Microtubule plus-end-tracking proteins: mechanisms and functions  and Casper C HoogenraadCurrent Opinion in Cell Biology , February 2005, Pages 47-54 | |
|
Microtubule plus-end-tracking proteins (+TIPs) являются смешанной группой молекул, которые характеризуются динамическим накоплением на дистальных концах растущих микротрубочек. Специфическое связывание с растущими кончиками микротрубочек сопровождается с быстрым отсоединением от более старой решетки (lattice), транспортом, направленным к плюс-концу и ассоциацией с др. +TIPs, всё это может вносить вклад в локализацию этих белков. +TIPs действуют в основном как факторы, стабилизирующие микротрубочки, и в то же самое время часто связывают концы микротрубочек с различными клеточными структурами, такими как клеточный кортекс или кинетохоры. Регуляция активности +TIPs оказывает выраженные эффекты на форму сети микротрубочек и играет существенную роль в делениях, подвижности клеток и морфогенезе.
Рис.1. | Figure 1. Examples of +TIP localisation in interphase cells. (a) Immunostaining of a CHO-K1 cell for tubulin (green), CLIP-170/115 (blue) and EB1 (red). CLIPs and EB1 mark the growing ends of MTs. EB1 is also present at the centrosome. (Image courtesy of Y. Komarova.) (b) Immunostaining of two S. pombe cells for Mal3p (green) and MTs (red). MT network in interphase S. pombe cells is represented by several MT bundles, which overlap with their minus ends in the middle part of the cell. Mal3p is localized to these regions of overlap and to the ends of growing MT bundles. Mal3p-positive particles are also present along the MT bundles. Some of them correspond to the Mal3p-positive tips of growing MTs, which are shorter than the rest of the MT bundle and cannot be resolved from adjacent MTs by tubulin staining. Other particles represent as yet uncharacterized Mal3-containig granules, moving towards MT minus ends18,21. (Image courtesy of KE Busch and D Brunner.) Рис.1. | Figure 2. +TIP interaction map. Vertebrate, Drosophila, S. cerevisiae, S. pombe and Dictyostelium +TIP homologues are indicated by boxes. Interactions, demonstrated to be direct, are shown by solid lines, and interactions, demonstrated only by yeast-two hybrid assays and/or co-immunoprecipitations from crude cell lysates, are shown by broken lines. The references to papers, describing particular interactions, are indicated. The double-headed arrow indicates the interaction between dynein and dynactin complexes, which is supported by a large body of data, not reviewed here 63-70.. | |
Table 1.Main groups of +TIPs from different organisms and their structure.
Vertebrate protein Homologues Structure CLIP-170/CLIP-115 D-CLIP-190 (Dm); Bik1p (Sc); Tip1p (Sp) Dynactina (p150Glued) Glued (Dm); Dnc-1 (Ce); Nip100p (Sc); Ssm4p (Sp); NudM (An) EB1,2,3 EB1 (Dm); DdEB1 (Dd); Bim1p (Sc); Mal3p (Sp) CLASP1,2 MAST/orbit (Dm); Cls-2/R107.6 (Ce); Stu1p (Sc) LIS1 Lis1 (Dm); Lis-1 (Ce); Pac1p (Sc); NudF (An) Dyneina (Dynein HC) (several isoforms) Dhc64C (Dm); Dhc-1 (Ce); DHC (Dd); Dyn1 (Sc); Dhc1 (Sp); NudA (An) APC, APC2/APCL dAPC1, E-APC/dAPC2 (Dm); apr-1(Ce); Kar9 (Sc)b ACF7, BPAG1 Shot/Kakapo (Dm); vab10 (Ce) XMAP215/ChTOGc Msps (Dm); ZYG-9 (Ce); DdCP224 (Dd); Stu2p (Sc); Dis1p, Alp14p (Sp) Fission yeast protein Homologues Structure Tea1p Tea2p Kip2p (Sc)
Представлены основные группы +TIPs у позвоночных. Для групп, не имеющих гомологов у позвоночных, представлены белки из делящихся дрожжей. Гомологи, для которых не опубликована информация за исключением последовательностей, доступны, но не включены в список. Структурные мотивы для каждого белка проиллюстрированы в диаграммах (из-за сильных различий в размерах, белки представлены не в единой шкале). Стрелки указывают на белковых партнёров, которые связываются непосредственно со специфическими доменами. Если связывающий домен неизвестен, то использовались головки стрелок. Следующие белковые последовательности были использованы на схемах: CLIP-170 (NP_002947), p150Glued (NP_004073), EB1 (NP_036457), CLASP1 (NP_056097), LIS1 (NP_000421), Dynein Heavy Chain 1 (NP_001367), APC (NP_000029), ACF7/MACF1 (NP_149033), ch-TOG (NP_055571), Tea1p (NP_5888351), Tea2p (CAA22353).aДля dynein и dynactin, белковых комплексов, состоящих из множественных субъединиц, показаны только крупные MT-связывающие субъединицы. bAPC и KAR9 соединяются с членами семейств EB1 и Bim1p, соотв. и могут иметь некоторые сходные функции; однако, они имеют очень ограниченную степень сходства. c Показаны дрожжевые аналоги XMAP215, Stu2p, и их Dictyostelium и Drosophila гомологи, локализующиеся на MT плюс концах27,30,31; хотя их поседение может быть не одинаковым с XMAP215. An: Aspergillus nidulans; Ce: Caenorhabditis elegans; Dd: Dictyostelium discoideum; Dm: Drosophila melanogaster; Sc: Saccharomyces cerevisiae; Sp: Schizosaccharomyces pombe.
Трассировка (tracking) плюс-конца может происходить как результат специфического присоединения белков к только что полимеризованному кончику MT, купированному с его диссоциацией с более старой части MT. Это может быть также обусловлено с помощью транспорта, направленного на плюс-конец MT, или ассоциацией белков с др. +TIPs ('hitchhiking', 4,5). Первый механизм (часто называемый 'treadmilling', хотя этот термин лучше подходит к описанию скольжения MT вдоль стационарной структуры) приводит в результате к временной концентрации белков на растущем коанце MT, где белки остаются стационарными в отношении решетки (lattice) MT . Используя флюоресцентную speckle микроскопию, этот механизм был продемонстрирован для CLIP-170 и EB16,7. Молекулярная основа этого процесса остаётся в основном неясной. Для CLIP-170 была предположена совместная сборка вместе с тубулиновыми димерами или олигомерами вместе с быстрым высвобождением от стенки MT [8]. Или белки могут обладать повышенным сродством к специфической структуре полимеризующегося конца MT, такие как тубулиновые покрытия или GTP шапочка (rev. 1,2). Это может быть верно для EB1, т.к., хотя он и накапливается преимущественно на MT концах, он диссоциирует от только что полимеризовавшегося кончика и старой укладки с такой же скоростью [7].Накопление на плюс конце +TIPs может быть обусловлено их преимущественной диссоциацией от более старых частей MT, возможно в результате их фосфорилирования с помощью MT-связанной киназы. Хотя и привлекательна, но эта теория не получила ещё солидного подтверждения, т.к. знания о +TIP-управляемых киназах остаются фрагментарными. Опухолевые супрессорные белки APC и CLASP1/2 являются мишенями для GSK3?, которая редуцирует их сродство к MTs и может регулировать их предпочтительную ассоциацию с MT концами в определенных областях клеток, таких как ведущие края подвижных клеток9-11. Ассоциация крупной субъединицы dynactin, p150Glued, с MTs негативно регулируется с помощью protein kinase A [12], хотя это свойство, по-видимому, ограничено субнабором p150Glued сплайсинг-форм [13]. CLIP-170 может быть фосфорилирован с помощью чувствительной к rapamycin киназы mTOR [14]. Неожиданно, ингибирование mTOR уменьшает связывание CLIP-170 с MTs. Эта находка может быть объяснена наблюдением того, что CLIP-170 может переключаться между упакованной, аутоингибирующей конформацией и расширенной формой, которая открыта для связывания MT [15]. Возможно, что фосфорилирование mTOR способствует ассоциации CLIP-170's с MTs путем стабилизации их в 'открытой' конформации. Необходимо подчеркнуть, что постольку, поскольку не была проведена проверка цикла phosphorylation-dephosphorylation, то в действительности скорее накопление на плюс конце, чем регуляция всего пула определенных +TIP доступны для взаимодействия с MTs.Транспорт, направленный на плюс-конец MT, др. механизм локализации +TIP, привлек много внимания в последних исследованиях почкующихся и делящихся дрожжей. Элегантные генетические и imaging эксперименты убедительно продемонстрировали, что дрожжевые гомологи CLIP-170, Bik1p и Tip1p, продвигаются к плюс концам MTs посредством действия кинезиновых моторов (Kip2p и Tea2p, соотв.)16-18. У Saccharomyces cerevisiae уровни Kip2p kinesin достигают пика во время митоза; и как результат доставка на конец MT и активность по стабилизации MT у Bik1p была выше в митотических, чем в интерфазных клетках [17]. У филаментозного грибка Aspergillus nidulans накопление к минус-концу MT направленного мотора dynein на кончиках MT зависит от действия конвенционного кинезина [19]. В клетках млекопитающих доказательства для базирующейся на моторных белках локализации +TIP пока касаются только одного примера - транспорта APC с помощью kinesin II [20].Распределение каждого индивидуального +TIP, по-видимому, предопределяется взаимодействиями с др. +TIPs. Напр., гомолог Schizosaccharomyces pombe CLIP-170, Tip1p, транспортируется на плюс конец с помощью Tea2p kinesin, но его накопление на MT конце также зависит от EB1 гомолога Mal3p18,21. Сходная последовательность событий наблюдается для APC, который помимо того, что транспортируется с помощью kinesin II, может также ассоциировать с кончиками MT путем связывания с EB1 [22]. Анализ взаимодействий между +TIPs выявил сложную сеть (Figure 2). Взаимное сродство +TIPs др. к др. скорее всего вносит вклад в их концентрацию на кончиках MT. Т.к. большинство +TIPs может ассоциировать с MTs непосредственно, то возможно, что действительные взаимодействия между ними в основном имеют место в контексте связывания MT.
Помимо кооперативного связывания, распределение +TIP ,по-видимому, зависит от конкуренции за сайты связывания на MTs. Напр., CLIP-115 и CLIP-170 имеют очень сходные MT-связывающие домены (Table 1), и в CLIP-115-нокаутных клетках связывание CLIP-170 с кончиками MT усиливается [23].Из-за сложности взаимодействий между +TIPs, возникает вопрос, может ли любой из этих белков быть способным накапливаться на плюс конце в отсутствие др. +TIPs. Так, белки из семейства EB являются наилучшими кандидатами обладать такой способностью: у S. pombe, Mal3p может соединяться с растущими MTs в отсутствие Tip1p и Tea2p, двумя др. наиболее важными +TIPs в этой системе18,21. У млекопитающих, APC, ACF7, dynactin, CLASPs и CLIPs могут быть удалtys с плюс концов, не оказывая при этом влияния на накопление на плюс конце EB19,24-26.Четкий ответ на этот вопрос может быть получен только после реконструкции связывания с плюс концом +TIPs при использовании системы in vitro с очищенными компонентами. Пока это достигнуто только для Stu2p (дрожжевого гомолога XMAP215) [27]. Предпочтительное связывание с кончиками MT in vitro наблюдалось также для гомолога XMAP215 млекопитающих, ch-TOG [28]. Stu2 распознаёт концы MT независимо от их динамичного статуса: он соединятся с плюс концами стабилизированных taxol MTs, причём др. +TIPs, протестированные в этих условиях, соединялись со всей укладкой MT7,8. Stu2p отличается также от др. +TIPs тем, что является MT-дестаблизирующим скорее, чем MT-стабилизирующим белком ([27]; см. [29] в отношении обсуждения). Необходимо также заметить, т.к. XMAP215 аналоги у D. melanogaster и D. discoideum локализуются на MT концах30-32, тогда как XMAP215, по-видимому, связывается вдоль всей клеточной MT и не может быть настоящим +TIP [33].Несмотря на существование существенной эволюционной консервации между разными +TIPs, выраженные различия между системами не следует недооценивать. Напр., в то время как S. cerevisiae Bik1p присутствует и на растущем и укорачивающемся конце MTs [17], его гомологи у млекопитающих CLIP-170 и у S. pombe Tip1p не может быть выявлены на концах деполимеризующихся MTs21,34. Это может быть связано с тем, что в отличие от S. pombe Tip1p, Bik1p не нуждаются в EB1 гомологах для накопления на плюс-концах [17]. С др. стороны, в противоположность своим гомологам у дрожжей CLIP-170 млекопитающих, по-видимому, не нуждается в кинезине для достижения кончиков MT; это указывает на то, что молекулярные механизмы, управляющими накоплением на кончиках MT этого семейства белков может варьировать у разных модельных организмов.
Role of +TIPs in microtubule stabilisation and capture
Путём связывания MT концов, +TIPs могут влиять на структуру и доступность MT's для взаимодействия с др. белками. Следовательно, большинство +TIPs играет роль в регуляции динамики MT. Функция многих +TIPs связана со стабилизацией MT. MTs могут быть стабилизированы динамически (с помощью редукции частоты катастроф или обеспечения повторных восстановлений) или за счет того, что отловлены в paused состоянии. Необходимо подчеркнуть, что в некоторых случаях кажущиеся паузы могут в действительности представлять собой очень короткие чередующиеся взрывы роста и укорочения с амплитудами ниже разрешающей способности светового микроскопа.Белки семейства CLIP-170 чётко участвуют в стабилизации MT17,26,35, действуя как anti-catastrophe [35] или восстанавливающие факторы [26]. Кроме того, CLIP-170 и его гомологи могут способствовать отлавливанию микротрубочек кортикальными сайтами посредством прямого взаимодействия с dynein-dynactin15,36,37.Др. +TIPs, такие как APC, CLASPs и ACF7, играют сходную роль в кортикальном отлавливании и стабилизации возможно благодаря взаимодействиям с актиновым цитоскелетом или плазматической мембраной. CLASP1/2, APC (возможно в комплексе с EB1 и mDia), ACF7 (spectraplakin) и CLIP-170 (в комплексе с Rac1/Cdc42 эффекторе IQGAP), как было показано, стабилизируют MTs на ведущем крае подвижных клеток9,25,38-45. Short stop и dAPC1 кооперируются в организации сети MT в мешце-сухожильных соединениях личинок мух [46]. CLASP/Orbit/MAST, APC, CLIP-170 и dynein/dynactin/LIS1 локализуются на кинетохорах митотических клеток и скорее всего участвуют в регуляции соединений MT-kinetochore и/или динамики кинетохорных волокон47-52. Т.к. эти белки в основном анализировались в отдельных исследованиях и часто в разных экспериментальных системах, то трудно предсказать, будут ли они участвовать синергично, взаимоисключающим образом или с помощью перекрывающихся путей, вопрос, который ждет своего разрешения.Интересно, что APC млекопитающих, Drosophila spectraplakin, Short stop и CLASPs все соединяются с EB122,46; A Akhmanova, unpublished), a возможность взаимодействия CLIP-170-EB1 выявляется с помощью прямого связывания их гомологов у делящихся дрожжей [21]. Следовательно, рекрутирование EB1 может быть важной частью механизма стабилизации MT. В соответствии с этой идеей, небольшие количества EB1 присутствуют на кончиках стабильных, detyrosinated MTs [38]. EB1 рекрутируется также на полимеризующиеся MTs на кинетохорах, когда они движутся прочь от полюсов [53]. В согласии с их ролью в стабилизации MT, белки семейства EB1 способствуют росту MT и супрессируют катастрофы у делящихся дрожжей и в экстрактах из Xenopus7,21. В кажущемся противоречии, EB1 гомологи у почкующихся дрожжей и у Drosophila, по-видимому, усиливают динамичность MT и подавляют паузы54,55. Однако, также и у почкующихся дрожжей EB1 гомолог Bim1p составляет часть кухни по кортикальному отлавливанию, связыванию астральных MTs с актиновыми волокнами посредством родственного APC белка Kar956-58).Действие кортикально закрепленных моторов на кончики MT может создавать тянущие силы, вызывающие реориентацию сети MT, важного события во время миграции клеток и позиционирования митотического веретена (rev. 59,60). Сходные взаимодействия между кончиками MT и моторами, локализованными на небольших структурах, таких как пузырьки, могут обусловливать транслокации этих структур вдоль MTs. Следовательно, MT плюс концы могут служить как места загрузки грузов для транспорта их в направлении минус конца [12] или для высвобождения груза в определенных клеточных регионах, как это описано для Tea1p, регулятора клеточной полярности у S. pombe (см. [61]).
Conclusions and future directions
+TIPs are evolutionarily conserved proteins that concentrate at the MT plus ends, where they mostly promote MT stabilisation and the interaction of MTs with different cellular components. In addition, many +TIPs are present at the centrosomes or spindle pole bodies and may have important roles in anchoring and stabilising MT minus ends or even in MT nucleation (см. [62] for discussion). This issue has received comparatively little attention and requires further study.An understanding of the mechanism of +TIP binding to MTs will require reconstruction of their behaviour in vitro. The analysis of their function, on the other hand, warrants an approach where the activities of different proteins are manipulated simultaneously. In particular, the functional interplay between stabilising +TIPs and MT depolymerising proteins should be explored, since the balance of these factors is the likely determinant of MT dynamics and the shape of the MT network in living cells.
