Посещений:
SORTING NEXINS

SORTING OUT THE CELLULAR FUNCTIONS OF SORTING NEXINS
Carolyn A. Worby (cdworby@umich.edu), Jack E. Dixon
Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, No 12, P. 919-931 (2002)


Sorting nexins are a diverse group of cellular trafficking proteins that are unified by the presence of a phospholipid-binding motif — the PX domain. The ability of these proteins to bind specific phospholipids, as well as their propensity to form protein–protein complexes, points to a role for these proteins in membrane trafficking and protein sorting. It will be interesting to determine whether the various sorting nexins have specialized or generalized roles in protein trafficking.


(Рис.1.)  |  Protein and membrane trafficking.


(Рис.2.)  |  Human sorting nexins.


(Рис.3.)  |  PX-domain phylogenetic tree.


(Рис.4.)  |  Crystal structure of the p40phox


(Рис.5.)  |  SNX-PX domain alignment.


(Рис.6.)  |  The functions of the sorting nexins.

Boxes

Box 1 | PX domains and disease

The PX domain was first characterized by a comparison of protein domains in the phagocytic NADPH oxidase (phox) complex, which has a crucial role in host defence against microbial infection by generating microbicidal oxidants. Chronic granulomatous disease (CGD) is an inherited disorder in which these oxidants are not generated, thereby resulting in recurrent and life-threatening infections. The active oxidase complex contains cytochrome b558 (the catalytic core), the small GTPase Rac, p67phox and the PX-domain-containing protein p47phox. Another PX-domain protein, p40phox, is crucial for activating the complex that is normally dormant in resting cells. Naturally occurring mutations in the catalytic core, p67phox or p47phox have been found in CGD patients. An arginine to glutamine mutation in p47phox (the analogous residue in p40phox is marked by an asterisk in Fig. 5) has been identified in a subset of these patients. This mutation, which is located in the PX domain, eliminates phosphoinositide binding, thereby causally linking PX-domain function to the manifestation of CGD.


(Box 2)  |  Complex formation by sorting nexins

(Табл.1)  |  Properties of sorting nexins

Links

DATABASES
Swiss-Prot: Grd19 | Mvp1 | p40phox | p47phox | SNX1 | SNX2 | SNX3 | SNX4 | SNX5 | SNX6 | SNX9 | SNX13 | SNX15 | SNX17 | Vam7 | Vps5

FURTHER INFORMATION
Jack E. Dixon's laboratory | Expasy | SMART
Эндоцитоз интернализирует внеклеточные компоненты и участвует в различных путях передачи сигналов. После интернализациии CLATHRIN-COATED VESICLES, груз белков высвобождается на периферические EARLY ENDOSOMES и на сортирующие эндосомы. Белки в раннем эндосомном компартменте сортируются для высвобождения в одно из трех мест предназначения: на клеточную поверхность (для быстрого рециклинга); в LYSOSOMES (через LATE ENDOSOMES); или околоядерные эндосомы, которые включают TRANS-GOLGI NETWORK (TGN) (Рис. 1).
Семейство SORTING NEXIN (SNX) состоит из разных групп цитоплазматических и связанных с мембранами белков , переносимых через мембранные компартменты. Некоторые предполагаемые места действия SNXs у млекопитающих и дрожжей представлены на Рис. 1. Характерным признаком этого семейства белков является присутствие PX DOMAIN — последовательности приблизительно из 100–130 аминокислот, которые связываются с различными phosphatidylinositol phosphates (PtdInsPs), при этом потенциально нацеливают эти белки на специфические клеточные мембраны, которые богаты этими фосфолипидами (Рис. 1). Помимо PX domain, sorting nexins содержат различные мотивы для межбелковых взаимодействий, которые м. участовать в их субклеточной локализации или обеспечивают им способность формировать комплексы в определенных, богатых липидами мембранах. У людей идентифицировано 25 SNXs.

The sorting nexin family


Связь между SNX белками и внутриклеточным переносом (trafficking) рецепторов плазматических мембран постулирется из-за гомологии, обнаруживаемой между SNX1 и Mvp1, дрожжевым белком, содержащим PX-domain, который был изолирован как мультикопийный супрессор vacuolar sorting protein 1 (Vps1), который является членом семейства dynamin GTPase. Vps1 мутантные клетки перенаправляют перенос мембран, связанных с вакуолями, в плазматическую мембрану. Mvp1 взаимодействует с Vps1 на генетическом уровне, ко-локализуясь с Vps1 и сам необходим для эффективного высвобождения растворимых белков в вакуоли. Учитывая роль Mvp1 в направленн в вакуоли и двугибридные взаимодействия между SNX1 и внутриклеточнрой частью рецепторной тирозин киназы epidermal growth factor receptor (EGFR), SNX1, как полагают, участвует в направлении EGFR на лизосомную деградацию по эндоцитотическому пути. Др. PX-domain-cодержащие дрожжевые белки Vps5 и Vps17, участвуют в сортировке вакуолярных белков. Т.к. Vps5 является, как полагают, дрожжевым ортологом SNX1, то это наблюдение подтверждает, что SNXs участвует в membrane trafficking.
Поиск PX-domain-содержащих белков с помощью Simple Modular Architecture Research Tool (SMART) программы идентифицировано 25 предполагаемых sorting nexins у человека, а гомологи этих белков у ряда видов от дрожжей до Arabidopsis. Семейство SNX представлено белками, которые содержат очень мало гомологичных последовательностей за исключением законсервированного PX домена. На базе общих доменовых структур семейство подразделено на три подгруппы. SNX1, SNX2, SNX4, SNX5, SNX6, SNX7, SNX8, SNX15 и SNX16, все они имеют длинное С-терминальное расширение, которое содержит 1–3 COILED-COIL домена и м. участовать в гомо- и/или гетеро-олигомеризации с др. SNXs, а также в межбелковых взаимодействиях с non-SNX белками (Рис. 2). SNX3, SNX10, SNX11, SNX12, SNX22, SNX23 и SNX24 м.б. сгруппированы на базе того, что они содержат, по-видимому, только PX домен. Остальные sorting nexins содержат различные последовательности для межбелковых взаимодействий с (SH3, TPR), membrane targeting sequences (hydrophobic sequences, B41) или с G-protein регуляторными последовательностями (RGS, RA).

PX domains


Имеется несколько высоко законсервированных phosphoinositol-связывающих мотивов; сюда входят EPSIN AMINO (N)-TERMINAL HOMOLOGY (ENTH) домен, PLEXTRIN HOMOLOGY (PH) домен, FYVE (для Fab1/YOTB/Vac1/EEA1) домен и PX домен. Домен ENTH обнаруживается в некоторых белках, которые участвуют в эндоцитозе и организации цитоскелета, а ENTH домены epsin, adaptor protein 180 (AP180) и clathrin собираются в lymphoid myeloid leukaemia protein (CALM), чтобы избирательно взаимодействовать с phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). PH домен присутствует в различных белках, которые участвуют в передаче клеточных сигналов (PKB/Akt, PDK1), организации цитоскелета (spectrin, α-actinin), membrane trafficking (Vav, ARFP), а также как GTPases (dynamin). PH имеют ограниченную консервацию последовательностей, но зато обладают определенной законсервированной четвертичной структурой. В противоположность ENTH домену, PH домены обнаруживают широкий спектр PtdInsP-связывающей специфичности, которая включает phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), PtdIns(4,5)P2 and phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate (PtdIns(3,4)P2). Напротив, домен FYVE EARLY ENDOSOME AUTOANTIGEN 1 (EEA1) был впервые определен как последоваиельность, отвечающая за связывание исключительно phosphatidylinositol-3-phosphate (PtdIns(3)P). Все FYVE домены поддерживают эту связывающую специфичность.
PX домены были первоначально идентифицированы как законсервированный мотив в p40phox и p47phox субъединицах NADPH oxidase (phox) superoxide-generating complex нейтрофилов. Подобно PH доменам, PX домены обнаруживают ограниченную консервацию последовательностей и обладают широким кругом PtdInsP-связывающих специфичностей (Табл. 1). Помимо sorting nexins, PX обнаруживаются также в белках, которые участвуют в путях сигнальной трансдукции в клетках, таких как phospholipases D (PLD)1/2 и phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), и в дрожжевых белках, которые участвуют в почковании и клеточной полярности, таких как Bem1 и Bem3
Было предположено, что PX доменыe SNXs представлены отдельной субгруппой PX сверхсемейства, которая была обозначена как SNX-PX DOMAIN. BLAST поиск с помощью SNX-PX последщовательностей не выявил др. PX-domain-содержащих подсемейств. Кроме того филогенетический анализ PX доменов показал, что большинство SNX-PX доменов м.б. собрано в отдельную ветвь PX сверхсемейства (Рис. 3). PX домены PI3K, Bem2 и p40phox собраны в кластер, как это имеет место с PX доменами PLDs и Bem3 (Рис. 3). Только SNX27, клеточная функция котрого неизвестна, не образует кластера с др. SNXs. Итак, SNX-PX домены, по-видимому, используются независимо от др. PX доменов и , следовательно, м. обладать уникальной клеточной функцией.
На базе филогенетического анализа их PX доменов, SNX1, SNX2, SNX5, SNX6, SNX7, SNX9 и SNX18 сгруппированы с Vps5, дрожжевым белком, который участвует в vacuolar-TGN trafficking (Рис. 3). SNX1 и SNX2 обладают многочисленными идентичными последовательностями по всем своим аминокислотным последовательностям и обнаруживают существенное функиональное перекрывание. SNX5 и SNX6также обладают многочисленными идентичными последовательностями. SNX9 и SNX18 родственны др с др. потому что содержат N-terminal SH3 домены. Группа, которая содержит Grd19, SNX3, SNX11 и SNX12 (Рис. 3) не имеет распазнаваемых мотивов помимо PX домена. Grd19 является дрожжевым SNX, который участвует в сортировке белков из pre-vacuolar компартмента в TGN. Интересно установить, участвуют ли SNX3, SNX11 и SNX12 в сходной функции сортировки в клетках млекопитающих. Остальные SNXs разделены на 4 др. группы. Мало известно о клеточных функциях этих предполагаетмых SNXs.

The PX domain structure

Структура PX домена p40phox, соединяющаяся с PtdIns(3)P was solved недавно у становлено и показано, что она адоптирует новую складку, котрая состоит из трех β-sheets, упакованных напротив спирального субдомена, который состоит из четырех α-спиралей (α2, α3, α4 и α4'), 310 спирали и типа II polyproline спирали (PPII) (Рис. 4). N-терминальная α-спираль в этой структуре (α1) является не частью PX домена, но существенна для растворимой экспрессии изолированного PX домена. Рhosphoinositide 'headgroup' занимает один из углов кармана, стенки которого сфрмированы β3/α2-петлей, PPII/α3-петлей и N-терминальной половиной β2-нити и α3-cgbhfkb. JcnОстальная ть кармана заполнена хорошо ориентированными молекулами воды.

Conserved residues.
Arginine (Arg) остаток 58 (Рис. 4), законсервированный остаток β3/α2-петли, образует наиболее экстенсивные взаимодействия с D3 фосфвтоными связями PtdIns(3)P. Мутация этого остатка на glutamine (Gln) устраняетс связывание PtdIns(3)P in vitro и элиминирует точечный паттерн, который указывает на эндосомную локализацию p40phox in vivo. Присутствие щелочного аминокислотного остатка в этой позиции законсервировано в большинстве PX доменов (Рис.5), и законсервировано во всех PX доменах, которые связывают PtdIns(3)P, включая SNX3, SNX7, SNX16, Vam7, CISK и p47phox. PX домены, которые не содержат щелочной остаток в этой позиции, такие PX домен у PI3K-C2α, связывают PtdIns(4,5)P2. Это указывает на то, что щелочной остаток, аналогичный Arg58, м.б. показателем связывания PtdIns(3)P. Однако, PtdInsP-связывающая специфичность большинства PX доменов еще д.б. доказана.
Др. высоко законсервированный щелочной остаток в PX доменах, Arg105 (Рис. 4, 5), формирует водородные мостики с 4- и 5-OH половинки inositol. Эти взаимодействия также существенны для связывания PtdIns(3)P, т.к. мутация Arg105 на alanine (Ala)устраняет связывание фосфолипида. Интересным свойством этой структуры является то, что др. взаимодействия с мембраной вне headgroup-связывающего кармана м. ориентировать PX домен в отношении поверхности мембраны.
Tyrosine (Tyr) остаток 94 (Рис. 4, 5) взаимодействует гидрофобно с glycerol половинкой связи PtdIns(3)P. Гидрофобные остатки в этом регионе, который известен как 'membrane attachment loop', законсервированы в большинстве PX доменов, это указывает на то, что это м.б. общим свойством, присущим роли по связыванию PtdInsPs в липидном двуслое (обсуждение др. законсервированных остатков, участвующих в стабилизации связывания PtdIns(3)P см Рис. 5).

Conserved structural features.
Расположение SNX-PX доменов и схематическая вторичная структура p40phox показа на Рис. 5. Хотя немногие индивидуальные аминокислоты законсервированы среди SNX-PX доменов, анализ вторичных структур с использованием ProteinPredict компьютерной программы, предсказывает, что все SNX-PX домены образуют вторичные структуры, которые сходны с таковой p40phox.
По всему PX домену имеются участки гидрофобных и гидрофильных законсервированных остатоков. Мотив Arg-Arg-Hyd-Ser-(Asp,Glu)-Phe (Hyd, hydrophobic; Ser, serine; Asp, aspartic acid; Glu, glutamic acid; Phe, phenylalanine), который локализован в β3α2 области, высоко законсервирован и содержит щелочной остаток Arg58, который образует часть позитивно заряженного связывающего кармана в p40phox, и который взаимодействует с негативно заряженной фосфатной группой PtdIns(3)P. Др высоко законсервированный щелочной остаток в этой последовательности, Arg57, как предсказывается, м.б. phosphate ligand, но структура показывает, что это остаток разворачивается прочь от PtdIns(3)P-связывающего сайта. Вместо этого, он обладает витальной структурной функцией, т.к. формирует сеть водородных мостиков, которые стабилизируют уникальную складку PX домена. Мутация аналогичного остатка в p47phox вызывает chronic granulomatous disease (CGD) (Box 1). Законсервированный lysine (Lys) остаток, который идет непосредственно после Pro-X-X-Pro мотива (Pro, proline), и Arg105 присутствуют в α3-спирали , участвуя в связывающем кармане для фосфатных групп PtdIns(3)P.
Большинство SNXs также содержит Pro-обогащенные последовательности, которые расположены на С-конце α2-спирали (Рис.4, 5). Эта Hyd-Pro-X-X-Pro-X-(Lys,Arg) последовательность является потенциальным SH3-domain-связывающим мотивом, хотя насколько известно нет SH3-связывающих партнеров дл якакого-либо SNX-PX домена. Однако, SH3-доменовые взаимодействия с Pro-богатыми последовательностями являются принципиальными межбелковыми взаимодействиями между p40phox, p47phox, p67phox и NADPH оксидазными субъединицами. В отсутствие внеклеточных стимулов p47phox существует в неактиной конформации, которая соответствует внутримолекулярному взаимодействию между Pro-X-X-Pro мотивом в PX домене и его С-терминальным SH3 доменом. NMR структура этого PX домена, связанного с SH3 доменом, показывает, что связывание изменяет конформацию Pro-X-X-Pro петли и гидрофобных контактов между спиралями в структурной сердцевине. Высокого разрешения структура p47phox домена показала, что этот PX домен содержит два щелочных (basic) кармана, которые представляют два потенциальных сайта связывания фосфолипидов. Один сайт аналогичен p40phox PtdIns(3)P-связывающему сайту и связывает PtdIns(3,4)P2, тогда как др., который уникален для PX доменов p47phox и phospholipases D1 и D2, связывает анионные фосфолипиды, такие как phosphatidic кислота или phosphatidylserine. Показано, что эти два сайта являются сторого синергичными в связывании мембраны и показано, что в белке полной длины SH3–Pro-X-X-Pro взаимодействие затрагивает доступность кармана, связывающего фосфоинозитид PX-домена, для PtdInsP. Пока неизвестно, затрагивает ли связь p40phox Pro-X-X-Pro мотив со своим SH3 лигандом способность связывать PtdIns(3)P. Однако, такой сценарий открывает интригующую возможность, что взаимодействия SH3-домена м. действовать как переключатели, которые регулируют функцию PX домена.

Tertiary structure of the Vam7 PX domain.
Выяснена трехмерная структура PX домена Vam7, SNARE белка, который функционирует в vacuolar membrane trafficking у дрожжей, с помощью NMR спектроскопии. Vam7 состоит из N-терминального PX домена и С-терминального coiled-coil target-membrane (t)-SNARE мотива. Он локализуется специфически в мембране вакуоли как часть vacuolar SNARE комплекса за счет взаимодействий между его PX доменом и PtdIns(3)P и за счет взаимодействия его суперскурченного (coiled-coil) домена с Vam3. Показано, что PX домены обладают общей структурной сердцевиной, которая выстилает PtdInsP-связывающий карман, и что имеется имеется др. место мембранного прикрепления в гидрофобной петле, которая связывает Pro-X-X-Pro мотив с α3 (Рис. 5). Следовательно, способность к мембранному таргетирнгу Vam7 PX домена м. использовать и специфический, щелочной PtdInsP-связывающий карман и неспецифические гидрофобные взаимодействия между остатками в петле и мембраной. Показано, что мутация законервированных остатков в Vam7 PX домене вызывает локализацию Vam7 в цитоплазме. Следовательно, нельзя переоценивать важность PX домена для соответсвующего закрепления на мембраене, поскольку оно зависимт также от взаимодействия coiled-coil домена с Vam3.

Functions of sorting nexins in yeast


PtdInsPs, как известно, играют роль в сортировке грузов и формировании пузырьков, а PX-домен-содержащие белки - в связи с др. белками, которые содержат PtdInsP-связывающие модули — вероятно функционируют в качестве адапторов и/или сортировщиков грузов. По сравнению с SNXs млекопитающих, роль некоторых PX-домен-содержащих белков дрожжей в сортировке белков хорошо известна. В частности, дрожжевые белки Mvp1, Grd19, Vps5/Grd2 и Vps17 участвуют в переносе белков.
Vps5, дрожжевой гомолог SNX1 и SNX2, идентифицирован как белок, который ответственен за vacuolar trafficking. Дефектный Vps5 ведет к секреции гидролазы carboxypeptidase Y и неправильному высвобождению гидролазных рецепторов Vps10 в вакуоль. В нормальных условиях Vps10 связывает carboxypeptidase Y в TGN и переносит ее в pre-vacuolar эндосомы, где гидролаза диссоциирует. Гидролаза высвобождается в вакуоль, тогда как Vps10 возвращается в TGN для дальнейших раундов транспортации гидролазы. В дополнение к этой ступени рециклинга, Vps5 необходим также для сохранения энзимов, таких как dipeptidyl amino peptidase (DPAP) и Kex2 в позднем Golgi — обеспечивается это за счет удаления неправильно расположенных молекул из pre-vacuolar эндосом. Vps5 выполняют свою биологическую функцию путем сборки в 'retromer complex', который описан в Box 2.
Grd19 дрожжевой гомолог группы SNXs, включая SNX3, который содержит только PX домен. Это небольшой гидрофильный белок, который преимущественно локализуется в цитозоле. Однако, у дрожжей мутантный Vps, который накапливается в увеличенном pre-vacuolar компартменте, Grd19 накапливается тоже в этом компартменте. Grd19 является компонентом machinery возвращения,который функционирует путем непосредственного взаимодействия с цитозольными хвостами определенных резидентных TGN белков во время процесса сортировки в пре-вакуольном компартменте. Grd19 важен для возвращения Kex2 и A-ALP (двух Golgi-резидентных белков), но не Vps10, и , следовательно, не играет роли в сортировке растворимых энзимов в вакуоль.
Mvp1 является дрожжевым гомологом SNX8. Mvp1 выявлен как мультикопийный супрессор Vps1 мутантов, которые дефектны по переносу carboxypeptidase Y рецептора. Mvp1, вместе с Vps1, участвует в сортировке белков в позднем Golgi для высвобождения в вакуоль. Он м. также функционировать по возвращению белков из pre-vacuolar эндосом в поздний Golgi.

Functions of sorting nexins in humans


SNX1.
SNX1 был первым охарактеризованным SNX у млекопитающих. Выявлен в двугибридном скрининге при использовании киназного домена и LYSOSOMAL TARGETING SEQUENCE (tyrosine- или di-leucine-based мотивы) EGFR в качестве наживки. Часть SNX1, которая была выявлена в этом скриниге (С-терминальные coiled-coil последовательности), взаимодействует специфически с мотивом направления в лизосомы, Tyr-Leu-Val-Ile. Важно, что избыточная экспрессия SNX1 полной длины в клетках почек Африканской зеленой мартышки (CV1) заметно подавляет количество активированного EGFR на клеточной поверхности. Этот эффект высоко специфичен для избыточной экспрессии SNX1 и не меняется уровнями ERBB2 или platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) в этих клетках. Более того, избыточная экспрессия N-конца SNX1 (который включает PX домен) не затрагивает скорости лигандом индуцированного эндоцитоза EGFR, это указывает на то, что SNX1 не влияет на AP2 clathrin-coat комплекс, но скорее всего управляет переносом пузырьков и сортировкой белков в компартмент. Судьба эндоцитозированных мембранных белков, таких как EGFR, предопределяется при сортировке в эндосомы. Следовательно, SNX1 м.б. кандидатом на роль ENDOSOMAL RETENTION белка.
SNX1 является и ассоциированнм с мембраной и цитозольным, при этом он скорее всего существует в виде тетрамерного большого белкового комплекса (Табл. 1). Также как и дрожжевой гомолог Vps5, SNX1 ассоциирует с белками, которые образуют retromer комплекс — VPS26, VPS29 и VPS35. Неизвестен гомолог Vps17, который является частью retromer комплекса у дрожжей. Возможно, что SNX1 белковый комплекс м. ассоциировать обратимо с мембранами эндосомного комапартмента, причем покрывающими эти пузырьки. Возможно также, что SNX1 формирует комплексы с SNX2, т.к. эти белки ко-иммунопреципитируются. Показано, что SNX1 и SNX2 колокализуются в виде точкового паттерна окрашивания, который характерен для маркера EEA1 ранних эндосом. SNX1 взаимодействует также с SNX4, SNX6 и SNX15, но функциональное значение этих взаимодействий неизвестно. Однако, взаимодействие SNX1 с hepatocyte growth factor (HGF)-регулируемым тирозин-киназным субстратом ?) — FYVE-domain-содержащим белком, который локализуется в ранних эндосомах и является прекрасной мишенью для фосфорилирования с помощью различных рецепторов, включая и EGFR — имеет функциональные последствия. HRS и SNX1 конкурируют за один и тот же сайт связывания на EGFR, а избыточная экспрессия HRS ингибирует лигандом индуцированную деградацию EGFR, это указывает на то, что HRS м. модулировать перенос в лизосомы рецептора за счет секвестрирования SNX1.
SNX1 взаимодействует также с некоторыми др. членами семейства рецепторных тирозин киназ, включая PDGFR и insulin receptor (IR). Кроме того, SNX1 ко-иммунопреципитируется с линной формой рецептора лептина — цитокинового рецептора, который передает сигналы за счет активации Janus тирозин киназ — и transferrin receptors (TFR), которые являются рецепторами, которые постоянно интернализуются и подвергаются рециклингу (Табл. 1). Наконец, подавление G-protein-coupled protease-activated receptor-1 (PARS1) регулируется с помощью SNX1. Избыточная экспрессия С-конца SNX1 ведет к накоплению PARS1 в компартменте ранних эндосом вместо лизосом. Это указывает на то, что SNX1 участвует в сортировке PAR1 из ранних эндосом в лизосомы.
Ассоциация SNX1 с эндосомными мембранами нуждается в активности PI3K, это указывает на то, что D3 фосфат существенен для распознавания PtdInsP . Т.к. PtdIns(3)P хорошо известный липидный компонент эндосом и т.к. все дрожжевые PX домены распознают PtdIns(3)P, то наблюдение, что SNX1 PX домен специфически распознает PtdIns(3,4,5)P3 необычно, из-за того, что этот липид локализуется принципиально в плазматической мембране, где он образует ансамбль с PH-domain-содержащими белками. Подтверждено, что SNX1 соединяется с PtdIns(3,4,5)P3. Однако, одновременно было показано, что SNX1 соединяется и с PtdIns(3)P и PtdIns(3,5)P2 — но не с PtdIns(3,4,5)P3. Определена субклеточная локализация SNX1 в условиях, при которых уровни PtdIns(3,4,5)P3 в плазматической мембране существенно повышены. В этих условиях SNX1 неспособен ассоциировать с плазматической мембраной, тогда как контрольный PH-domain-содержащий белок оказывается строго ассоциированным с плазматической мембраной. Эти результаты указывают на то, что липид-связывающая специфичность SNXs д. устанавливаться в каждом случае отдельно.
В дополнение к липид-связывающей активности PX домен м. участвовать в гомо- и гетеро-олигомеризации SNX1 и SNX2. Однако роль PX доменов в межбелковых взаимодействиях остается неизвестной. Предполагается. что 'низкое сродство' PX доменов обеспечивает специфичность локализации, но что др. targeting домены необходимы для управления ассоциации с мембраной. В самом деле, большинство PX-domain-содержащих белков ассоциированы с большими белковыми комплексами. В случае SNX1, мутация или в PX домене или в coiled-coil С-конце устраняет везикулярную локализацию, это ведет к заключению, что и PX и coiled-coil домены необходимы для правильной внутриклеточной локализации. Vam7 имеет сходные потребности для соотв. мембранного таргетинга. Vam7 PX домен сам по себе направляет белок в мембраны эндосом и вакуоли. Сoiled-coil домен Vam7 необходим, чтобы ограничить его нормальной vacuolar локализацией.
Мыши без Snx1 aи/или Snx2 жизнеспособны и фертильны, но развитие Snx1-/-/Snx2-/- эмбрионов арестовывается в средине беременности, это указывает на то, что Snx1 и Snx2 функционально перекрываются и обеспечивают важную функцию в эмбриогенезе. Фенотип двойных нокаутных мышей сходен с таковым у эмбрионов с отсутствием Hβ58, мышиного гомолога Vps26, это указывает на то, что retromer комплекс млекопитающих структурно законсервирован в сравнении с дрожжами.

SNX2.
SNX2 b SNX1 обладают 63% идентичными последовательностями и колокализуются в клетках. Подобно SNX1, SNX2 м. олигомеризоваться с самим собой и формировать гетеромерные комплексы с SNX1, SNX4 и белками retromer комплекса. Аналогично SNX1, и SNX2 и SNX4 взаимодействуют в варьирующей степени с некоторыми рецепторами, включая EGFR, PDGFR, IR и длинную форму лептинового рецептора. В отличие от SNX1, однако, SNX2 и SNX4 не взаимодействует с TFR, это указывает на дифференциальную связывающую специфичность (Табл. 1). Несмотря на сходство их PX доменов (70%), SNX2 PX домен связывается преимущественно с PtdIns(3)P, но не с PtdIns(3,4,5)P3.

SNX3.
SNX3 и родственные SNXs являются небольшими гидрофильными белками, у которых мало последовательностей помимо PX домена. Из-за отсутствия coiled-coil доменов, SNX3 не образует гетеромерных комплексов с др. SNXs. Показано, что SNX3 PX домен почти исключительно взаимодействует с PtdIns(3)P. Это подтверждается его клеточным распределением в ранних и околоядерных эндосомах, где они колокализхуются с EEA1 и TFR, соотв. Избыточная экспрессия SNX3 ведет к экспансии tubular-vesicular структур, которые характерны для ранних, рециклинг и поздних эндосом. В согласии с этим избыточная экспрессия SNX3 ведет к задержке или подавлению транспорта EGFR в лизосомы, тогда как ингибирование функции SNX3 предупреждает транспорт интернализованных TFR антител из ранних в RECYCLING ENDOSOMES. "nb Эти льтаты указывают на то, что SNX3 участвует в membrane trafficking мз ранних эндосом в recycling эндосомы. Неспособность SNX3 взаимодействовать с др. SNXs открывает интригующую возможность, что SNX3 м. ограничивать функцию др. SNXs за счет связывания PtdIns(3)P в критических сайтах мембран, предупреждая тем самым связывание др. SNXs и сопровождающих их белковвых партнеров с этими сайтами.

SNX5.
SNX5 соединяется с Fanconi anaemia complementation group A protein (FANCA). Fanconi anaemia (FA) - это аутосомно-рецессивный синдром, характеризующийся прогрессивной потерей костного мозга, некоторыми аномалиями развития и предрасположенностью к озлокачествлению. FA генетически гетерогенна — известно, по крайней мере, 8 комплементационных групп (от FA-A до FA-H) — а FANCA является геном, который мутанте при FA-A. Как было установлено, белок FANCA взаимодействует с SNX5 и ко-иммунопреципитируется в клетках, которые избыточно экспрессируют оба белка. Избыточная экспрессия SNX5 в клетках кроме того вызывает повышение FANCA, но значение этого неизвестно. SNX5 обладает 66% идентичных аминокислотных последовательностей с SNX6 и оба содержат инсерцию в своем PX домене (Рис. 5), это указывает на то, что оба SNXs м. выполнять сходную фугкцию.

SNX6.
Установлено, что SNX6 ассоциирует с рецепторными серин/треонин киназами, создавая TRANSFORMING GROWTH FACTOR (TGF)-β FAMILY OF RECEPTORS. SNX6 впервые был выделен как партнер для SMAD1,он взаимодействует строго с ALK5, средне с ALK6 (ALK5 и ALK6 являются типа I рецепторами) и строго сh TβRII kinase dead (KD) рецепторами (типа II рецепторами) (Табл. 1). SNX6 локализован в цитоплазме, предполагается. что он направляет белки в TGN. Т.к. SNX6 гетеро-олигомеризуется с SNX1, SNX2 и SNX4, то ассоциации этих SNXs с рецепторами TGF-β семейства проверялись. SNX1 слабо ассоциирует с ALK4, а SNX2 ассоциирует средне с ALK4 и ALK5, но строго с TβRII KD рецепторами. SNX4 ассоциирует слабо с ALK5 и ALK6, и сильно с TβRII KD рецепторами . SNX6 способен также взаимодействовать с рецепторными тирозин кинразами, а именно с EGFR, PDGFR, IR и длинной формой лептинового рецептора (Табл. 1). На функциональном уровне, избыточная экспрессия SNX6 ингибирует TGF-β и передачу сигналов активина в клетках HepG2. SNX6, который известен также как TFAF2 (TRAF4-associated factor 2), взаимодействует с PIM1, который является прото-онкогеном с serine/threonine киназной активностью. SNX6 взаимодействует с PIM1, используя его N-терминальные последовательности, которые содержат PX домен. Это та самая область, которая взаимодействует с рецепторами TGF-β семейства. В этом случае coiled-coil порследовательности не участвуют существенно в этих межбелковых взаимодействиях. Ассоциация PIM1 с SNX6 обусловливает локализацию SNX6 в ядро. Кроме того, PIM1 м. фосфорилировать SNX6. Однако, функциональное значение фосфорилирования SNX6 неясно, т.к. kinase-неактивный PIM1 мутант все еще транслоцирует SNX6 в ядро.

SNX9.
SNX9, который известен также как SH3PX1, связывается преимущественно с предшественником, но не с processed формами metalloproteases путем взаимодействия с их SH3 доменом, богатыми Pro последовательностями, которые присутствуют в цитоплазматических хвостах металлопротеиназ. Хотя и локализуется преимущественно в цитоплазме, SNX9 взаимодействует с белками, которые ассоциированы с ямками, покрытыми клатрином, такими как Cdc42-associated tyrosine kinase 2 (ACK2), которая ассоциирует с клатрином и μ-субъединицей AP2 clathrin-coat protein комплексом (известным как AP-50 у Drosophila melanogaster). У Drosophila, SNX9 был изолирован как член белкового комплекса, который был очищен из S2 cклеток с использованием SH2 домена Dock, Drosophila ортологом SH3/SH2 адапторного белка NCK у млекопитающих. Drosophila Ack также был изолирован в этом комплексе и как было установлено ко-иммунопреципитируется с и фосфорилирует SNX9 . Все это указывает на то, что SNX9 м. функционировать с clathrin-coat адапторными белками в процессе эндоцитоза. В клетках млекопитающих SNX9 регулирует эндоцитоз EGFR вместе с ACK2, a лигандом-индуцированная стимуляция EGFR ведет к фосфорилированию SNX9 с помлощью ACK2. У Drosophila, Ack фосфорилирует SNX9 по Tyr остатку в SH3 домене. Фосфорилирование этого Tyr остатка уменьшает взаимодействие SNX9 с Wiskott–Aldrich syndrome protein (WASP), так как тем самым дает возможность ассоциировать с Dock. Члены семейства WASP являются мультидоменовыми белками, которые функционируют как поддержка (scaffolds), которая сводит вместе компоненты путей сигнальной трнсдукции с клеточной machinery, которая способствует полимеризации актина и реорганизации микрофиламент. Следовательно, SNX9 м. участвовать в сочетанных изменениях актинового цитоскелета с процессами эндоцитоза с участием покрытых клатрином пузырьков.

SNX13.
SNX13 идентифицирован как кандидат в белки, которые содержат RGS домены и был назван RGS-PX1. RGS домены затрагивают клеточную сигнальную трансдукцию, которая запускается с помощью seven-трансмембранных G-PROTEIN-COUPLED RECEPTORS (GPCRs). GPCRs передает сигналы с nucleotide exchange of guanine на α-субъединице гетеротримерных G белков, которые вызывают конверсию неактивного guanosine diphosphate (GDP)-связанной α-субъединицы в активированную GTP-связанную форму. RGS домены облегчают конверсию активного белка обратно в неактивную GDP-связанную форму за счет потенциации intrinsic GTPase активности, которая присутствует в α-субъединице. SNX13 первый RGS, который способствует гидролизу GTP на Gαs,модулируя тем самым Gαs активность в клетках. β2-adrenergic htwtgnjhs (β2AR) передают сигналы через Gαs, это вызывает активацию adenylate cyclase, причем увеличиваются уровни cAMP в клетках. Воздействие на HEK293 клетки β2AR агониста isoproterenol увеличивает уровень клеточного cAMP, тогда как экспрессия RGS домена SNX13 снижает это увеличение ~ на 70%. Домен PX у SNX13 связывает преимущественно PtdIns(3)P и PtdIns(5)P, но слабо ассоциирует с PtdIns(3,5)P2 и PtdIns(4)P (Табл.1). Показано, что RGS-PX1 колокализуется с EEA1 в ранних эндосомах COS-7 клеток. Направление SNX13 в эндосомы указывает на то, что он м. функционировать как SNX. В самом деле, избыточная экспрессия SNX13 ингибирует деградацию EGF рецепторов, эффект, противоположный тому, который наблюдается при избыточной экспрессии SNX1. Экспрессия SNX13 м. регулировать способность β2AR передавать сигналы из этого компартмента. Активированный β2AR проходит цикл через эндосомы, так что присутствие SNX13 iв эндосомах м.б. важным для ослабления активности рецепторов в этом клеточном компартменте.

SNX15.
PX домен SNX15 взаимодействует с PDGF рецептором и это взаимодействие независит от состояния активации рецептора. Молекулярные детали этого взаимодействия не установлены. Избыточная экспрессия SNX15 негативно влияет на интернализацию и деградацию PDGF и transferrin рецепторов и нарушает пост-трансляционный процессинг IR и предшественников hepatocyte growth factor (HGF) рецепторов. И IR и предшественники HGF рецепторов являются субстратами для эндопротеазы furin. Furin располагается преимущественно в TGN, но постоянно перемещается из TGN в пазматическую мембрану и возвращается в TGN посредством sorting/recycling или поздних эндосом. Избыточная экспрессия SNX15 меняет морфологию некоторых эндосомных компартментов, при этом меняется постоянная локализация фурина, это обусловлено задержкой процессинга некоторых субстратов фурина. Все это указывает на то, что SNX15 играет роль в проессах переноса белков с помощью эндоцитотического пути и TGN.

SNX17.
SNX17 выделен благодаря своей способности взаимодействовать с P-selectin. P-selectin является молекулой клеточной адгезии, которая находится в тромбоцитах и эндотелиальных клетках, которые обеспечивают связывание лейкоцитов. Они сохраняются в секреторных гранулах и транспортируются в плазматическую мембрану после клеточной активации. Он быстро интернализуется и затем или возвращается или деградирует. SNX17 соединение с P-selectin не нуждается в его PX домене, но последовательности, которые участвуют в этом связывании неизвемстны. Подобно др. SNXs, SNX17 локализуется в основном в цитоплазме в виде точковых мембьранных структур. Участие SNX17 в переносе P-selectin неизвестно. SNX17 соединяется с внутриклеточным доменом некоторых членов семейства low-density lipoprotein receptor (LDLR), включая LDLR, VLDLR, APOER2 и LDLR-родственные белки. Избыточная экспрессия SNX17 в этом случае усиливает скорость эндоцитоза LDLR.

Summary and future investigations


In summary, SNXs are hydrophilic molecules that are localized in the cytoplasm and have the potential for membrane association either through their lipid-binding PX domains or through protein–protein interactions with membrane-associated protein complexes. Indeed, several of the SNXs require several targeting motifs for their appropriate cellular localization. In almost every case studied, mammalian SNXs can be shown to have a role in protein sorting (Рис. 6), with the most commonly used experimental model being plasma-membrane receptor endocytosis and sorting through the endosomal pathway. However, it is equally probable that SNXs sort vesicles that are not derived from the plasma membrane, and have a function in the accurate targeting of these vesicles and their cargo. This scenario has been studied extensively in the case of the yeast SNXs (Рис. 6). It will be of interest to 'sort out' the various functions of the SNXs in cells and to determine if they have specialized or generalized roles in protein trafficking. Much work remains to be done in this area as the specific lipid- and protein-binding abilities of the SNXs have yet to be characterized. Indeed, whether lipid and protein binding are mutually exclusive is not known.
The cellular regulation of the SNXs has not yet been addressed. In the case of p47phox, serine and threonine phosphorylation is important for this protein to be able to form an active NADPH oxidase complex. So far, there have been no reports on the significance of serine/threonine phosphorylation in SNX function. Although, SNX9 tyrosine phosphorylation by ACK, which results in a switch in its protein–protein interaction partners, might have important functional consequences. The cellular regulation of the SNXs and their importance in the convergence of membrane trafficking and signal transduction are exciting areas for future studies.
Сайт создан в системе uCoz