Relating biochemistry and function in the myosin superfamily , February 2004, Pages 61-67 | |
|
All characterized myosins share a common ATPase mechanism. However, detailed kinetic analyses suggest that modulation of the rate and equilibrium constants that define the ATPase cycle confers specific properties to these motor proteins, suiting them to specific physiological tasks. Understanding the kinetic mechanisms allows potential cellular functions of the different myosin classes and isoforms to be better defined.
|
Сверхсемейство миозинов базирующихся на актине молекулярных моторов состоит, по крайней мере, из 18 членов с разнообразными свойствами, приспособленными к различным клеточнм активностям [1,2]. Напр., некоторые миозины существуют в виде больших макромолекулярных ансамблей, которые управляют контакцией мышц, тогда как др. работают в малых количествах для поддержания транслокации отдельных органелл. Изучались механизмы разных наборов классов и изоформ миозинов. Overview of the myosin ATPase cycle Механизм цикла actomyosin ATPase, по-видимому, законсервирован для всех изоформ миозинов. Схема на Рис.1 показывает путь actomyosin ATPase в купе с механической моделью [3,4.]. Хотя она чрезвычайно упрощена от того, что известно о хемомеханическом coupling, схема содержит основные детали, необходимые для понимания биохимического разнообразия миозинов. Более детельное обсуждение хемомеханического coupling и actomyosin ATPase цикла представлено в великолепном учебнике Howard [5] и обзоре Geeves and Holmes [6].
(34K) Figure 1. The actomyosin ATPase cycle, identifying the weak- and strong-binding states of myosin. In the absence of ATP, myosin binds tightly to actin. ATP binding (step 1) induces a conformational change in myosin that weakens its actin affinity and causes myosin to detach from actin (step 2). A second conformational change allows hydrolysis of ATP to ADP and inorganic phosphate (Pi) (step 3); the hydrolysis products remain bound to myosin. The M.ADP.Pi state rebinds to the actin filament (step 4) and a force-generating power-stroke accompanies phosphate release (step 5). ADP is released (step 6) and the cycle repeats upon ATP binding. The actin-detached M and M.ADP states are omitted for clarity and to illustrate that these states are not populated during enzymatic cycling in the presence of saturating actin and ATP. Минимальный механизм, необходимый для описания цикла myosin ATPase состоит, по крайней мере, из 6 нуклеотид-сцепленных биохимических реакций. Они детально представлены на Рис. 1.
Промежуточные образования определены в соотвествии с их сродством к актину. M.ATP и M.ADP.Pi состояния являются ‘weak-binding’ или ‘pre-force generating’ промежуточными состояниями, при которых миозины присоединются и отсоединяются (ступени 2 и 4) от актиновых филамент на субмикровторичной шкале, имеют низкое (микромаолярное) сродство к аетину и не соединяются с стереоспецифически с актиновыми филаментами [6]. Состояние слабого связывания не обладает силой, но позволяет миозину подготовить (‘cock’) себя к силовому удару (power-stroke), когда он отсоединен от актина (ступень 3), предупреждая возврашение к power-stroke, когда прикреплен к актину. AM и AM.ADP состояния являются ‘strong-binding’ промежуточными состояниями, которые стереоспецифически прикреплены к актиновым филаментам с высоким (субмикромаолянымХ сродвтсовм. Чостояния strong-binding являются ‘force-bearing’ промежуточными состояниями.
Генерирующий силу power-stroke совпадает с высвобождением фосата при переходе от состояния слабой связи к состоянию сильной связи (ступень 5, Рис. 1). Благодаря контролю перехода от слабого к сильному состоянию высвобождение Pi является идеальной степенью для контроля соединения миозина с актином и подвижности. Переход регулируется с помощью регуляторной системы кальция в поперечно-полосатых мышцах и с помощью фосфорилирования тяжелой цепи некоторых изоформ myosin-I [7]. Enzymatic adaptations of myosin classes and isoforms Имеются два важных параметра, которые влияют на механические и подвижные свойства миозинов, во-первых, продолжительность жизни (т.e. продолжительность биохимического состояния в единицу времени) промежуточных образований с сильной связью (AM и AMD), и, во-вторых, коэффициент производитеьности (duty ratio). Продолжительность жизни прикрепления и коэффициенты производительности м. варьировать существенно между классами миозинов и между изоформами внутри данного класса.
Коэффициент производительности молекулярного мотора определяется как фракция от времени общего цикла ATPase, в течение которой индивидуальный мотор прикреплён к своему треку [5]. Для популяции моторов коэффициент производительности является фракцией с устойчивым состоянием прикрепленных молекул. Прикрепленные моторы м.б. в пре- [8-11] или в пост-power-stroke состоянии. Для обсуждаемых миозинов коэффициент производительности обычно означает долю времени, проведенную в состоянии сильной связи. Напр., миозины с низким коэффициентом производительности проводят большую часть времени в M.ATP и M.ADP.Pi состоянии, тогда как миозины с высоким коэффициентом производительности находятся в AM и AMD состоянии. В простых кинетических терминах, следует ожидать, что ступени 4 или 5 (Рис. 1) будут скорость-ограничивающими (т.e. самой медленной ступенью или ‘бутылочным горлышком’ в цикле ATPase) для миозинов с низким коэффициентом производительности, а ступени 1 или 6 (Рис. 1) будут скорость-ограничивающими для миозинов с высоким коэффициентом производительности( ). Коэффициент производительности, характеризующий миозины, зависит от показателей внутри и вне состояния строгого связывания, а , следовательно, зависит от концентраций актина и нуклеотидов [12,13].  Анимация 
AVI movie 1. Relationship between the duty ratio and the lifetime of the strong-binding state of two ‘model’ myosins. In the first frame of the animation, the rates of phosphate release (step 5) are significantly faster than the rates of ADP release (step 6) resulting in low duty ratios for the two myosins. The rates of ADP release are decreased as the animation progresses, resulting in increased duty ratios. Note that the fast and slow myosins have the same duty ratios, but the lifetimes of the strong-binding states are very different.
Myosin-I Изоформы myosin-I содержат по одной головке и являются членами сверхсемейства ассоциированных с мембранами миозинов, обнаруживаемых в большинстве клеток эукариот. Они играют существенную роль в динамике мембран, структуре цитоскелета, трансдукции механических сигналов и эндосомном процессинге [1]. Семейство myosin-I м. подразделить на два больших подкласса по последовательностям моторного домена (Рис. 2a). Subclass 1 contains the ‘amoeboid’ or long-tailed myosin-I proteins. Subclass 2 contains the ‘short-tailed’ myosins, including the well-characterized myo1a (brush border myosin-I) and the more widely expressed myo1b and myo1c. Figure 2. Relationship between myosin duty ratio and lifetime of the strong-binding state. (a) Phylogenetic analysis of several members of the myosin-I family showing subclass divisions. (b) Lifetimes of the AM.ADP strong-binding states of myosins -I, -V, and -VI [15,16,37,43]. Notice that the lifetime of the strong-binding state of myo1b (a low-duty-ratio motor) is significantly longer than that of processive myosin-V. (c) Pie charts showing the relative amounts of time per ATPase cycle that myosin-I proteins (low-duty-ratio motors) and myosin-V (a high-duty-ratio motor) spend in the weak- and strong-binding states in the presence of 50 μM actin. Все охарактеризованные изоформы myosin-I являются low-duty-ratio моторами (т.e. они используют небольшую фракцию своего каталитического цикла, строго связанную с актином) и состояния слабого связывания имеют очень низкое сродство к актину [14-16]. Следовательно, небольшие количества myosin-I моторов не м. поддерживать контракцию или перемещать грузы на длинные расстояния. Изучение сравнительной кинетики изоформ myosin-I выявили важные различия между субклассами. Скоростные константы наиболее охарактеризованных изоформ subclass-2 более медленные, чем у изоформ subclass-1 [14-18], приводя в результате к тому, что все биохимические промежуточные образования имеют значительно болший период жизни.
При изучении продолжительности жизни состояний сильного связывания (Рис. 2b), мы получили важные сведения о физиологической функции и регуляции myosin-I белков. Длинная продолжительность жизни обладающих силой (force-bearing) промежуточных образований миозинов субкласса-2 скорее всего является критической для структурной или напряжение-поддерживаюшей роли [15,17]. Напр., силу-генерирующие свойства этих моторов м. функционировать по наложению напряжения на tension-sensitive кальциевые канальцы [19,20]. Короткий период жизни состояний сильного связывания изоформи субкласса-1 м. способствовать выполняемой ими роли по быстрым сократительным событиям, для которых необходимы большие количества миозинов, как при быстрой контракции выпячиваний мембран, богатых актином [21,22]. Myosin-II Изоформы Myosin-II являются основными сократительными белками мышц и выполняют несколько важных ролей в немышечной контрактильности. Myosin-II молекулы содержат два моторных домена и собираются в биполярные филаменты. Как и в случае семейства myosin-I, филогенетический анализ моторных доменов семейства myosin-II выявил деление изоформ на самостоятельные субклассы, которые пересекают филогенетические границы. Семейство myosin-II м.б. подразделено на немышечные цитоплазматические, кардиальные мышечные, гладкомышечные и склетномышечные субклассы, каждый со множественными изоформами [2,23].
Все охарактеризованные изоформы myosin-II имеют сравнимые unitary силы и смещения — одиночная молекула склетномышечного myosin-II генерирует ту же самую силу и смещение, как и одиночная молекула гладкомышечного myosin-II [24].Однако, продолжительность жизни кинетических промежуточных образований и duty соотноешения мышечных изоформ обнаруживают существенную изменчивость, это ведет к важным механическим различиям, объясняющих их функциональное разнообразие. Напр., duty соотношение и продолжительность жизни состояний сильного связывания гладкомышечных миозинов существенно больше по сравнению с этими показателями изоформ из скелетных мышц [24,25]. В мышечной ткани эти кинетические различия скорее всего ответственны за более низкие скорости контракции гладких мышц и продукцию более значительных сил, чем в скелетных мышцах [24].
Недавние исследования немышечного миозина-IIb показали, что он является относительно high-duty-ratio мотором при физиологических концентрациях актина и нуклеотидов (миозин прикреплён к актину в течение ~20–50% времени его ATPase цикла) [13,26]. Тем самым он отличается существнно от немышечного миозина-IIa [27] и изоформ мышечных миозинов, которые обладают низким duty соотношением (миозин прикреплен к актину в течение ~10% времени его ATPase цикла). Т.о., немышечный myosin-IIb, по-видимому, адаптирован к выполнеию клеточных ролей, необходимых для поддержания напряжения (tension), в то время как немышечный myosin-IIa более приспособлен к более быстрому скольжению (sliding). Kovacs et al. [27] предположили, что клеточные миозиновые филаменты м.б. представлены множественными изоформами, это открывает возможность дальнейшего кинетического контроля (‘fine-tuning’) с помощью регуляции содержимого миозиновых филамент.
При развитии высоких сил (когда мышцы подвергаются изометрической контракции), low-duty-ratio изоформы myosin-II м. становиться high duty-ratio моторами; др. словами, высокие силы м. замедлять скорость, с которой промежуточные образования выходят из состояния сильного связывания [5,6]. Однако, влияние силы на кинетику и молекулярные механические циклы неясно и активно изучаются. Myosin-V Одиночная с двумя головками молекула миозина-V транспортирует пузырьки вдоль актиновых филамент на большие расстояния [28-40], демонстрируя, что связывание АТФ (ступень 1, Рис. 1), отделение от актина (ступень 2, Рис. 1), гидролиз актина (ступень 3, Рис. 1) и Pi высвобождение актином (ступени 4–5, Рис. 1) являются быстрыми (~200-800 s-1) и в большинстве своём необратимыми, тогда как высвобожэдение АДФ (ступень 6, Рис. 1) является медленной (~16 s-1) и скорость ограничивающей. И как результат предоминирование устойчивых состояний промежуточных образований в присутствии физиологических концентраций АТФ строго связано с состоянием AM.ADP, что делает myosin-V в high-duty-ratio моторы.
Важно понять, что оба и duty соотношение и время прикрепления отражают ферментативные адаптации, необходимые для специфических биологических функций и что высокое duty соотношение не обязательно указывает на то, что прикрепленные к актитну промежуточные образования имеют большую продолжительность жизни (). Напр., myosin-V обладает значительно более высоким duty соотношением, чем белки myosin-I субкласса-2( Рис. 2c), тому же продолжительность жизни состояния сильного связывания myosin-V значительно короче, чем таковая для изоформ low-duty-ratio myosin-I (Рис. 2b). Myosin-V лучше приспособлен для быстрого транспорта, тогда как, по-видимому, белки myosin-I субкласса-2 предназначены для медленного транспорта в актиновой сети или для поддержания натяжения [15,17]. Myosin-VI Myosin-VI является, по-видимому, молекулой с двумя головками, которая не ассоциирует в филменты и которая м. играть роль в эндоцитозе и мембранном трафике [41-43]. Подобно myosin-V, myosin-VI является high-duty-ratio мотором из-за медленного скорость-ограничивающего высвобождения АДФ [44]. Кроме того, связывание АТФ является медленным и слабым, в результате образуется популяция nucleotide-free AM (rigor) состояний промежуточных образований при физиологических условиях, которые в дальнейшем увеличивают duty отношение [44]. Myosin kinetics and processivity Высокое duty отношение необходимо для непрерывного движения миозиновых мторов. Myosin-I и более охарактеризованные изоформы myosin-II являются low-duty-ratio моторами и д. работать в ансамбле из многих моторов (которые генерируют высоко эффективное duty отношение), чтобы обеспечить непрерывное скольжение (Рис. 3a). Эта потребность была продемонстрирована in vitro путём изучения скольжения как функции плотности белка [45-47]. Локально высокие коныентрации myosin-II создаются в клетках сж
сборки миозина в филаменты и путём инкорпорации филамент в актин-содержащие структуры, такие как стрессовые волокна или саркомеры. Изофофрмы миозина-I ограничиваются мембранами и кортексом клеток, богатым актином, но неизвестно играют ли роль акцессорные белки в концентрации э
тих моторов.
Figure 3. Proposed mechanisms for processive motion by myosins. (a) In the absence of accessory proteins that may tether the motor to the actin filament, low-duty-ratio myosins must work in high concentrations to create a high effective duty-ratio and support sustained motility. Top panel: a few low-duty-ratio motors cannot sustain continuous sliding, and the motor and cargo dissociate from actin. Bottom panel: A high concentration of low-duty-ratio motors creates a high effective duty ratio, and the motors and cargo travel along the actin filament. (b) Model for processivity by two-headed high-duty-ratio myosins. Myosin dwells predominantly in a state with the trailing head strongly bound to actin in the AM.ADP state, and the leading head in equilibrium between a detached and an ‘engaged’ ADP.Pi state. The engaged head is bound to actin but has not undergone its power-stroke. The trailing head impedes the leading head from binding actin strongly and slows the rate of Pi release. ADP release from the trailing head results in a conformational change that optimally positions the leading head for actin attachment, allowing the lead head to bind actin strongly, begin its power stroke and eventually release Pi. ATP binding to the trailing head dissociates it from actin, the leading head power stroke swings the trailing head forward and the previous leading head now becomes the trailing head. Myosin-V у позвоночных [28-36], но не у дрожжей [48] и myosin-VI [49,50] являются высоко поступательными (processive), это в целом согласуется с мнением, что индивидуальные молекулы м. проходить множественные ступени, каждая из которых связана с циклом гидролиза АТФ, вдоль треков актиновых филамент перед диссоциацией. Каждый мотор из processive миозинов с двумя головками (в которых моторные домены не являются независимо processive) д. иметь высокое duty отношение (>0.5), чтобы увеличить вероятность того, что, по крайней мере, один моторный домен всегда будет соединен с актином или мотор и транспортируемый груз будут диффундировать прочь от своих треков. Кроме того, д. существовать некоторая форма коммуникаций между моторными доменами: как минимум, чтобы сместить, а вообще-то для координации каталитических циклов.
Многие модели были предложены для объяснения подвижности processive миозинов с двумя головками [28-36,51-55]. Большинство связано с координацией кинетики ATPase цикла двух головок. Хотя координация между головками не обязательна для поступательности (processivity), она наблюдается у myosin-VI с двумя головками [44] и как было установлено, является Ca2+-зависимой [56.].
Мы склоняемся в пользу alternating-site ‘hand-over-hand’ модели [44] для поступательного вышагивания в присутствии насыщения АТФ (Рис. 3b). Эта модель предполагает, что миозин, который находится преимущественно в состоянии, при котором перемещаемая головка строго связана с актином в AM.ADP состоянии, а ведущая головка находится в равновесии между отсоединением и ‘engaged’ ADP.Pi состоянием. Ангажированная головка соединяется с актином, но не совершает своего рабочего хода. Подтягиваемая головка создаёт затруднения для ведущей головки в освобождении от актина и замедляет скорость высвобождения Pi. Высвобождение АДФ из подтягиваемой головки ведет к конформационному изменению, которое оптимально позиционирует ведущую головку для прикрепления к актину, позволяя ведущей головке надёжно соединяться с актином и начинать свой рабочий ход и в конечном итоге высвобождать Pi. Конформационное изменение м.б. ротационным для плеча рычага [31-34] или, как в случае с миозином VI, более сложной, широко массштабной перестройкой, которая ещё не расшифрована [49,55]. При низких концентрациях АТФ (при которых были проведены некоторые структурные эксперименты), было предположено, что ведущая головка м. высвобождать свои продукты раньше, чем диссоциирует подтягиваемая (trailing) головка [53]. АТФ соединяется с подтягиваемой головкой, отсоединяет её от актина, после чего рабочий ход ведушей головки leading-head power stroke переправляет подтягиваемую головку вперед и прежде ведущая головка теперь становится подтягиваемой головкой. Характерным признаком этой модели являетя то, что подтягиваемая головка ограничивает ведущую головку от прохождения через цикл. Conclusions and future directions Though the ATPase cycles of myosin motors are conserved, the kinetics of the individual reactions defining the cycle can vary dramatically and are optimized for specific biological functions. It is generally believed that the tail domains of myosin motors provide the source of functional diversity. However, detailed kinetic analysis demonstrates that modulation of the rate and equilibrium constants defining the ATPase cycle can confer unique and specific properties on a motor that allow it to accomplish a specific physiological task. Understanding the kinetic mechanisms allows us to better define the potential cellular functions of the different myosin classes and isoforms.
Future kinetic studies need to address the molecular mechanisms of ATPase cycle regulation by associated light chains [12,57-60], actin-binding proteins such as tropomyosin, and post-translational modifications. It is also critical to understand how external forces and loads influence the rate constants of the ATPase cycle.
|
