ld) мыши кодирует первый идентифицированный формин – назван так потому, что мутантный аллель у мышей неспособен `формировать' собственно конечности и почки (Kleinebrecht et al., 1982; Mass et al., 1990; Woychik et al., 1985; Zeller et al., 1989).

Наиболее сильно законсервированным свойством форминов являются два расположенных рядом formin homology домена, FH1 и FH2 (Castrillon и Wasserman, 1994; Wasserman, 1998), оба из которых участвуют в контроле сборки актина (Evangelista et al., 1997; Evangelista et al., 2002; Sagot et al., 2002a; Watanabe et al., 1999) (Рис. 2A). Некоторые формины содержат также законсервированные FH3 мотив(ы) между RBD и FH1 доменом (Рис. 2A); этот мотив предопределяет субклеточную локализацию (Petersen et al., 1998; Kato et al., 2001; Oazki-Kuroda et al., 2001; Sharpless и Harris, 2002). Консервация доменов formin homology указывает на то, что все формины обладают сходной молекулярной активностью и подчеркивает необходимость характеристики их структуры и функции.

Богатый пролином FH1 домен соединятся с G-actin-связывающим белком profilin (Chang et al., 1997; Evangelista et al., 1997; Imamura et al., 1997; Watanabe et al., 1997). Взаимодействие formin-profilin, которое м. высвобождать ATФ-связанные актиновые мономеры, чтобы наращивать колючие концы актиновых филамент (Carlier и Pantaloni, 1997; Theriot и Mitchison, 1993; Wear et al., 2000), является существенным для, по крайней мере, некоторых функций форминов. SH3 и WW домены (Chan et al., 1996; Kamei et al., 1998; Tong et al., 2002; Vallen et al., 2000) также ассоциируют с FH1 доменом форминов. Напр., SH3 домен дрожжевого Hof1p, белка, который участвует в цитокинезе, соединяется с FH1 доменом в Bnr1p Rho-зависимым способом (Kamei et al., 1998; Vallen et al., 2000). Сходным образом, домен SH3 нерецепторной тирозин киназы млекопитающих Src соединяется с diaphanous (mDia)-related formins (DRFs) млекопитающих (Tominaga et al., 2000). Взаимодействие mDia-Src, по-видимому, обеспечивает mDia-зависимую передачу сигналов к serum response factor (SRF), к транскрипционному фактору, который регулирует гены, индуцируемые фактором роста, и мышце-специфические гены (Tominaga et al., 2000). Дальнейший анализ (Copeland и Treisman, 2002) выявил, что фрагменты mDia1, содержащие только FH2 домен, стимулируют сборку актина за счёт уменьшения пула G-actin, это ведет к непосредственно активации SRF. T. о., FH1 домен, по-видимому, функционирует как поддержка (scaffold), которая позволяет форминам рекрутировать белки, которые модулируют его внутренне присущую активность по сборке актина.

Домен FH2 представляет собой уникальное и вполне определенное свойство форминовых белков, он не обнаруживает очевидного сходства последовательностей с каким-либо др. доменом или полипептидом. Он контролирует nucleation актина in vitro (Pruyne et al., 2002; Sagot et al., 2002b) и сборку актина in vivo (Copelи и Treisman, 2002; Evangelista et al., 2002; Pruyne et al., 2002; Sagot et al., 2002a; Sagot et al., 2002b). Домен, как первоначально полагали, представлен 100 остатками (Castrillon и Wasserman, 1994; Wasserman, 1998), но анализ последовательностей (http://pfam.wustl.edu/index.html) во множественных, вновь открытых форминах показал, что область сходных последовательностей значительно больше и покрывает почти 500 отстаков, которые соотвествуют С-терминальному Dia-autoregulatory (DAD) domain. Домен FH2 ещё до конца неохарактеризован, поэтому мы не занем, состоит ли он из множественных субдоменов, которые играют независимую рольв сборке актина. В случае mDia1, делеционный анализ продемонстрировал, что N-терминальная и C-терминальная области домена FH2 обе необходимы для эффективной сборки актина in vivo (Copeland и Treisman, 2002). Согласуется с этим наблюдением и находка, что делеция С-терминальной области Bni1p, соответствующей домену DAD обусловливает 50% потерю активности (M.E. и C.B., unpublished).

Несмотря на это, некоторые доказательства указывают на то, что определенные субдомены FH2 домена м. иметь отличющиеся функции в сборке актина. Напр., N-терминальная область Bni1p FH2 домена связывает translation elongation factor 1A (eF1A) (Umikawa et al., 1998; Liu et al., 2002). Т.к. eF1A м. связывать в пучки актиновые филаменты (Demma et al., 1990), то это взаимодействие м. облегчать организацию растущих филамент или рег4лировать сборку актина неким др. способом. Избыточная экспрессия eF1A у дрожжей индуцирует сборку филамент, котрая напоминает ту, что ассоциирована с активированными формами Bni1p (Munshi et al., 2001). Делеция eF1A-связывающего сайта внутри Bni1p ведет к дефекту сборки актина in vivo (Umikawa et al., 1998); однако, чтобы определить, обусловлено ли это дефектом взаимодействия eF1A или nucleation, мутантный белок д.б. оценён в отношении своей актвности nucleation in vitro.

Самостоятельные классы форминов, DRFs (Table 1, звездочка), были выявлены на базе их способности взаимодествовать с активированной ГТФ-связанной формой Rho-type GTPase посредством N-терминального Rho-binding domain (RBD) (Evangelista et al., 1997; Habas et al., 2001; Imamura et al., 1997; Kohno et al., 1996; Watanabe et al., 1997) (Рис. 2B). Т.к. форминовые RBD домены не обладают занчительным сходством последовательностей, то DRFs были классифицированы с помощью функциональных определений. Соединение Rho-GTP с доменом RBD облегчает ауто-ингибирование с помощью DAD домена (Рис. 2B), которое обеспечивается внутримолекулярным взаимодействием с RBD, для продукции неактивного состояния (Alberts, 2001; Watanabe et al., 1999). Эта регуляторная активность была первоначально охарактеризована на mDia1 (Watanabe et al., 1999), a consensus DAD домена является общим свойством DRFs (Alberts, 2001). Этот тип регуляции напоминает тот, что ассоциирован с Cdc42-GTP-зависимой активацией актинового регулятора N-WASP (Rohatgi et al., 1999). Т.к. ряд форминов, чья активация не была охарактеризована, содержат последовательности, напоминающие домен DAD (напр..у S. pombe For3), то они также м.б.DRFs.

Некоторые формины м. регулироваться др. сигнальными путями или др. механизмами. Если эти др. формины сохраняют внутримолекулрный способ регуляции, то любой белок, который соединяется или модифицирует или N-терминальную регуляторную область или соотв. DAD-подобный негативный регляторный домен, д. потенциально активровать nucleation. Напр., Delphilin млекопитающих связывает glutamate receptor δ2 (GluRδ), участвует в постсинаптической трансмиссии на актиновый цитоскелет (Miyagi et al., 2002). Delphilin является уникальным формином, т.к. он содержит на N-конце PDZ домен, который соединяется с GluRδ2 (Miyagi et al., 2002). В этом случае, GluRδ2 рецепторы также м. регулировать активность Delphilin способом, аналогичным тому, что Rho-GTP обеспечивает регуляцию DRFs. В ответ на передачу сигналов Wnt-активированных Frizzled (Fz) рецепторов, формин человека Daam1 образует комплекс с Dishevelled (Dvl) и активрованным RhoA (Habas et al., 2001). Наконец, растительный formin AHF1 содержит на N-конце трансмембранный домен, который обладает потенциалом локализовать или регулировать его функцию (Banno и Chua, 2000).

Formins directly assemble Arp2/3-independent actin structures

Первые доказательства того, что формины катализируют сборку филаментозных структур, были получены на дрожжевых клетках, избыточно экспрессирующих N-терминально укороченные Bni1p, которые выявили повышенные уровни кабелей из филаментозного актина (Evangelista et al., 1997). Потом было показано, что укороченные mDia1 млекопитающих обусловливают увеличение актиновых стрессовых волокон (Watanabe et al., 1999) и увеличение клеточного содержания F-actin (Copelи и Treisman, 2002).

Недавно была выявлена прямая роль форминов у почкующихся дрожжей (Bni1p и Bnr1p) в сборке актиновых кабелей (Evangelista et al., 2002; Pruyne et al., 2002; Sagot et al., 2002a; Sagot et al., 2002b). Делеция BNI1 или BNR1 не оказывает влияния на жизнеспособность клеток, но делеция обоих генов летальна (Imamura et al., 1997), это указывает на то, что роли форминов у дрожжей перекрываются. Создание быстро действующих, temperature-sensitive (ts) мутаций в домене FH2 у BNI1 на bnr1Δ фоне позволило исследовать роль этих форминов in vivo (Evangelista et al., 2002; Sagot et al., 2002a). Рот пермиссивной температуре, bnr1Δ bni1-ts двойные мутанты обнаруживали кабели актина дикого типа и поляризованные кортикальные участки (Рис. 3). После сдвига к рестриктивной температуре, актиновые кабели быстро исчезали, но не обнаруживалось изменений в структуре или поляризации актиновых участков (Рис. 3). Сходным образом у делящихся дрожжей формин For3 по-видмому, играет главную роль в образовании актиновых кабелей (Feierbach и Chang, 2001). Анализ arp3Δ делеционных мутантов выявил, что они характеризуются дефектами сборки актиновых участков (заплаток), но имеют нормальную сборку актиновых кабелей (Winter et al., 1999; Evangelista et al., 2002). Т.о., у дрожжей Arp2/3, по-видимому, отвечает за сборку актиновых кортикальных участков, тогда как формины отвечают за сборку актиновых кабелей.

E C. elegans (Severson et al., 2002), RNAi-индуцированное снижение уровней или profilin или formin CYK-1 ведет к дефектам цитокинеза и передне-задней полярности. Напротив, комплекс Arp2/3 оказывается несущественным для обоих этих процессов, но необходим для др. связанного с актином процесса, такого как гаструляция и эпидермальное вложение (enclosure). Т.о., у C. elegans комплекс Arp2/3 и формины также м. отвечать за сборку разных актиновых структур.

Formin FH2 domain: nucleation и polarization of actin filaments

Если формины собарают актиновые филаменты независимо от Arp2/3, то как же образуются индуцированные форминами филаменты? Самой простой возможностью является то, что формины непосредственно засеивают (nucleate) актиновые филаменты. Фактически C-терминальные фрагменты Bni1p экспрессируемые и очищенные из E. coli стимулируют nucleation актина in vitro (Pruyne et al., 2002; Sagot et al., 2002b), и делеционный анализ покзал, что Bni1p FH2 домен достаточен для nucleation актиновых филамент (Pruyne et al., 2002).

Полимеризация, индуцированная с помощью Bni1p ингибируется cytochalasin B, это указывает на то, что нуклеированные филаменты растут преимущественно с быстро-растущих колючих концов (Pruyne et al., 2002; Sagot et al., 2002b). ЭМ показала, что эти филаменты являются длинными и неветвящимися (Pruyne et al., 2002; Sagot et al., 2002b) и что Bni1p ассоциирут специфически с колючим концом (Pruyne et al., 2002). В самом деле, конструкция Bni1p содержит и FH1 и FH2 домены (Bn1p FH1-FH2) и м. ассоциировать с колючим концом уже существующих филамент и замедлять, но не блокировать их удлиннение (Pruyne et al., 2002). Это указывает на то, что Bni1p является actin-filament-capping белком, но в отличие от традиционных покрывающих шапочкой (capping) белков, которые соединяются с колючим концом и препятсвуют элонгации филамен, Bni1p, по-видимому, соединяется с колючим концом филамент и регулирует скорость их роста.

Т.к. Bni1p локализуется в дискретных областях растущего клеточного кортекса, в таких как верхушки развивающихся почек, то его способность соединяться с колючими концами филамент указывает на то, что он м.б. способным, чтобы связать филаменты, их нуклеировать и поляризовать в направлении самого себя (Рис. 4). В самом деле, однонаправленное движение зависящих от кабелей myosin V моторов указывает на то, что филаменты кабелей поляризованы в направлении растущего кортекса (Schott et al., 2002). In vivo анализ динамики кабелей показал, что актиновые пучки собираются из этих сайтов, указывая тем самым, что закрепление актиновых кабелей осуществляется на их растущих концах (Yang и Pon, 2002). Т.к. груз myosin V включает секреторные пузырьки, мРНК и молекулярные комплексы, которые ассоциируют с цитоплазматическими микротрубочками (Beach et al., 1999; Bertrи et al., 1998; Hoepfner et al., 2001; Miller et al., 2000; Pruyne et al., 1998; Rossanese et al., 2001; Schott et al., 2002; Takizawa et al., 2000; Theesfeld et al., 1999; Yin et al., 2000; Zahner et al., 1996) (Рис. 4), поэтому мутации в гене BNI1 ведут к дефектам поляризованной секреции, локализации мРНК, ориентации веретена и позиционирования ядра (Evangelista et al., 2002; Fujiwara et al., 1999; Lee et al., 1999; Sagot et al., 2002a). Т.о., способность Bni1p, возможно нацеливаемая с помощью др. белков, связываться с растущими колючими концами филамент из актиновых кабелей обеспечивает простой и к тому же элегантный путь ориентации актиновых кабелей, которые направляют миозиновые моторы и связанные с ними грузы в направлении растущего кончика почки (выпячивания) (Рис. 4).

Mechanism for FH2-mediated actin nucleation

Моделирование Bni1p-обеспечиваемой реакции сборки in vitro (Pring et al., 2003)подтверждает, что домен FH2 стабилизирует актиновый димер и что этот комплекс функционирует как единица nucleation, которая обеспечивает эффективный рост колючих концов (Рис. 5A). При низких концентрация G-actin спонтанное образование актиновых димеров редко из-за их нестабильности; однако formins м. создавать димеры, последовательно связывая актиновые мономеры. В этом случае эффектинвость nucleation будет зависеть от сродства FH2 домена к G-actin. Предварительный анализ показал, что Bni1p FH1-FH2 обладает относительно слабой связывающей способность в отношении G-actin (i.e. >5 µm) (S.Z., unpublished), это согласуется с его умеренной nucleating активностью.

Интересно сравнить свойства спонтанной и Arp2/3-индуцированной nucleation актина с той, что индуцируется форминами. При спонтанной nucleation, форма актина перед нуклеацией (pre-nucleus) (форма, которая м. удлинняться подобно актиновым филаментам) является актиновым тримером, который образуется очень медленно при физиологических концентрациях актина. При Arp2/3-индуцированной nucleation, связанные с актином белки Arp2 и Arp3, как полагают, приобретают расположение, сходное с таковым у двух актиновых субъединиц (along the short-pitch helix) актиновой филаменты (Pollard и Beltzer, 2002). При добавлении одиночной молекулы G-actin к комплексу Arp2/3 образуется место образования филаменты (nucleus), которая м. удлинняться с кинетикой колючего конца актиновой филаменты (Рис. 5A); возникающая в результате филамента покрывается шапочкой из комплекса Arp2/3 на её заострённом конце (Рис. 5B).

При Bni1p FH2-индуцированной nucleation, pre-nucleus представляет собой актиновый димер (Рис. 5A), который вероятно формируется в результате последовательного добавления мономеров. Подобно capping белку и cytochalasin, Bni1p также ассоциирует с колючим концом филаменты (Рис. 5B); однако он замедляет, но не блокирует удлиннение колючего конца, действуя подобно `leaky capper'. Лежащий в основе механизм пока неясен, но вообще-то FH2 домен идет шатаясь в направлении колючего конца processive способом по мере удлиннения филаменты.

Arp2/3-зависимя nucleation регулируется с помощью различных факторов, включая членов семейства WASP и cortactin (Higgs и Pollard, 2001). Как отмечалось выше, по крайней мере, некоторые формины активируются с помощью Rho GTPases. Formin-индуцированная nucleation далее м.б. модулирована с помощью пост-трансляционных модификаций формина или его партнёров по связыванию. Напр., мышиный formin I (Vogt et al., 1993) и дрожжевой Bni1p (Goehring et al., 2003), являются фосфопротеинами in vivo и м. регулироваться с помощью фосфорилирования. Взаимодействующие с форминами белки, которые м. участвовать в реакции сборки, включают Bud6p/Aip3p (Amberg et al., 1997), белок, который необходим для Bni1p-индуцированного образования кабелей in vivo (Evangelista et al., 2002; Sagot et al., 2002a) и в двугибридных исследованиях взаимодействует с С-терминальной областью Bni1p, которая перекрывает FH2 домен (Evangelista et al., 1997), а также актин-связывающий белок eF1A (Demma et al., 1990), который взаимодействует с N-терминальной областью домена FH2 (Umikawa et al., 1998; Liu et al., 2002). Мы предполагаем, что in vitro реакции сборки актина с полной длины формировными белками, выделенными из клеток эукариот, и с белками, свфзывающими формины, смогут пролить свет на регуляцию индуцируемой форминами сборки актина.

The role of profilin in Bni1p-induced nucleation

В клетках млекопитающих FH2 домен у mDia достаточен для индукции накопления филаментозного актина (Copelи и Triesman, 2002). У почкующихся дрожжей Bni1p FH1 домен и profilin, белок, связывающий актиновые мономеры, необходимы помимо домена FH2 для сборки актиновых филамент in vivo (Evangelista et al., 2002; Pruyne et al., 2002; Sagot et al., 2002a; Sagot et al., 2002b). In vitro, profilin усиливает nucleation с помощью Bni1p FH1-FH2 (Pring et al., 2003; Sagot et al., 2002b), тогда как мутанты по profilin неспособны соединяться с FH1-подобными polyproline последовательностями и не оказывают эффекта на нуклеацию (Pring et al., 2003; Sagot et al., 2002b). Более того, profilin-actin усиливает nucleation с помощью Bni1p FH1-FH2, но не с помощью одного FH2 (Pring et al., 2003), это указывает на то, что взаимодействие между доменом FH1 и profilin необходимо для увеличения nucleation. Т.о., FH1 домен м. рекрутировать profilin-actin и поставлдять актин домену FH2 (Рис. 5C), точно также как WH2 домен белков семейства WASP и ActA предоставлют (present) актиновые мономеры в комплекс Arp2/3 (Higgs и Pollard, 2001; Yang et al., 2000). Т.к. profilin, как было показано, способствует элонгации колючих концов актиновых филамент, то profilin д. также увеличивать скорость полимеризации филамент, нуклеированных с помощью FH2 домена. Т.о., profilin м. выполнять две роли в формин-зависимой сборке актина: nucleation и elongation актиновых филамент.

Formins may nucleate different actin bundle structures

Хотя детали FH2-индуцированной nucleation актиновых филамент остаются неизвестными, но консервация FH2 домена указывает на то, что формины нуклеируют широкое разнообразие актиновых пучков у многих организмов. Напр., один из форминов млекопитающих, DFNA1, участвует в возникновении несиндромной глухоты (Lynch et al., 1997), это указывает на то, что он участвует в образовании актиновых пучков в стереоцилиях волосковых клеток. В культивируемых фибробластах млекопитающих формин mDia1 необходим для образования Rho-индуцируемых стрессовых волокон (Nakano et al., 1999; Tominaga et al., 2000; Watanabe et al., 1997; Watanabe et al., 1999). hDia, человеческий гомолог diaphanous, взаимодействует с YWK-II, структурным компонентом мембраны спермиев человека, необходимым для образования акросомного отростка (Zhang et al., 2001).

Общая потребность в форминах при цитокинезе указывает на то, что формины м. контролировать образование актинового контрактильного кольца (Frazier и Field, 1997; Wasserman, 1998; Zeller et al., 1999). Исследования C. elegans с помощью RNAi для уменьшения уровней formin CYK-1, напр., показали, что формины м. выполнять непосредственную роль в этом процессе, тогда как Arp2/3 несущественен (Severson et al., 2002). У Drosophila мутации Arp2/3 или его активаторов не нарушают формирование цитокинетических контрактильных колец (Hudson и Cooley, 2002). У почкующихся дрожжей сборка актинового контрактильного кольца использует Rho1-зависимую стимуляцию форминовых белков и profilin (Tolliday et al., 2002). У деляыщихся дрожжей формин Cdc12 является компонентом кольца клеточного деления (Chang et al., 1997) и необходим для образования ведущего F-actin кабеля, который образует контрактильное кольцо (Arai и Mabuchi, 2002). Однако в этом случае, Cdc12 и комплекс Arp2/3, по-видимому, сотрудничают в непрерывном синтезе актинровых филамент, необходимых для цитокинеза (Pelham и Chang, 2002). Образование некоторых актиновых структур м., следовательно, нуждаться в скоординированной nucleation с помощью и formins и Arp2/3.

Roles for formins in microtubule organization

У почкующихся дрожжей форминовые белки косвенно контролируют ориентацию веретена через сборку актиновых пучков. Ориентация веретена зависит от myosin V мотора, Myo2p, покторый поставляет белок Kar9p к кончику растущей почки (Beach et al., 1999; Yin et al., 2000). Kar9p функционирует в качестве кортикального якоря для Bim1p, он соединяется с концами цитоплазматических микротрубочек (Korinek et al., 2000; Lee et al., 2000; Miller et al., 2000). Т.о., комплекс Myo2p-Kar9p-Bim1p обеспечивает физическую связь между митотическим веретеном и актиновыми кабелями и, т.к. Bni1p nucleates и поляризует актиновые кабели, то он контролирует косвенно и ориентацию митотического веретена (Рис. 4). В развивающихся ооцитах мыши роль formin 2 напоминает ту, что у дрожжевого Bni1p: он необходим для актин-зависимого позиционирования веретена и установления клеточной полярности (Leader et al., 2002).

В клетках млекопитающих mDia формины модулируют функции и оргнанизацию микротрубочек (Isizaki et al., 2001; Kato et al., 2001; Palazzo et al., 2001). Избыточная экспрессия активированной формы mDia1 индуцирует биполярную элонгацию клеток HeLa и упорядоченное расположение микротрубочек и F-actin пучков вдоль длинной оси клетки (Ishizaki et al., 2001). Интересно, что мутации законсервированных остатков внутри домена FH2 устраняют этот фенотип. Более того, микроинъекции serum-starved NIH 3T3 клеткам ДНК, кодирующей постоянно актиную форму mDia2, или ДНК, кодирующей DAD аутоингибирующий домен, который ведет к активации эндогенной mDia1, стимулируют образование стабильных микротрубочек, ориентированных в направлении места ранения (Palazzo et al., 2001). Кроме того, mDia2 колокализуется с субнабором микротрубочек в некоторых клетках и связывается непосредственно с микротрубочками in vitro (Palazzo et al., 2001). Наконец, mDia1 локализуется в митотическом веретене клеток HeLa FH3-domain-зависимым образом (Kato et al., 2001). Т.о., имеется чёткая функциональная связь между mDia и регуляцией микротубулярного цитоскелета; однако остаётся неясным, зависят ли эффекты на микротрубочки от nucleation актина.

Outlook

Хотя роль форминовых белков в морфогенезе, полярности клеток и цитокинезе известна с некоторых пор (Wasserman, 1998; Ridley, 1999; Zeller et al., 1999), лишь недавно установлена биохимическая роль форминов в nucleation актиновых филамент. Регуляция и молекулярные механизмы, которые контролируют обусловленную форминами nucleation, еще необходимо выяснить в деталях. Обнаружение, что форминовые белки м. ассоциировать с растущими колючими концами филамент ососенно интересно, т.к. это уникальное свойство делает возможной локализацию этих морфогенетических детерминант на растущем конце филаменты в специфическом положении внутри клетки. Необходимо установить, как формины м. ассоциировать с колючим концом, позволяя при этом продолжать добавление мономеров. Структурный анализ форминового FH2 домене м. предоставить критическую информацию, необходимую для выяснения остатков, критических для nucleation, ассоциации с barbed-end и/или частичного покрытия шапочкой.

М.б. идентифицированы дополнительные nucleators при использовании условных мутаций, в которых м.б. нарушена функция и Arp2/3 комплекса и formin. Семейство VASP/Mena белков (Krause et al., 2003), напр., м. функционировать как nucleators in vivo; эти белки напоминают формины, т.к. они м. нуклеировать актиновые филаменты in vitro (Huttelmaier et al., 1999; Walders-Harbeck et al., 2002), хотя и неэффективно, и соединяться с колючими концами актиновых филамент (Bear et al., 2002). Более того, белок Listeria ActA, который активирует комплекс Arp2/3, имеет Arp2/3-независимую nucleating активность, которая нуждается в VASP (Fradelizi et al., 2001; Skoble et al., 2001). Человеческий zyxin является др. потенциальным nucleator, т.к. он, по-видимому, способен генерировать новые актиновые структуры независимо от комплекса Arp2/3 (Fradelizi et al., 2001). Гланой задачей является связать каждую филаментозную актиновую структуру со специфической системой nucleation.

Formins: signaling effectors for assembly и polarization of actin filamentsMarie Evangelista, Sally Zigmond и Charles Boone (charlie.boone@utoronto.ca)Journal of Cell Science 116, No 13, 2603-2611 (2003)

Formins: signaling effectors for assembly и polarization of actin filaments
Marie Evangelista, Sally Zigmond и Charles Boone (charlie.boone@utoronto.ca)
Journal of Cell Science 116, No 13, 2603-2611 (2003)