Члены семейства tetraspanin содержат 4-6 законсервированных внеклеточных цистеинов, связанных 2-3 дисульфидными мостиками. 4 из этих цистеинов абсолютно законсервированы во всех проанализированных тетраспанинах, включая 2 цистеина в CCG мотиве, примерно 28-47 остатков от третьего трансмембранного домена и др. цистеин примерно 11 аминокислот перед 4-м трансмембранным доменом. Тетраспанины обычно содержат законсервированные полярные остатки внутри трансмембранных доменов 1, 3 и 4, а также ещё несколько др. законсервированных остатков. Тетраспанины широко экспрессируются у эукариотических организмов. Семейство тетраспанинов млекопитающих содержит 32 члена, у D.melanogaster их 35, а в геноме C.elegans 20. Тетраспанины обнаружены таже у 4 видов грибов. Среди 35 тетраспанинов дрозофилы только CG6323 и CG9093 имеют ортологов у млекопитающих или червей. CG6323 является ортологом Net6 и SAS у млекопитажщих, тогда как CG9093 является ортологом Net4 млекопитающих и T14G10.6 у червей. Почти все клетки и ткани содержат множественные тетраспанины, часто экспрессируется 30000-100000 или более на клетку.

Tetraspanin CD9 Required for Fertilization

Делеция гена CD9 не вызывает у мышей аномалий роста и развития. Проникновение спермиев через прозрачную зону и соединение с плазматической мембраной яйца происходит нормально, но ооциты СВ9^-/- мышей обнаруживают тяжелые нарушения слияния спермия с яйцом. Спермии, инъецированные непосредственно в цитоплазму CD9 нулевых ооцитов обеспечивают нормальное развитие. CD9 концентрируется в микроворсинаках ооцитов, окружающих головку спермия, а слияние спермия с яйцом строго ингибируется с помощью анти-CD9 антител. Компетентность к слиянию восстанавливается после инъекции мРНК CD9 мыши или человека в ооциты CD9-/- мыши. Однако, мРНК от мутантов CD9 (SFQ^173-175 → AAA) неактивна в отношени слияния гамет. Также и рекомбнантный CD9-EC2 доменовый белок заметно редуцирует слияние (но не связывание) спермий-яйцо, если преинкубируется с ооцитами, но не со спермиями. Скорее всего, что CD9 действует как trans рецептор спермиев на поверхности яйца в качестве партенра для предполагаемого, но неизвестного белка, способствующего слиянию с яйцеклеткой. Интересно бы определить, не является ли EWI-2 партнёром для CD9 и CD81 в ооцитах. Известно, что CD9 v/ ассоциировать с интегринами. Различные интегрины ооцита играют роль в соединении и/или слиянии спермия, возможно за счёт связывания ADAMs белков спермиев. Однако, нет убедительных доказательств, что CD9-integrin комплексы являются критическими для слияния спермий-яйцо или для оплодотворения в целом. Тем не менее CD9 м. вносить свой вклад в регуляцию жадности и силу адгезии во время соединения спермий-яйцо. В этой связи анти-CD9 антитела неспособны ингибировать связывание моновалентными лигандми спермиев с ооцитами, но они ингибируют связывание мультивалентных лигандов спермиев.

По сравнению CD9 мышей CD9 человека эффективны на 90%, а мышиный CD81 эффективнен на 50% после инъекции мРНК в ооциты CD9-нулевых мышей. Следовательно, CD9 человека также необходим для оплодотворения. В определенных инбредных линиях мышей CD81 также м.б. критическим для слияния спермий-яйцо. Неясно пока, как мышиный CD81 м. воспроизводить CD9, т.к. они обладают общими тольуо 6 из 31 остатков, критических для слияния спермий-яйцо в вариабельной области ЕС2 и CD81 не содержит мотива, напоминающего последовательности CD9 SFQ^173-175, существенные для слияния спермий-яйцо. Возможно общая трехмерная структура вариабельных областей CD9 и CD81 ЕС2 доменов м.б. более критическими для слияния, чем специфические последовтельности мотивов.

Genetic Studies in Drosophila and Fungi

Тетраспанин late bloomer (lbm) у дрозофилы экспрессируется в мотонейронах. У мутантных lbm эмбрионов мотонейроны способны контактировать мышцами-мишенями, но неспособны трансформироваться в пресинаптические окончания. Когда тетраспанин lbm и два дополнительных тетраспанина (CG10106 и CG12143) мотонейронов одновременно устранялись, то дефекты синапсов у эмбрионов заметно усиливались, хотя синапсы очевидно формировались позднее в ходе развития. Эти множественные тетраспанины м. обладать общими функциями с lbm. В процессе удаления этих 3-х тераспанинов, экспрессируемых мотонейронами, были удалены 6 др. тетраспанинов дрозофилы (экспрессируемых в кишечнике, эпидермисе или во всём эмбрионе) из той же области хромосомы 2. Несмотря на это мухи, гомозиготные по делеции оставались жизнеспособными и фертильными. , следовательно, каждый из 9 делетированных тетраспанинов или обладает несущественной функцией в развитии зрелых мух или существует функциональная компенсация сос сторны 26 или более оставшихся тераспанинов.

У грибного патогена Magnaporthe grisea ген PLS1 кодирует тетраспанин-подобный белок, необходимый для проникновения в листья риса. Несмотря на низкую общую гомологию аминокислот (примерно 15%) с тетраспанином млекопитающих белок pls1 обладает существенными свойствами тераспанинов в терминах внеклеточного и внутриклеточного доменов, законсервированных полярных остатков внутри трансмембранных доменов и присутствия 4 цистеиновых остатков. Одиночные тетраспаниновые гены идетнифицированы у 3 дополнительных видов грибов. Эти 4 тетраспанина грибов являются ортолагами и не имеют аналогов помимо грибов.

Tetraspanins on Immune Cells

p 18 тетраспанинов, экспрессируемых лифоцитами, 3 (CD37, CD81 и Tssc6) изучены на мышах. Делеция тетраспанина CD37,, не нарушает развития или клеточного состава лимфоидных органов главной молекулы В лимфоцитов. Однако, пониженная продукция IgG1 у неспровоцированных мышей указывает на внутренне присущий дефект В клеток. Также in vivo гуморальные реакции на антигены нарушены при субоптимальных условиях костимуляции, но компенсируются дополнительной костимуляцией. Эти результаты согласуются с нарушениями взаимодействий В клеток с Т клетками. Хотя уровни экспрессии для др. ключевых молекул на В клетках (CD81, MHC class II и CD19) неизменны при делеции CD37, хотя эти молекулы формируют комплексы с CD37, следовательно, м. по-разному реорганизовываться в её отсуствии.

Отсутствие тетраспанина Tssc6 вызывает ещё более слабый фенотип. Мыши снова жизнеспособны и фертильны с нормальным лимфоидным развитием. Они имеют также нормальную реакцию В лимфоцитов на стимуляцию in vitro. Однако, Т клетки обнаруживают повышенную пролиферацию зависимую от Т клеточных рецепторов in vitro в ответ на concanavalin A, anti-CD3 и anti-CD28 благодаря повышенной продукции интерлейкина 2. Хотя Tssc6, по-видимому, и выполняет негатинвую регуляторную роль в Т клетках, но это ещё не подтверждено in vivo. Tssc6, как и др. тетраспанины на Т клетках (напр., CD53, CD81, CD82), д. колокализоваться в микродоменах, которые содержат ключевые Т клеточные молекулы (CD4, CD8 и т.д.), участвуют в Т клеточной стимуляции. Присутствие 18 различных тетраспанинов в лимфоцитахм. помочь объяснить, почему CD37- и Tssc6-дефицитные мыши не столь ущербны.

Делеция тетраспанина CD81 не влияет на развитие лимфоцитов, но субнабор В клеток уменьшен в числе, а экспрессия сигнальных молекул В клеток CD19 снижена. CD81-нулевые мыши обнаруживают измененеие пролиферации В клеток в ответ на разнообразные in vitro стимулы и нарушенную продукцию антител после иммунизации in vivo белковыми антигенами. Более того, CD81-нулевые мыши напоминают CD19- и CD21-нулевых мышей в отношении дефектного ответа антителами на один и тот же тип зависимых от Т клеток антигенов и CD81- и CD19-нулевые мыши обнаруживают повышенную реакцию на определенные независимые от Т клеток антигены. Это подтверждает, что комплексы CD19-C D81-CD21 играют главную роль во время стимуляции В клеток.

Пролиферация Т лимфоцитов in vitro от CD81-нулевых мышей в ответ на различные стимулы усиливается, чо согласуется с результатами, полученными для Tssc6. показано, что во время реакции Т клеток на презентацию антигенов В клетками CD81 необходи на Т клетках, но не на В клетках. CD81 играет также ключевую роль в управлении helper T клетками в направлении поляризованного состояния Th2 дифференцировки in vivo. В этом тношении Th2 клетки обычно результат усиленнной костимуляции Т клеток, а CD81 ( как и некоторые др. тетраспанины) м. облегчать Т клеточную костимуляцию. Ассоциации CD81 молекулами, такими как CD4 и CD8, на Т клетках и с субнабором МНС класса II на антиген-презентирующих клетках также имеют отношение к механизму, с помощью которого CD81 влияет на пролиферацию и поляризацию Т клеток. Область контакта между Т клетками и антиген-презентирующими клетками, называемая иммунным синапсом, подразделяется на central supramolecular activation complex (c-SMAC) и наружное периферическое кольцо (p-SMAC). CD81 на Т клетках и антиген-презентирующих В клетках быстро рекрутируется в с-SMAC в области контакта Т-В. Следовательно, CD81 играет критическую роль во время презентации антигена и в др. Т-В вспомогательных явлениях.

Tetraspanins in Brain

Многочисленные тетраспанины, включая CD9, TM4SF2/A15, Tspan2, Tspan3/OAP-1, Tspan5 и neurospanin экспрессируются на высоком уровне в различных частях головного мозга. Функционирование в головном мозге CD81 и TM4SF2/A15/TALLA1 подтверждено генетически. У мышей CD81^-/- головной мозг существенно увеличен благодаря повышенным количествам астроцитов и микроглии. CD81 м. контролировать количества астроцитов и микроглиальных клеток, супрессируя пролиферацию клеток межклеточным контакт-зависимым способом. Пролифераия нейронов возможно ингибируется путём ангажирования CD81 культивируемыми астроцитами. Кроме того, уровни CD81 увеличиваются в глиальных клетках во время постнатального развития мозга в то время, когда подавляется пролиферация глиальных клеток. Почему тогда анти-CD81 антитела супрессируют митотическую активность культивируемых глиальных клеток. и клеток микроглии? Если модель CD81 в качестве супрессора пролиферации правильна, то антитела д. оказывать агонистический (индуцирующий) эффект.

Новая форма Х-сцепленной умственной отсталости была связана с мутациями тетраспанина TM4SF2 (известного также как TALLA-1, A-15, CD231). Эти мутации, связанные с транслокацией у одного пациента и двумя разными точковыми мутациями (Р172Н, G218X), которые сегрерируют в двух разных семьях с умственной задержкой. Установлено, что один член семьи, наследующий точковую мутацию Р172Н, обладает нормальным познавательным фенотипом. Следовательно, мутация Р172Н в TM4SF2/A15 м.б. редким полиморфизмом скорее, чем действительно ответственной за умственную отсталость. Однако, получено подтверждение связи между TM4SF2/A15 и умственной задержкой, выявлена делеция 2-х оснований в гене TM4SF2/A15, ведущая к возникновению стоп кодна в позиции аминокислоты 190, которая сегрегирует вместе с умственной отсталостью в двух поколениях. Итак, на сегодня известны 4 отдельные мутации в гене TM4SF2/A15, связанные с умственной задержкой, которые вызывают изменения внутри большой внеклеточной петли (ЕС2) тетраспанина. С предполагаемой ролью в когнитивной функции согласуется повсеместная высокая экспрессиия тетраспанина TM4SF2/A15 в нейронах головного мозга, с особенно высокими уровнями в коре головного мозга и гиппокампе, включая первичный обонятельный кортекс. Остаётся установить, участвует ли TM4SF2/A15 в росте нейритов (как это показано для др. тетраспанинов), формировании синапсов или в регуляции синаптической пластичности посредством контроля метаболизма фосфоинозитида. В этой связи TM4SF2/A15 м. ассоциировать с phosphatidylinositol 4-kinase.

Retinal Degeneration

Тетраспанины peripherin/RDS и ROM-1 экспрессируется исключительно в сетчатке. peripherin/RDS присутствует в наружных сегментах палочковидных и конусообразных фоторецепторов, тогда как ROM-1 ограничен наружными сегментами палочек. Эти белки играют специализировнаную роль по поддержанию дисков наружных сегментов в виде характерных параллельных слоёв. Более 70 отдельных мутаций peripherin/RDS, включая 41 замену одиночного основания, вызывают аминокислотные изменения, ассоциированы с разными дистрофиями сетчатки у людей. Большинство точковых мутаций располгается в ЕС2 домене тетраспанинов (который выпячивается в междисковое пространство), подтверждая критическую природу взаимодействий этой области молекулы. Связанные с болезнью замены аминокислот обнаруживаются также во всех 4-х трансмембранных доменах, N- и С-терминальных цитоплазматических доменах и небольшой наружной Ес1 петле peripherin/RDS. Мыши retinal disk large (rds) подтверждают, что разрушение гена тетраспанина peripherin/RDS вызывает дегенерацию сетчатки. Будучи инкорпорированным в микросомные пузырьки in vitro peripherin/RDS димеризуется и распластывает пузырьки.Напротив, патогенные мутации (P216L и C165Y) неспособны изменять пузырьки. Это подтверждает идею, что peripherin/RDS in vivo поддерживает характерную уплощённую морфологию пузырьков, видимую в наружных сегментах фоторецепторах.

В противопложность peripherin/RDS-нулевым мышам мыши с отсутствием ROM-1 имеют менее тяжелый ретинальный фенотип. Эти мыши образуют наружные сегменты фоторецепторов, но эти сегменты дизорганизованы и медленно теряют жизнеспособность. Не известны мутации ROM-1, которые сами по себе в состоянии вызвать дегенерацию сетчатки у людей. Однако, в некоторых семьях мутации в ROM-1 вместе с мутацией L185P в peripherin/RDS дают двухгенные заболевания сетчатки, но ни одна из мутаций в отдельности. В то время как peripherin/RDS собирается в связанные дисульфидами гомо-октамеры и гомо-олигомеры высшего порядка, ROM-1 же формирует гомо-тетрамеры и гетеро-тетрамеры (с peripherin/RDS), которые не прогрессируют до размеров гомо-октамеров. Т.о., ROM-1 м. действовать как негативный модулятор олигомеризации peripherin/RDS, так что удаление ROM-1 ведет к слишком значительной олигомеризации. Однако, ROM-1 м. также играть позитивную роль, т.к. дикого типа ROM-1 помогает маскировать вредные эффекты мутации L185P в peripherin/RDS.

STRUCTURAL FEATURES

Общая топология тетраспанина представлена на Рис. 2. Исследования протеолиза вставленного в микросомы CD81 вместе с картированием сайтов N-гликозилирования и mAb-связывающих эпитопов выявили внеклеточную ориентацию ЕС1 и ЕС2 доменов тетраспанинов. Присутствие фланкирующих внутриклеточных сайтов palmitoylation согласуется с внутриклеточной ориентацией короткой внутренней петли и внутриклеточной ориентацией N- и С-концов тетраспанинов. Структурный анализ ЕС2 области у CD81 подтверждает модель, согласно которой ЕС2 подразделен на постоянную и вариабельную области. Постоянная область содержит структурно законсервированные А, В и Е спирали, которые образуют предполагаемый интерфейс для димеризации, который д. присутствовать практически у всех тетраспанинов. Между В и Е спиралями находится область гипервариабельности, которая обнаруживает заметные конформационные флюктуации. Сайты критических межбелковых взаимодействий (напр., для тераспанинов CD9, CD81, CD151) располагаются внутри этой вариабельной области.

Первый, третий и четвёртый трансмембранные домены тетраспанинов обычно содержат полярные остатки (Asn, Gln, Glu), которые, по-видимому, лежат в интерфейсах внутренних трансмембранных доменов, где они м. формировать сильные водородные мостики, стабилизирующие тем самым общую структуру тетраспанина. С этим согласуется взаимодействие первого трансмембранного домена (ТМ1) с остальными трансмембранными доменами (ТМ2-4), необходимое для биосинтетического созревания CD82. Кроме того, взаимодействия трансмембранных доменов стабилизируют конформацию ЕС2 домене.

UNRAVELING THE TETRASPANIN WEB

Считается, что свыше 38 различных трансмембранных белков физически ассоциируют с одним или более из 12 различных тетраспанинов. Белки, ассоциированные с тетраспанинами включают 11 различных интегринов, членов множественного Ig сверхсемейства (напр., CD2, CD3, CD4, CD8, MHC classI, MHC class II и т.д.), протеогликаны (syndecan, CD44), комплимент-регуляторные белки (CD21, CD46), рецепторы факторов роста и лиганды (EGFR, с-kit, proTGFα, proHB-EGF) и разнообразные др. молекулы (CD19, γ-glutamyl transpeptidase, ADAM10 и т.д.). Количество этих белков ещё будет расти. Однако, анализ тетраспаниновых белковых комплексов осложнаяется тенденцией тетраспанинов ассоциировать с некоторыми др. тетраспанинами, в результате чего иногда появляютя нерастворимые в детергенте липид-содержащие микродомены. Широкая сеть взаимодействий тетраспанинов в мембранах иногда называется тетраспаниновой сетью. Мы подразделяем образование тетраспаниновых комплексов на первичные, вторичные и четвертичные.

Primary Interactions

Первичные взаимодействия являются непосредственными (т.е. они м.б. выловлены с помощью ковалентного перекрёстного связывания) и осуществляются с высокой стоихометрией (приближающейся к 50% и выше). Список первичных взаимодействий между тетраспанинами и др. белками показан в Табл. 1 А. Тетраспанины uroplakin 1a (UP1a) и UP1b взаимодействуют непосредственно и стоихометрически с нетранспаниновыми типа I трансмембранными белками Uroplakin II и Uroplakin III, соотв. Эти комплексы существенны для формирования специализированных просветных мембранных бляшек в эпителии мочевого пузыря млекопитающих. Делеция гена UPIII ведет к уменьшению синтеза и процессинга тетрасканина UP1b, подчёркивая тем самым облигаторную природу взаимодействия.

Взаимодействие CD151 с интегрином α3β1 также непосредственное с высокой стоихометрией. Хотя и не нарушает клеточной адгезии, но CD151 модулирует α3β1-зависимую морфологию и миграцию клеток. Ассоциация с CD151 происходит рано в биосинтезе, т.к. α3β1 всё ещё находится в эндоплазматической ретикулёме (ER). CD151 ассоциирует также с высокой стохиометрией с интегрином α7β1 в условиях строгого детергента (1% NP-40), хотя функциональное значение этого не установлено. Для CD9 и СD81 тетраспанинов белковыми партнёрами являются трансмембранные IgSF белки EWI-2 и EWI-F. Эти взаимодействия м.б. выявлены по ковалентному перекрёстному связыванию и происходят с высокой стохиометрией. Предполагается, что белки EWI м. играть ключевую роль в некоторых функциях (оплодотворение ооцитов, передача сигналов ростовых факторов, слияние клеток и т.д.), использующих CD9 и CD81.

Дополнительные первичные взаимодействия представлены в Табл. 1В. Они представляют отдельную категорию, т.к. взаимодействия не были документированы в отношении высокой стоихометрии и/или т.к. не были идентифицированы с определенностью продукты ковалентного перекрёстного связывания. Ассоциация CD151 с интегрином α6β1 регулирует интегрин-хависимую морфологию клеток и силу адгезии, тогда как ассоциация с α6β4 м. играть роль во время образования полудесмосом. Согласуется с непосредственной ассоциацией и то, что интегрины α3, α6 и α7 блокируют доступ к специфическому субнабору эпитопов CD151. В некоторых клетках α6β1-CD151, по-видимому. обладают первичной ассоциацией, тогда как в др. клетока ассоциация является вторичной (т.е. более чувствительной к детергенту). Мы подозреваем, что в некоторых клетоках, где CD151 ограничен или имеется избыток конкурентного интегрина α3, др. тетраспанины м. вмешиваться между α6 и CD151. Ассоциации CD81 с интегрином α4β1 или с CD19 (трансмембранной сигнальной молекулой на В клетках) являются специфическими в определенных условиях умеренного детергента, но не с высокой стохиометрией (не выше 25-30%) и комплексы не выявляются с помощью ковалентной перекрестной связи. Ассоциация CD19 с CD81 функционально важна во время распознавания антигена В клетками. Ассоциаия CD9 с фактором роста HB-EGF м.б. прямой, исходя из ковалентного перекрестного связывания временно избыточно экспрессируемых молекул и результатов дрожжевого двугибридного связывания. Однако, размер более 200 кДа продукта перекрёстного связывания указывает на то, что и др. молекулы также присутствуют. Кроме того, CD9-EC2 домен вряд ли складывается в свою нативную конформацию при внутриклеточной экспрессии в дрожжах.

Третья категория первичных взаимодействий (тетраспанин-тетраспанин) представлена в Табл. 1С. Peripherin-peripherin и ROM-ROM тетраспаниновые гомодимеры нековалентно ассоциируют в строительные блоки, которые собираются в тетрамеры и затем более высокого порядка гомо- и гетеро-октамеры, критическими для образования структур наружных сегментов фоторецепторов. Эти гомодимеры м.б. выявлены с помощью перекрестного связывания glutaraldehyde. Прямая ассоциация peripherin-ROM также происходит. В уникальном арранжементе тетраспанинов peripherin/RDS и ROM их неспаренные цистеины формируют дисульфидрные связи, которые стабилизируют гомо- и гетеро-октамеры. Др. тетраспанины не имеют неспаренных внеклеточных цистеинов. Наблюдались также ковалентно поперечно связанные CD81 гомодимеры, что согласуетсмя с предположением, что большая петля CD81 м. димеризоваться. Выявлены и тетраспаниновые UP1a гомодеимеры, хотя их использование неясно. Мы предполагаем. что для многих тетраспанинов гомодимеры являются ключевым структурным элементом, на котором базируется их др. ассоциации.

Secondary Interactions

Тенденция тетраспанинов взаимодействовать с др. др. позволят соединение первичных комплексов в сеть вторичных взаимодействий. Вторичные взаимодействия этот те, которые обычно происходят в позднем биосинтезе (Гольджи или пост-Гольджи) без участия внеклеточной ЕС2 петли тетраспанинов, обеспечиваются или стабилизируются с помощью palmitoylation и обычно с использованием ассоциации с др. тетраспанинами. Несмотря на их мультикомпонентную природу эти комплексы, строяobtcz вокруг гетеро-транспониновой сердцевины? всё ещё м.б. изолированы в растворимой фазе детергентного лизата. Детергент Brij 96/97 является прекрасным реагентом при использовании 5 mM магнезии в лизис-буффере.

Изучение CD151 выявило четкие различия между первичным и вторичным типом взаимодействий тетраспанинов. Мутации в ЕС2 домене CD151, которые нарушают первичные ассоциации с итегрином α3β1, не оказывают влияния на ассоцииации CD151 с некоторыми др. тетраспанинами. Напротив, мутации, нарушающие ассоциацию CD151 с др. тетраспанинами, оказывают незначительные эффекты на первичную ассоциацию с интегрином. Более того, CD151-α3β1ассоциация обнаруживается в раннем биосинтезе ( в ER), тогда как ассоциация CD151 с др. тетраспанинами происходит позднее. Рalmitoylation облегчает взаимодействия тетраспанин-тетраспанин. Удаление сайтов palmitoylation в CD151 не нарушает ассоциации с интегрином α3β1 (первичное взаимодействие), но уменьшает ассоциацию с др. тетраспанинами (CD9, CD63, CD81). Сходным образом удаление сайтов palmitoylation CD9 нарушает ассоциацию с тетраспанинами CD53 и CD81. А palmitoylation CD9 и CD151 не снижает ни растворимости в детергенте, ни белковой плотности в градиенте сахарозы. Этот контраст очевиден в сравненнии с др. белеками (напр., G белками, семейством src киназ), в уоторых palmitoylation ледет к уменьшению растворимости в детергенте и снижение плотности белка. Следовательно, тетраспанины используют palmitoylation новым способом, чтобы поддержать формирование белковых комплексов, которые м. обнаруживаться в растворимой фазе детергентных лизатов и во фракциях высокой плотности сахарозного градиента.

Tertiary Interactions - Comparison with Lipid Rafts

Большинство известных партнёров тетраспанинов ассоциирует посредством непрямых четвертичных взаимодействий. Четвертичные взаимодействия это взаимодействия тетраспанинов, которые нарушаются в детергентах, таких как Brij 96/97 и Triton X-100, но сохраняются в менее гидрофобных детергентах, таких 1% Brij 58, Brij 99, Brij 35 и CHAPS. Эти последние детергенты часто вызывают неполное растворение тетраспанинов и т.о., четвертичные тетраспаниновые комплексы избирательно преобладают (по сравнению с общим белком клеточной поверхности) в нерастворимой, лёгкой фракции мембран сахарозного градиента. Т.к. тетраспанины м. ассоциировать с ганглиозидами и обнаруживают резистентность к растворению детергентами, то тетраспаниновые комплексы, как полагают, обладают некими свойствами, сходными с липидными платформами. Липидные плотики являются микродоменами клеточной поверхности с повышенным содержанием сфинголипидов, холестерола и фосфолипидов с длинными, насыщенными acyl боковыми цепочками. После экстракции не-ионными детергентами эти микродомены стремятся сегрегировать во фракции низкой плотности (легкие мембраны) изопикнического сахарозного градиента.

Несмотря на некоторое сходство с липидными плотиками тетраспаниновые комплексы обнаруживают критические отличия. В то время как липидные плотики часто содержат GPI-связанные белки и кавеолин, эти белки обычно не обнаруживаются в т. наз. tetraspanin-enriched microdomain (TEM) комплексах. Хотя липидные платформы обычно резистентны к Triton X-100 тетраспаниновые комплексы обычно разрушаются с помощью Triton X-100. После истощения холестерола липидные плотики разрушаются, а тетраспаниновые комплексы более устойчивы. Наконец, palmitoylation тетраспанинов способствует сборке тертраспаниновой сети, но не ведет к снижению растворимости в детергенте или повышенной сегрегации комплексов в легкие мембранные фракции в градиенте сахарозы. Итак, тетраспаниновые микродомены являются самостоятельными и обладают своими собственными специализированными функциями. В самом деле многие функции, приписываемые сегодня липидным плотикам фактически м. выполняться тетраспаниновыми микродоменами. Исследования презентации антигенов В клетками показали, что тетраспаниновые микродомены и липидные плотики физически и функционально отличны, как в отношении чувствительности к детергентам, так и деплеции холестерола. Ассоциированные с тетраспанинами молекулы class II были предпочтительными для субнабора пептидов, участвующих в презентации антигенов.

Напр., высоко специализированный четвертичный комплекс тетраспанинов описан как частицы диаметром в 16-нм, которые м.б. изолированы с апикальной поверхности эпителиальных клеток мочевого пцзыря. Эти частицы собираются в 0.3-0.7 µm бляшки, которые играют ключевую роль в регуляции области апикальной поверхности и диффузии растворов в мочевом пузыре. Каждая 16-nm частица является высоко упорядоченной гексагональной структурой, как полагают, состоящая из двух рар uraplakin гетеродимеров (UPIa-UPII, UPIIa-UPIII). Сконструированы детельные кристаллографические трёхмерные модели, хотя точный вклад тетраспанинов (UPIa, UPIb) неизвестен.Выяснение этих специализированных уроплакиновых комплексов обнадеживает предположения, что др. тетраспанины также формируют симметричные белковые массивы в клеточной мембране.

TETRASPANIN MICRODOMAIN FUNCTIONS

Modulation of Growth Factor Signaling

Тетраспанин CD9 ассоциирует с и модулирует функцию pro-TGFα, pro-HB-EGF и pro-amphiregulin, т.е. связанных с мембранами агонистами для рецепторов EGF. Ассоциация с CD9 заметно увеличивает потенцию этих лигандов во время juxtacrine передачи сигналов с помощью ещё неустановленного механизма, который м. участвовать в предупреждении расщепления мембранного лиганда и/или концентрации лиганда в CD9 микродоменах. Хотя др. тетраспанины м. ассоциировать с HB-EGF, но специфические остатки внутри CD9 необходимы для его стимуляции HB-EGF митогенной активности. Хотя CD9 ассоциация способствует juxtacrine стимуляции , но м. ожидать ограничения протеолитического расщепления, чтобы нарушить стимуляцию паракринных рецепторов, т.к. растворимые агонисты EGF рецепторов становятся менее достыпными. Однако, в одном соообщении расщепление и shedding HB-EGF (для паракринной стимуляции) озитивно коррелировали с формированием тройных комплексов между HB-EGF, CD9 и мембранной металлопротеазой (KUZ/ADAM10). Хотя точный механизм остаётся невыясненым, двойная модуляция с помощью CD9 активности EGF рецептора лиганда м. бы частично объяснить, как CD9 м. и супрессировать и способствовать озлокачествлению опухолей.

Тетраспанины также м. ассоциировать с и модулировать функцию самих рецепторов ростового фактора . Напр., с-kit трансмембранный рецептор тирозин киназы формирует комплекс с тетраспанинами CD9, CD63 и CD81 в клетках, зависящих от steel фактора , так что базовое фосфорилирование тирозина увеличивается, но стимулируемое steel фактором фосфорилирование тирозина снижается. Эти результаты м. объяснить тетраспанин-зависимым рекрутированием сигнальных энзимов, таких как фосфатазы и тирозин киназы. В др. работе ассоциация тетраспанина CD82 (также наз. КАI1) с EGF рецепторной (EGFR) тирозин киназой вызывает ускоренное лигандом индуцированное очищение клточной поверхности от EGFR, в результате чего происходит ослабление передачи сигналов EGFR. Это м. помочь объяснить активность CD82 по супрессии опухолевых метастазов.

Modulation of Integrin-Dependet Post-Cell Adhesion Events

Тетраспанины (включая CD9, CD53, CD63, CD81, CD82, CD151, NAG2) участвуют в первичных и вторичных ассоциациях с laminin-связывающими интегринами (α3β1, α6β1, α6β4, α7β1) и α4 интегринами и в четвертичных ассоциациях с несколькими дополнительными интегринами. Нет доказательст изменения тетраспанинами конформации интегринов или сродства к лиганду и тетраспанины ( и анти-тетраспаниновые антитела) в основном не влияют на адгезию ститичных клеток. Скорее интегрин-зависимая миграция, прорастание и/или клеточная морфология м. заметно меняться тетраспанинами. Недавно три разных типа мутаций тетраспанинов выявили изменение интегрин-зависимых функций. В случае тетраспанина CD151 мутация в сайте первичного взаимодействия с интегрином (Site 1) ведет к соотв. потере ассоциаций с интегринами α3 и α6. Параллельно мутантные клетки сохраняют интегрин-зависимые свойства клеточной адгезии, но теряют интегрин-зависимое распространение и клеточную cable морфологию при помещении их на Matrigel.

Устранение palmitoylation CD151 (Site 2) оказывает минимальный эффект на первичную ассоциацию с интегрином α6β4, но ведет к уменьшению вторичных взаимодействий с др. тетраспанинами параллельно с переходом почечных эпителиальных клеток от фибробластной к эпителиальной морфологии. CD151 с тетраспаниновой сетью м. модулировать α6β4-зависимую адгезию в направлении фибробластного фенотипа, тогда как в отсуствие такого вовлечения (благодаря потере palmitoylation) клетки должны ревертировать к более эпителиальному фенотипу. Тетраспаниновая сеть создаёт возможность рекрутирования сцепленных с тетраспанинами киназ, фосфатаз и др. сигнальных молекул, которые м. модулировать интегрин-зависимые функции.

Мутации третьего типа в С-терминальном хвосте CD151 также заметно меняют зависимые от интегрина α6, распространение клеток, функцию формирования клеточных cable и усиление адгезии. Этот Site 3 осуществляет гипотетическую связь с неидентифицированными скелетными или цитоплазматическими сигнальными элементами, которые вносят вклад в интегрин-зависимую морфологию и усиление слипчивости. Модель на Рис. 4 представляет тетраспанины в роли трансмембранных линкеров. В подтверждение этой модели было продемонстрировано, что корректный внеклеточный домен α цепи (который делеат возможным ассоциацию с тетраспанинами) необходим для внутриклеточного рекрутировани тетраспанин-ассоциированных сигнальных энзимов, таких как phosphatidylinositol 4-kinase и стандартные PKCs, в комплексы с интегрином. Также внутриклеточное фосфорилирование α3 хвоста интегрина не происходит несмотря на то, что внеклеточный домен α цепи, необходимый для ассоциации тетраспанинов, присутствует.

Пока неясно, все ли тераспанины помимо CD151 м. непосредственно контактировать с интегринами. Во многих случаяхассоциация др. тетраспанинов с интегринами α3 и α6 м. опосредоваться через CD151. В клетках (напр., лимфоидных), в которых отсутствует CD151? тетраспанины ассоциируют с интегринами, но тесной близости выявить не удаётся. В одном исследовании активация β1 интегринов или ассоциация с α6β1 интегрином, предположеная для индукции нового конформационного эпитопа CD9, вообще-то указывает на прямую ассоциацию. Однако, согласно альтернативной интерпретации увеличивается кластрирование CD9, вызываемое кластрированием интегрина, которое сопровождает активацию интегрина, является результатм кластер- специфического бивалентного связывания с помощью моноклональных антител с низким сродством к CD9.

TETRASPANINS AS CELL SURFACE RECEPTORS

Тетраспанины м. также функционировать в качестве рецепторов для секретируемых белков или для мембранных белков на оппозитных клетках. Имеются некоторые доказательтсва, подтверждающие такую функцию, но не очень убедительные. Установлено, что CD81 на астроцитах м. взаимодействовать с предполагаемыми counter-рецепторами нейронов, чтобы супрессировать пролиферацию астроцитов. Растворимый CD81 large loop (EC2) слитый белок соединяется с нейронами, предупреждая тем самым индуцированный нейроами арест пролиферации астроцитов. Однако, предполагаемый элемент counter-рецепторов на нейронах ещё неидентифицирован. В др. исследовании специфический для беременности гликопротеин 17 (PSG17), как полагают, действует как лиганд для CD9, т.к. трансфекция CD9 обеспечивает связывание, а анти-CD9 антитела ингибируют связывание. Однако, нельзя исключить, что CD9 м. позитивно регулировать доступность др. молекулам, которыя являются действительными рецепторами. Учитывая способность CD9 ассоциировать с и модулировать активность др. белков клеточной поверхности (напр., TGFα, HB-EGF) эту возможность м. рассматривать как реальную. Тетраспанин CD9 предположительно является рецептором для фибронектина. Но необходимы дополнительные доказательства, но следует отметить отсутствие тенденции у CD9 локализоваться в фокальных адгезиях, сайтах, в которых фибронектиновый матрикс прикрепляется к клеткам.

Тетраспанины также м. играть роль в клеточном связывании белков, происходящих от инфекционных боолезнетворных организмов. Напр., в то время как HB-EGF является действительным рецептором для дифтерийного тксина, ассоциированный CD9 играет ключевую роль в усилении связывания лиганда. Также оболочка, кодируемая вирусом гепатита С, гликопротеин Е2, м. связываться специфически и тесно с тетраспанином CD81. Однако, т.к. множественные факторы м. влиять на связывание и инфекцию клеток интактными вирусами, то роль связывания Е2 белка ещё не выяснена. CD81 необходим также для инфекции Plasmodium falciparum и Plasmodium yoelii гепатоцитов людей и мышей соотв. Однако нет доказательств, что CD81 непосредственно взаимодействует с лигандами sporozoite, скорее всего CD81 м. функционировать, регулируя ассоциированные с гепатоцитами белки. Пока тетраспанины чаще всего обозначаются как "pseudo-receptors" (activity of associated receptors).

ROLE OF TETRASPANINS IN EXOSOMES

Помимо клеточной поверхности тетраспанины накапливаются также внутри различных внутриклеточных пузырьков. Особый интерес вызывает накопление тетраспанинов на эндоцитотическом пути, внутри мультивезикулярных тел (наз. также MIIC), которые сливаются с плазматической мембраной и высвобождают частицы в 50-90-nm, называемые экзосомами. Экзосомы, производные В клеток, обогащены всеми проанализированными тетраспанинами в 7-124 раз. Экзосомы м. функционировать как межклеточные коммуникационные пузырьки, напр., для широко-массштабной стимуляции Т лимфоцитов. твкже активация Jurkat T клеток вызывает снижение на поверхности уровня CD81 параллельно с высвобождением CD81-позитивных экзосом и их переносом на поверхность CD81 негативных клеток. Селективный shedding везикулярных частиц, содержащих тетраспанины, выявляется после деплеции холестерола из интактных клеток. Всё это указывает на то, что тетраспанином обогащённые микродомены м.б. специфически адаптированы для облегчения слияния и/или отшнуровки пузырьков. В самом деле, специализированный тетраспанин peripherin/RDS заметно изменяет кривизну ембран. В др. случае экспрессия тетраспанина и блокирование антителами указывают на активную роль в обеспечении или ингибировании слияния клеток в нескольких разнообразных контекстах. CD9 необходим не только для слияния спермий-яйцо, его экспрессия усиливает спонтанное образование синцития клетками рабдомиосаркомы. Антитела к CD9 и CD81 ингибируют слияние миобластов. CD9 участвует в остеокастогенезе, а CD82 участвует в формировании индуцированного вирусами синцития. однако, ключевые взаимодействующие с тетраспанинами белки в этих случаях ещё неидентифицированы.

Tetraspanin Proteins Mediate Cellular Penetration, Invasion, and Fusion Events and Define a Novel Type of Membrane MicrodomainM.E. HemlerAnnu. Rev. Cell. Dev. Biol. V.19. P397-422. 2003

Tetraspanin Proteins Mediate Cellular Penetration, Invasion, and Fusion Events and Define a Novel Type of Membrane Microdomain
M.E. Hemler
Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. V.19. P397-422. 2003