Checkpoints
КПП
Cell-cycle regulation Needhi Bhalla Genome Biology 2002 3(4): reports4009.1-4009.4 http://genomebiology.com/2002/3/4/reports/4009
Таблица 1 \| Cell-cycle regulatory proteins mentioned in this article	Checkpoints (Контрольно-пропускные пункты, КПП) Работа лаб. Walworth's сконцентрирована на том, как клеточный цикл останавливается в ответ на повреждения ДНК и в частности как Chk1 протеин киназа участвует в поддержании этой 'checkpoint' (с которой клеточный цикл не м. сдвинуться до тех пор, пока поврежденная ДНК не будет репарирована). В разных лаб. было установлено, что активность Chk1 ингибирует Cdc25 phosphatase и активирует Wee1 и Mik1 протеин киназы, обе действуют, чтобы фосфорилировать и тем самым инактивировать cyclin-dependent kinase, двигатель, который управляет клеточным циклом. Исследования Walworth's показали значение фосфорилирования для функции Chk1, которая обнаруживается checkpoint-зависимым способом и подавляет действие Rad3p (у делящихся дрожжей гомолог Mec1/ATR киназ). Мутация фосфорилируемого остатка Chk1 (Ser345 → Ala) компроментрирует checkpoint функцию Chk1 белка и фенотипически воспроизводит эффект chk1 делеции. Когда происходило фосфорилирование Chk1, Walworth's и коллеги наблюдали усиление ядерной локализации Chk1 после повреждения. Walworth объяснил, что мутация предполагаемого nuclear localization signal (NLS, остатки 377-397) в Chk1 теперь блокирует фосфорилирование Chk1 белка и делает его checkpoint-дефицитным, подтверждая тем самым, что ее присутствие в ядре необходимо для ее функции. Это было подтверждено, когда им удалось восстановить ядерную локализацию и checkpoint функцию у chk1 NLS-дефицитных мутантов путем добавления гетерологического NLS, из SV40. Учитывая, что химера из дикого типа Chk1 слитого с SV40 NLS, также оказывается в большом количестве в ядре только после повреждения ДНК, было высказано предположение, что выход Chk1 белка из ядра регулируется в ответ на повреждение ДНК. Эта гипотеза была подтверждена тем, что повреждение ДНК стимулирует ассоциацию Chk1 с белком S. pombe 14-3-3, Rad24. Мутация 14-3-3-связывающей области Chk1 устраняет связывание Rad24 , а также DNA-damage-check-point функцию. Эта область напоминает сигнал ядерного экспорта , подтверждая тем самым модель, согласно которой фосфорилирование Chk1 стабилизирует ее взаимодействие с Rad24 в ядре, и тем самым блокирует экспорт Chk1; это ведет к накоплению Chk1 киназы в ядре, где она м. выполнять свою checkpoint функцию и держать циклин-зависимую киназу в неактивном состоянии. Экспортный сигнал не законсервирован у Chk1 гомологов у высших эукариот, уазазывая тем самым, что этот уровень регуляции DNA-damage checkpoint м. не присутствовать у этих организмов. Steve Doxsey сообщил о существовании 'mitotic exit network' (MEN) в клетках млекопитающих родственной MEN в почкующихся дрожжах и 'septation initiation network' (SIN) в делящихся дрожжах. История началась с открытия центросомных белков , centriolin и kendrin, которые являются антигенами у человека при аутоиммунном состоянии scleroderma; kendrin является большой изформой центросомного белка pericentrin. Использование anti-centriolin антител позволило продемонстрировать его специфичность внутри центросом 'материнской' центриоли. Учитывая, что и centriolin и kendrin движутся к внутриклеточным мостикам и срединным телам (midbody) во время цитокинеза, и недавние сообщения о роли в цитокинезе Doxsey и др. были заинтригованы возможным участием centriolin's в цитокинезе. Они инъецировали анти-центриолиновые антитела в ооциты Xenopus и наблюдали дефекты цитокинеза; такие же деяекты наблюдались и когда centriolin избыточно экспрессировался в клетках тканевой культуры. Когда были использованы небольшиеинтерферирующие РНК, чтобы редуцировать белковый уровень kendrin, то centriolin исчезал из центриолей, причем это не сопровождалось потерей центриолярных белков γ tubulin или pericentrin A; дефекты цитокинеза наблюдались, но microtubule-nucleation активность центросом, выделенных их этих клеток, не менялась. Эти данные указывают на то, что centriolin и kendrin м. вовлекааться в регуляторные пути, чтобы передавать сигналы цитокинеза. Doxsey полагает, что centriolin является гомологом Nud1p почкующихся дрожжей (который прикрепляет компоненты MEN), на базе сходства их последовательностей в одном специфическом домене и на взаимодействии этого домена с checkpoint белком Bub2p. Он также допускает возможность, что kendrin м.б. гомологом Sid4 делящихся дрожжей, необходимым для локализации Cdc11 (гомолога Nud1p почкующихся дрожжей и, следовательно, centriolin). Stephen Elledge занимался выявлением MEN у почкующихся дрожжей и ее регуляцией с помощью polo-подобной киназы Cdc5p. Он показал, что Cdc5p необхдима для инактивации GTPase-activating protein (GAP) Bfa1p. Ингибирование Bfa1p вызывает активацию Tem1, Ras-related GTPase, которая действует посредством серии белков, идентифицированных как MEN, чтобы совершить подавлениеактивности cyclin-dependent киназы и выход из митоза. Он покахзал, что фосфорилирование Bfa1p совпадает с анафазой и это фосфорилирование устраняется у cdc5 мутантов. Он предполагает, что эта регуляция Bfa1p важна во время активации spindle-assembly checkpoint, которая удерживает клетки от деления пока все хромосомы не прикрепятся к митотическому веретену; клетки, обработанные деполимеризующим микротрубочки лекарством nocodazole не обнаруживают фосфорилирования Bfa1p пока checkpoint не работает, также как в линиях с делецией mad2 checkpoint гена. Mad2 связывается с Cdc20, активатором anaphase-promoting complex (APC), чтобы ингибировать активность APC и арестовать клетки в метафазе в ответ на активацию checkpoint. DNA-damage checkpoint также нарушается после регуляции Bfa1p , но не посредством Cdc5p. Sue Biggins описала роль Aurora-like kinase, Ipl1p, у почкующихся дрожжей в spindle-assembly checkpoint. Инициальный анализ мутантов ipl1 идентифицировал дефекты сегрегации хромосом, связанные с дефектом кинетохор. Экстракты из ipl1 мутантных клеток (centromere DNA on beads is exposed to cell extract to bind the required kinetochore proteins) поддерживают прикрепление микротрубочек более стабильно, чем это делают экстракты из клеток дикого типа. Несмотря на дефект кинетохор ipl1 мутанты не активируют spindle-assembly checkpoint как это делает большинство мутантных кинетохор, это привело Biggins к предположению, что или checkpoint неспособен к мониторингу дефекта у ipl1 мутантов или Ipl1p сам участвует в checkpoint. Последнее предположение кажется справедливым: если checkpoint постоянно активен, как он это делает, когда протеин киназа Mps1p экспрессируется в избытке, то инактивация Ipl1p вызывает отмену checkpoint. Если checkpoint активруется с помощью деполимеризирующего микротрубочки лекарства, такого как benomyl, то потеря функции IPL1 не окажет эффекта, исходя из предположения, что Ipl1p не участвует в мониторинге присоединения кинетохор к микротрубочкам. Вместо этого, Ipl1p м. осуществлять мониторинг напряжения кинетохор - отталкивающих сил веретена в кинетохорах противопоставленных сцеплением, которое удерживает сестринские хроматиды вместе. Недавно показано, что отсутствие сестринских хроматид (у cdc6 делеционного мутанта) или потеря сцепления между сестринскими хроматидами (у mcd1/scc1 мутанта) активрует spindle-assembly checkpoint. Biggins показала, что Ipl1p необходим, чтобы активировать heckpoint в условиях, при которых нет напряжения. Это согласуется с ролью Ipl1p, локализующегося в кинетохорах. Promoting anaphase Valerie Sudakin, обратил внимание на ключевого играка клеточного цикла APC, мультисубъединичную убиквитин лигазу, которая направляет специфические белки для деструкции во время ключевых переходов клеточного цикла; по этой причине она сама часто является мишенью checkpoint путей, таких как spindle-assembly checkpoint. Yen с сотр. идентифицировали мультибелковый комплекс, названный mitotic checkpoint complex (MCC), который ингибирует активность APC's in vitro. Этот комплекс состоит из BubR1, Bub3, Mad2 (все известны как компоненты spindle-assembly checkpoint) и Cdc20, и его ингибирующая активность в 3,000-раз выше. чем только Mad2 белка. Комплекс существует в интерфазе, но м. дейстовать только митотическую APC, подтверждая тем самым дополнителный уровень регуляции, который еще не охарактеризован. Более того, Yen и др. считают, что хромосомы пролонгируют ингибирование APC с помощью MMC, путем стабилизации взаимодействия между двумя комплексами. Sudakin предложил модель, согласно которой MCC, уже сформированный в интерфазе, позволяет быстро ингибировать APC вплоть до анафазы; checkpoint поддерживает это ингибирование, если хромосомы имеют кинетохоры, которые не прикреплены к микротрубочкам. Peter Jackson исследовал функцию Emi1, белка, идентифицированного в его лаб., как новый APC ингибитор. Он и его коллеги нашли, что деградация Emi1 необходима для APC-обусловленной деструкции митотических циклинов, A и B, чтобы появиться в экстрактах яиц Xenopus. Иммунодеплеция Emi1 вызывает раннюю деструкцию cyclin B; этот фенотип м.б. нормализован с помощью рекомбинантной Emi1 и фрагмента non-destructible cyclin B (Δ90 fragment), который постоянно активирует cyclin-dependent kinase. N-конец Emi1 вызывает нестабильность; добавление non-destructible Emi1к клеточному экстракту продуцирует митотический арест с высоким циклиновым уровнем и инактивным APC, как результат взаимодействия между Emi1 и первыми 100 аминокислотами APC активатора Cdc20. Jackson и др. далее охарактеризовали это взаимодействие между Cdc20 и Emi1, когда изучали роль Emi1 в аресте митототическим cytostatic factor (CSF); яйца Xenopus поддерживают этот metaphase II арест, т.к. они далеки до оплодотворения и CSF арест является Ca²⁺-лабильным. Иммунодеплеция Emi1 из CSF-арестованных экстрактов яиц Xenopus ведет к продолжению клеточного цикла без добавления Ca²⁺; они смогли нормализовать это фенотип добаслением С-конца белка Emi1, который связывает Cdc20. Далее было установлено, что добавление Ca²⁺ при нормальном выходе из CSF ареста, Emi1 отделяется от Cdc20 и, как полагают, формируетнечто, что имеет более низкую электрофоретическую подвижность. In vitro, Emi1 фосфорилируется с помощью Ca²⁺-calmodulin-dependent protein kinase type II (CaMKII), киназы, участвующей в каскаде сигнальной трансдукции, который обеспечивает выход из CSF ареста и это ингибирует способность Emi1 ассоциировать с Cdc20. Nagi Ayad охарактеризовал новый APC субстрат, который регулирует митотический выход; множественные регуляторные механизмы действуют слажено, чтобы контролировать первичную машину клеточного цикла , cyclin-dependent kinase Cdc2. Поиск нового APC субстрата, который был бы нацелен специфически на деструкцию с помощью APC(Cdh1), версии APC прежде всего активной в G1 клеточного цикла. Cdh1 является, подобно Cdc20, активатором APC; помимо обеспечения активности Cdc20 и Cdh1 обеспечивают дифференциальное распознавание субстрата на APC ubiquitin ligase, которая м. модифицировать различные белки в разных точках клеточного цикла. Ayad и др. идентифицировали новый белок, p66, который экспрессируется в течение всего эмбриогенеза у Xenopus и имеет гомологов у человека, мыши и Drosophila. Это настоящий субстрат для APC(Cdh1), т.к. мутации мотива, который распознается с помощью Cdh1 ( 'KEN box') или добавление протеосомного ингибитора и Δ90-cyclin B обусловливает стабильность p66. Человеческий p66 деградирует при выходе из митотического цикла и ассоциирует с Skp1, компонентом др. ubiquitin ligase комплекса, SCF (Skp1-Cul1/Cdc53-F-box); адапторный белок, субъединица F-box, обеспечивает субстрат-специфичность этому комплексу. Белок p66 содержит F-box домен и делеция этой области устраняет его взаимодействие с Skp1; экспрессия этого мутанта в клетках человека или добавление его к клеточнм экстрактам Xenopus вызывает митотический блок (со стабилизацией Wee1 киназы и пролонгированной фосфориляцией Cdc2). Wee1 и p66 ассоциируют др с др, но эта ассоциация зависит от фосфорилирования Wee1; мутация сайта фосфорилирования (Ser38 → Ala) устраняет ассоциацию Wee1 с p66 и воспроизводит p66 F-box мутантный фенотип, а именно, стабилизирует Wee1. Согласно модели, предложенной Ayad и др. деструкция p66 с помощью APC(Cdh1) в ходеe G1фазы клеточного цикла делает возможной аккумуляцию Wee1 и инактивацию Cdc2; но инактивация APC вызывает накопление p66, деградацию Wee1 и активацию Cdc2. Движущей силой клеточного цикла является активность cyclin-dependent киназы. Ключевая ступень в регуляции клеточного цикла должна, следовательно, касаться активности циклин-зависимой киназы.

Checkpoints (Контрольно-пропускные пункты, КПП)

Работа лаб. Walworth's сконцентрирована на том, как клеточный цикл останавливается в ответ на повреждения ДНК и в частности как Chk1 протеин киназа участвует в поддержании этой 'checkpoint' (с которой клеточный цикл не м. сдвинуться до тех пор, пока поврежденная ДНК не будет репарирована). В разных лаб. было установлено, что активность Chk1 ингибирует Cdc25 phosphatase и активирует Wee1 и Mik1 протеин киназы, обе действуют, чтобы фосфорилировать и тем самым инактивировать cyclin-dependent kinase, двигатель, который управляет клеточным циклом. Исследования Walworth's показали значение фосфорилирования для функции Chk1, которая обнаруживается checkpoint-зависимым способом и подавляет действие Rad3p (у делящихся дрожжей гомолог Mec1/ATR киназ). Мутация фосфорилируемого остатка Chk1 (Ser345 → Ala) компроментрирует checkpoint функцию Chk1 белка и фенотипически воспроизводит эффект chk1 делеции. Когда происходило фосфорилирование Chk1, Walworth's и коллеги наблюдали усиление ядерной локализации Chk1 после повреждения. Walworth объяснил, что мутация предполагаемого nuclear localization signal (NLS, остатки 377-397) в Chk1 теперь блокирует фосфорилирование Chk1 белка и делает его checkpoint-дефицитным, подтверждая тем самым, что ее присутствие в ядре необходимо для ее функции. Это было подтверждено, когда им удалось восстановить ядерную локализацию и checkpoint функцию у chk1 NLS-дефицитных мутантов путем добавления гетерологического NLS, из SV40. Учитывая, что химера из дикого типа Chk1 слитого с SV40 NLS, также оказывается в большом количестве в ядре только после повреждения ДНК, было высказано предположение, что выход Chk1 белка из ядра регулируется в ответ на повреждение ДНК. Эта гипотеза была подтверждена тем, что повреждение ДНК стимулирует ассоциацию Chk1 с белком S. pombe 14-3-3, Rad24. Мутация 14-3-3-связывающей области Chk1 устраняет связывание Rad24 , а также DNA-damage-check-point функцию. Эта область напоминает сигнал ядерного экспорта , подтверждая тем самым модель, согласно которой фосфорилирование Chk1 стабилизирует ее взаимодействие с Rad24 в ядре, и тем самым блокирует экспорт Chk1; это ведет к накоплению Chk1 киназы в ядре, где она м. выполнять свою checkpoint функцию и держать циклин-зависимую киназу в неактивном состоянии. Экспортный сигнал не законсервирован у Chk1 гомологов у высших эукариот, уазазывая тем самым, что этот уровень регуляции DNA-damage checkpoint м. не присутствовать у этих организмов.

Steve Doxsey сообщил о существовании 'mitotic exit network' (MEN) в клетках млекопитающих родственной MEN в почкующихся дрожжах и 'septation initiation network' (SIN) в делящихся дрожжах. История началась с открытия центросомных белков , centriolin и kendrin, которые являются антигенами у человека при аутоиммунном состоянии scleroderma; kendrin является большой изформой центросомного белка pericentrin. Использование anti-centriolin антител позволило продемонстрировать его специфичность внутри центросом 'материнской' центриоли. Учитывая, что и centriolin и kendrin движутся к внутриклеточным мостикам и срединным телам (midbody) во время цитокинеза, и недавние сообщения о роли в цитокинезе Doxsey и др. были заинтригованы возможным участием centriolin's в цитокинезе. Они инъецировали анти-центриолиновые антитела в ооциты Xenopus и наблюдали дефекты цитокинеза; такие же деяекты наблюдались и когда centriolin избыточно экспрессировался в клетках тканевой культуры. Когда были использованы небольшиеинтерферирующие РНК, чтобы редуцировать белковый уровень kendrin, то centriolin исчезал из центриолей, причем это не сопровождалось потерей центриолярных белков γ tubulin или pericentrin A; дефекты цитокинеза наблюдались, но microtubule-nucleation активность центросом, выделенных их этих клеток, не менялась. Эти данные указывают на то, что centriolin и kendrin м. вовлекааться в регуляторные пути, чтобы передавать сигналы цитокинеза. Doxsey полагает, что centriolin является гомологом Nud1p почкующихся дрожжей (который прикрепляет компоненты MEN), на базе сходства их последовательностей в одном специфическом домене и на взаимодействии этого домена с checkpoint белком Bub2p. Он также допускает возможность, что kendrin м.б. гомологом Sid4 делящихся дрожжей, необходимым для локализации Cdc11 (гомолога Nud1p почкующихся дрожжей и, следовательно, centriolin).

Stephen Elledge занимался выявлением MEN у почкующихся дрожжей и ее регуляцией с помощью polo-подобной киназы Cdc5p. Он показал, что Cdc5p необхдима для инактивации GTPase-activating protein (GAP) Bfa1p. Ингибирование Bfa1p вызывает активацию Tem1, Ras-related GTPase, которая действует посредством серии белков, идентифицированных как MEN, чтобы совершить подавлениеактивности cyclin-dependent киназы и выход из митоза. Он покахзал, что фосфорилирование Bfa1p совпадает с анафазой и это фосфорилирование устраняется у cdc5 мутантов. Он предполагает, что эта регуляция Bfa1p важна во время активации spindle-assembly checkpoint, которая удерживает клетки от деления пока все хромосомы не прикрепятся к митотическому веретену; клетки, обработанные деполимеризующим микротрубочки лекарством nocodazole не обнаруживают фосфорилирования Bfa1p пока checkpoint не работает, также как в линиях с делецией mad2 checkpoint гена. Mad2 связывается с Cdc20, активатором anaphase-promoting complex (APC), чтобы ингибировать активность APC и арестовать клетки в метафазе в ответ на активацию checkpoint. DNA-damage checkpoint также нарушается после регуляции Bfa1p , но не посредством Cdc5p.

Sue Biggins описала роль Aurora-like kinase, Ipl1p, у почкующихся дрожжей в spindle-assembly checkpoint. Инициальный анализ мутантов ipl1 идентифицировал дефекты сегрегации хромосом, связанные с дефектом кинетохор. Экстракты из ipl1 мутантных клеток (centromere DNA on beads is exposed to cell extract to bind the required kinetochore proteins) поддерживают прикрепление микротрубочек более стабильно, чем это делают экстракты из клеток дикого типа. Несмотря на дефект кинетохор ipl1 мутанты не активируют spindle-assembly checkpoint как это делает большинство мутантных кинетохор, это привело Biggins к предположению, что или checkpoint неспособен к мониторингу дефекта у ipl1 мутантов или Ipl1p сам участвует в checkpoint. Последнее предположение кажется справедливым: если checkpoint постоянно активен, как он это делает, когда протеин киназа Mps1p экспрессируется в избытке, то инактивация Ipl1p вызывает отмену checkpoint. Если checkpoint активруется с помощью деполимеризирующего микротрубочки лекарства, такого как benomyl, то потеря функции IPL1 не окажет эффекта, исходя из предположения, что Ipl1p не участвует в мониторинге присоединения кинетохор к микротрубочкам. Вместо этого, Ipl1p м. осуществлять мониторинг напряжения кинетохор - отталкивающих сил веретена в кинетохорах противопоставленных сцеплением, которое удерживает сестринские хроматиды вместе. Недавно показано, что отсутствие сестринских хроматид (у cdc6 делеционного мутанта) или потеря сцепления между сестринскими хроматидами (у mcd1/scc1 мутанта) активрует spindle-assembly checkpoint. Biggins показала, что Ipl1p необходим, чтобы активировать heckpoint в условиях, при которых нет напряжения. Это согласуется с ролью Ipl1p, локализующегося в кинетохорах.

Promoting anaphase

Valerie Sudakin, обратил внимание на ключевого играка клеточного цикла APC, мультисубъединичную убиквитин лигазу, которая направляет специфические белки для деструкции во время ключевых переходов клеточного цикла; по этой причине она сама часто является мишенью checkpoint путей, таких как spindle-assembly checkpoint. Yen с сотр. идентифицировали мультибелковый комплекс, названный mitotic checkpoint complex (MCC), который ингибирует активность APC's in vitro. Этот комплекс состоит из BubR1, Bub3, Mad2 (все известны как компоненты spindle-assembly checkpoint) и Cdc20, и его ингибирующая активность в 3,000-раз выше. чем только Mad2 белка. Комплекс существует в интерфазе, но м. дейстовать только митотическую APC, подтверждая тем самым дополнителный уровень регуляции, который еще не охарактеризован. Более того, Yen и др. считают, что хромосомы пролонгируют ингибирование APC с помощью MMC, путем стабилизации взаимодействия между двумя комплексами. Sudakin предложил модель, согласно которой MCC, уже сформированный в интерфазе, позволяет быстро ингибировать APC вплоть до анафазы; checkpoint поддерживает это ингибирование, если хромосомы имеют кинетохоры, которые не прикреплены к микротрубочкам.

Peter Jackson исследовал функцию Emi1, белка, идентифицированного в его лаб., как новый APC ингибитор. Он и его коллеги нашли, что деградация Emi1 необходима для APC-обусловленной деструкции митотических циклинов, A и B, чтобы появиться в экстрактах яиц Xenopus. Иммунодеплеция Emi1 вызывает раннюю деструкцию cyclin B; этот фенотип м.б. нормализован с помощью рекомбинантной Emi1 и фрагмента non-destructible cyclin B (Δ90 fragment), который постоянно активирует cyclin-dependent kinase. N-конец Emi1 вызывает нестабильность; добавление non-destructible Emi1к клеточному экстракту продуцирует митотический арест с высоким циклиновым уровнем и инактивным APC, как результат взаимодействия между Emi1 и первыми 100 аминокислотами APC активатора Cdc20. Jackson и др. далее охарактеризовали это взаимодействие между Cdc20 и Emi1, когда изучали роль Emi1 в аресте митототическим cytostatic factor (CSF); яйца Xenopus поддерживают этот metaphase II арест, т.к. они далеки до оплодотворения и CSF арест является Ca²⁺-лабильным. Иммунодеплеция Emi1 из CSF-арестованных экстрактов яиц Xenopus ведет к продолжению клеточного цикла без добавления Ca²⁺; они смогли нормализовать это фенотип добаслением С-конца белка Emi1, который связывает Cdc20. Далее было установлено, что добавление Ca²⁺ при нормальном выходе из CSF ареста, Emi1 отделяется от Cdc20 и, как полагают, формируетнечто, что имеет более низкую электрофоретическую подвижность. In vitro, Emi1 фосфорилируется с помощью Ca²⁺-calmodulin-dependent protein kinase type II (CaMKII), киназы, участвующей в каскаде сигнальной трансдукции, который обеспечивает выход из CSF ареста и это ингибирует способность Emi1 ассоциировать с Cdc20.

Nagi Ayad охарактеризовал новый APC субстрат, который регулирует митотический выход; множественные регуляторные механизмы действуют слажено, чтобы контролировать первичную машину клеточного цикла , cyclin-dependent kinase Cdc2. Поиск нового APC субстрата, который был бы нацелен специфически на деструкцию с помощью APC(Cdh1), версии APC прежде всего активной в G1 клеточного цикла. Cdh1 является, подобно Cdc20, активатором APC; помимо обеспечения активности Cdc20 и Cdh1 обеспечивают дифференциальное распознавание субстрата на APC ubiquitin ligase, которая м. модифицировать различные белки в разных точках клеточного цикла. Ayad и др. идентифицировали новый белок, p66, который экспрессируется в течение всего эмбриогенеза у Xenopus и имеет гомологов у человека, мыши и Drosophila. Это настоящий субстрат для APC(Cdh1), т.к. мутации мотива, который распознается с помощью Cdh1 ( 'KEN box') или добавление протеосомного ингибитора и Δ90-cyclin B обусловливает стабильность p66. Человеческий p66 деградирует при выходе из митотического цикла и ассоциирует с Skp1, компонентом др. ubiquitin ligase комплекса, SCF (Skp1-Cul1/Cdc53-F-box); адапторный белок, субъединица F-box, обеспечивает субстрат-специфичность этому комплексу. Белок p66 содержит F-box домен и делеция этой области устраняет его взаимодействие с Skp1; экспрессия этого мутанта в клетках человека или добавление его к клеточнм экстрактам Xenopus вызывает митотический блок (со стабилизацией Wee1 киназы и пролонгированной фосфориляцией Cdc2). Wee1 и p66 ассоциируют др с др, но эта ассоциация зависит от фосфорилирования Wee1; мутация сайта фосфорилирования (Ser38 → Ala) устраняет ассоциацию Wee1 с p66 и воспроизводит p66 F-box мутантный фенотип, а именно, стабилизирует Wee1. Согласно модели, предложенной Ayad и др. деструкция p66 с помощью APC(Cdh1) в ходеe G1фазы клеточного цикла делает возможной аккумуляцию Wee1 и инактивацию Cdc2; но инактивация APC вызывает накопление p66, деградацию Wee1 и активацию Cdc2.

Движущей силой клеточного цикла является активность cyclin-dependent киназы. Ключевая ступень в регуляции клеточного цикла должна, следовательно, касаться активности циклин-зависимой киназы.

Cell-cycle regulation

Checkpoints (Контрольно-пропускные пункты, КПП)

Promoting anaphase