Рис.2. | A: Schematic diagram of the qBrn-1 cDNA and probes (a-c) used in Northern blot hybridization and in situ hybridization. The open reading frame is boxed и the POU-specific domain (POUSD) and POU homeodomain (POUHD) are indicated by colored boxes. B: Northern blot analyses of qBrn-1 mRNA in embryonic day 5 (E5) quail embryos (lanes 1-3) and in hearts of quails (2 days after hatching, lane 4). Expression of qBrn-1 in E5 embryos was detected by probe a, b и c, respectively. Total mRNA from hearts in lane 4 was used as the negative control. Molecular weight markers are indicated.
Expression of qBrn-1 and qBrn-2 in the CNS
Паттерны экспрессии qBrn-1 и qBrn-2 исследовали с помощью исследования in situ гибридизации целиком эмбрионов перепела со ст. Hamburger and Hamilton (HH) 3 до HH стадии 25 (Hamburger and Hamilton,[1951]).
Не было выявлено транскриптов
qBrn-2 у эмбрионов перепела до ст. HH 6, тогда как очень слабый сигнал qBrn-1 получен из передней части нервной пластинки на ст. HH 5 с началом нейруляции (data not shown). На ст. HH 6, когда нервная пластинка только что сформировалась, строгая экспрессиия
qBrn-1 обнаруживается в головной складке и нервной пластинке с пиком мечения в первичной полоске (Fig. 3A). На этой ст. транскрипты
qBrn-2 также начинают четко обнаруживаться в нервной пластинке, но всё ещё отсутствуют в головной складке и едва обнаруживаются в первичной полоске (Fig. 3A). На ст. HH 7+, когда нервная трубка ещё не закрылась в области головной складки, оба сигнала qBrn-1 и qBrn-2 четко обнаруживаются в нервных складках, а qBrn-2 кроме того обнаруживается в задней части нервной пластинки и сомитах (Fig. 3B,B). После слияния нервных складок, экспрессия
qBrn-1 и qBrn-2 распространяется более каудально и покрывает всю нервную трубку на ст. HH 9 (Fig. 3C,C). A сигнал qBrn-1 интенсифицируется в переденем и среднем мозге (Fig. 3C), в то время как уровень экспрессии
qBrn-2 проявляется в переднем низким, а в заднем высоким образом, несмотря на четкое мечение будущей воронки (infundibulum) (Fig. 3C). Экспрессия
qBrn-2 в области воронки указывает на его роль в нейроэндокринном развитии, так как и его Brn-2 гомолога (Nakai et al.,[1995]; Schonemann et al.,[1995]). На HH 10, наблюдается драматическое увеличение экспрессии
qBrn-1 в спинном мозге, тогда как в переди высокий сигнал
qBrn-1 четко ограничивается средним мозгом и соседними областями переднего и заднего мозга. В др. областях переднего и заднего мозга не выявляется четкой экспрессии (Fig. 3D). Однако, помимо среднего мозга экспрессия
qBrn-2 в передней части нервной трубки снижается до почти не обнаружимого уровня (Fig. 3D). Со ст. HH 11 экспрессия
qBrn-1 и qBrn-2 заметно усиливается и затем сохраняется на высоком уровне во всей нервной трубке, вклбючя оптические пузырьки (Fig. 3E,F,E,F,d). Интересно, что на ст. HH 11, транскрипты
qBrn-1 обычно обнаруживают неравномерное распределение в заднем мозге, где они временно наиболее обильны в первом и 4-м ромбомерах (Fig. 3E и insert). Эти паттерны экспрессии
qBrn-1 и qBrn-2 сохраняются и на поздних стадиях вплоть до HH 24 (Fig. 3H,H).
Рис.3. | A-H: Whole-mount in situ hybridization of qBrn-1 (A-H) and qBrn-2 (A-H) on early developing quail embryos. The developmental stages are indicated in each panel. A-H and A-H show embryos viewed dorsally (A-F,B-F), ventrally (A) и laterally (G,G,H,H), anterior is to the top. Sections of the stained embryos in B, D, F, G, D, E и F are shown in a-k, respectively, with the dash lines showing the approximate levels of sections. Insets in E and F are the high-magnification images of the hindbrain region. The inset in E shows the unequal expression of qBrn-1 in hindbrain with the stronger signals in the first and the fourth rhombomeres и the inset in F shows the expression of qBrn-1 in the auditory pit. A, aorta; ap, auditory pit; av, auditory vesicle; ba, branchial arches; e, eye; fb, forebrain; Fp, floor plate; hb, hindbrain; hf, head fold; Hn, Hensen's node; if, infundibulum; im, intermediate mesoderm; Lp, lateral plate; mb, midbrain; mn, mesonephros; n, notochord; nf, neural fold; nc, neural crest cells; nt, neural tube; ov, optic vesicle; pa, pronephric anlage; ps, primitive streak; r, rhombomere; Rp, roof plate; s, somite; spc, spinal cord. Scale bars = 100 m. Дальнейший анализ поперечных срезов показывает временные и пространственные изменения экспрессии
qBrn-1 во время развития CNS. На ранней ст. (HH 7+), высокая экспрессия
qBrn-1 выявляется во всем нейроэпителии от нервной борозды до нервных складок (Fig. 3a). Во время слияния нервных складок экспрессия
qBrn-1 усиливается в боковых пластинках скорее, чем в пластинках дна и крыши, как в передней, так и задней частях нервной трубки (HH 10 - 12, Fig. 3b-f). Однако, в отличие от qBrn-1, транскрипты
qBrn-2 сохраняют униформное распределение в нейроэпителии на ст. HH 10 (Fig. 3h,i). На более поздних стадиях HH 17 (Fig. 4b) и 19 (Fig. 3g), сигнал qBrn-1 обнаруживает дорсальный высокий и вентральный низкий градиент в боковой пластинке, тогда как экспрессия
qBrn-2 обнаруживает обратный паттерн перед концом нейруляции (Fig. 3j,k).
Рис.4. | qBrn-1 expression in the developing quail kidney and the neural tube. A: In kidney, the expression of qBrn-1 was first detected in the intermediate mesoderm at the 14-somite stage (14s). Transverse section shows the signals in the intermediate mesoderm-derived pronephric anlage (a). B,C: Mesonephric qBrn-1 expression was continuously detected in the nephric duct and condensed mesonephrogenic mesenchyme at Hamburger and Hamilton (HH) stage 17 (b) and persisted in both tubular and nephric duct-derived structures at HH stage 25 (c). A temporal and spatial change of qBrn-1 expression in the neural tube is shown in a and b. An accumulation of qBrn-1 mRNAs was found in the neural tube but clearly was excluded from the roof plate at stage 14s (a) and disappeared late from the floor plate and became progressively restricted in the lateral plate (b). A, aorta; Fp, floor plate; im, intermediate mesoderm; Lm, lateral plate mesoderm; mt, mesonephric tubule; n, notochord; nd, nephric duct; nt, neural tube; pa, pronephric anlage; Rp, roof plate; s, somite; spc, spinal cord; V, postcardinal vein. Scale bars =100 m. Приведенные выше результаты показывают, что
qBrn-1 и qBrn-2 экспрессируются преимущественно в CNS, подтверждая эволюционно законсервированную роль генов класса III POU во время нейрогенеза позвоночных. Мы также установили, что оба гена обнаруживают широко распространенную самостоятельную динамическую экспрессию у развивающихся эмбрионов, которая отличается от паттерна у мышей (He et al.,[1989]).
Expression of qBrn-1 and qBrn-2 Outside the CNS
Помимо преимущественной экспрессии qBrn-1 и qBrn-2 в ЦНС оба гена также экспрессируются в некоторых др. регионах. Во время ранних стадий экспрессия qBrn-1 и qBrn-2 наблюдается в нервном гребне и хорде (Fig. 3b,h). В хорде и qBrn-1 и qBrn-2 обнаруживают динамическую экспрессию. Экспрессия qBrn-1 впервые обнаруживается в хорде на ст. HH 7+ (Fig. 3a), экспрессия сохраняется только в цефалическом регионе на ст. HH 19 (Fig. 3g). Напротив, экспрессия qBrn-2 в хорде видна до закрытия нервных складок (HH 10, Fig. 3i) и перестает обнаруживаться после закрытия нервной трубки (HH 12, Fig. 3j). Экспрессия qBrn-2 временно обнаруживается также в сомитах на HH stage 7+ (Fig. 3B), но после этого исчезает. Кроме того, qBrn-1 обнаруживается в бранхиальных дугах и слуховых ямках (Fig. 3F,G,e,g), соответствующие сайты экспрессии не были описаны для Brn-1 млекопитающих.
Экспрессия qBrn-1 в бранхиальных дугах и слуховых ямках согласуется с возможностью, что он вовлечен в дифференцировку клеток нервного гребня. В краниальных регионах, где нервная трубка слита, гибридизационный сигнал qBrn-1 локализуется в клетках нервного гребня, которые выявлялись по мечению HNK-1 (data not shown), а также по антителам, распознающим клетки нервного гребня (Kuratani,[1991]). Затем, qBrn-1 экспрессируется в слуховых ямках, которые занимаются клетками нервного гребня (Gilbert,[2000]), подтверждая тем самым, что qBrn-1-позитивные клетки представляют собой производный нервного гребня компонент в ушах. Более того, домен экспрессии qBrn-1 распространяется на бранхиальные дуги на HH 16. Ранее было показано, что клетки краниального нервного гребня эмигрируют из ромбомеров в фарингеальные дуги (Lumsden et al.,[1991]). Эти наблюдения подтверждают, что qBrn-1 участвует в спецификации клеток нервного гребня и производных бранхиальных дуг. Хотя qBrn-2 также экспрессируется в нервном гребне, но его транскрипты не обнаруживались в тех сайтах, где экспрессировался qBrn-2, , следовательно, они выполняют разные роли по спецификации нервного гребня.
Др. характерной областью экспрессии qBrn-1, по сравнению с qBrn-2, были мезодермальные компоненты эмбриональных почек. Экспрессия qBrn-1 в почках обнаруживается впервые в промежуточной мезодерме, каудальнее 9-го сомита на ст. 14-сомитов (HH stage 11+, Fig. 4A). Поперечные срезы на этом уровне показывают, что экспресиия qBrn-1 ограничивается происходящими из промежуточной мезодермы пронефрическими зачатками, располагающимися между мезодермой латеральных пластинок и сомитами (Fig. 4a). На HH 17, qBrn-1 транскрипты наблюдаются не только в нефрических протоках, но и также в соседней мезонефрической мезенхиме, которая буду формировать канальцы инициальных почек (Fig. 4B,b). Более того, экспрессия qBrn-1 сохраняется на высоком уровне в нефрических протоках и происходящих из мезенхимы канальцах на HH ст. 25 (Fig. 4C,c).
Интересно сравнить экспрессию
qBrn-1 с таковой
mBrn-1, ортологом Brn-1 мышей, в эмбриональных почках. Экспрессия
mBrn-1 в почках была обнаружена первоначально в почечных пузырьках и затем ограничивается во время формирования нефронов, его транскрипты обнаруживаются только в компонентах, производных канальцев (Nakai et al.,[2003]). Напротив, экспрессия
qBrn-1 в пронефрических почках впервые обнаруживается в промежуточной мезодерме на ст. 14-сомитов и позднее обнаруживается в структурах, происходящих из канальцев и нефрических протоков. Т.о., очевидно, что начало нефрической экспрессии
qBrn-1 происходит раньше, чем
mBrn-1 и и домен экспрессии
qBrn-1 шире в эмбриональных почках, чем
mBrn-1.
Western Blotting and Immunohistochemistry
Рис.5. | A: Western blot analyses of qBrn-1 protein in tissues of quails 2 days after hatching. A 27.8-kDa band can be seen both in kidney (lane 1) and brain (lane 2). B,C: Locations of qBrn-1 quail embryos as determined by whole-mount immunohistochemistry. The developmental stages are indicated in each panel и embryos are viewed dorsally; anterior is to the top. a-c: Sections of the embryos after whole-mount immunochemistry to show the locations of qBrn-1 in the neuroepithelium, notochord, neural tube и in the pronephric anlage. Lm, lateral plate mesoderm; Lp, lateral plate; mb, midbrain; n, notochord; nf, neural fold; nt, neural tube; pa, pronephric anlage; s, somite. Scale bars = 100 m.
Результаты иммуногистохимии целых эмбрионов перепела согласуются с результатами гибридизации
in situ. Первое видимое иммуномечение обнаруживается на ст. HH 6, когда нервная пластинка уже сформирована. на ст. 2-сомитов, когда нервная пластинка начинает формировать складки, презумптивный цефалический уровень нервных складок оказывается иммунореактивным (Fig. 5B). Со ст. HH 8
qBrn-1 экспрессируется строгого в нервной трубке, включая оптические пцзырьки (Fig. 5C и data not shown). Срезы показывают, что
qBrn-1 экспрессируется в нейроэпителии и хорде на ст. 2-х сомитов (Fig. 5a) и строго в латеральной пластинке на уровне среднего мозга на ст. HH 10 (Fig. 5b). До HH 13 нефрическая экспрессия
qBrn-1 четко не обнаруживается в, из промежуточной мезодермы происходящих, пронефрических зачатков (Fig. 5c), хотя неясное мечение присутствует в промежуточной мезодерме уже на ст. 14-сомитов.
CONCLUSION
In this report, we have described the isolation of a new member of class III POU domain genes, qBrn-1, from the cDNA library of embryonic day 5 quail. We also have presented the distinct dynamic expression patterns of qBrn-1 and qBrn-2 throughout the early embryonic development. Our results showed that both qBrn-1 and qBrn-2 are expressed predominantly in the CNS from the beginning of neurulation to the specification of the nervous system. However, their temporal and spatial locations are quite different during the entire neurula period, suggesting a different role of qBrn-1 during quail neurogenesis comparing with that of qBrn-2. Moreover, the observations of qBrn-1 expression in neural crests, notochord и branchial arches, as well as the characteristic expression manner in the kidney, indicate that qBrn-1 has multiple functions in quail organogenesis, including kidney formation
Сайт создан в системе
uCoz 