Chips
ЧИПЫ
Chips to hits Krishnarao Appasani Genome Biology 2002 3(4): reports4012.1-4012.2 http://genomebiology.com/2002/3/4/reports/4012
	Surface chemistry Чтобы создать массив (arrays) белков, необходимы специализированные покрытия для слайдов. Несколько исследователей рассказывало о выполняемых проектах coating chemistry. Pluskal дал обзор основных свойств поверхностей и как они м.б. модифицированы для иммобилизации кДНК, олигонуклеотидов, белков и антител. Он описал покрытия, используемые для металлических поверхностей, особенно таких как золото, включая длинно-цепочечные alkyl thioester мономеры и само-собирающиеся монослои. Поверхность стекла м.б. обработана тонкими слоями silane reagents (aminopropyl-, mercaptopropyl-, methylpropyl-, и epoxy-silane), avidin и streptavidin, poly-L-lysine, glutaraldehyde, или polyacrylamide. Эти покровные химические в-ва используются для создания ДНК chips, массивов белков и surface plasmon resonance sensors. Pluskal обсуждал также piezoelectric liquid dispensing технологию, которая имеет применение в peptide-mass fingerprinting, картировании сайтов N-гликозилирования, обнаружения антигенов и иммунодиагностике. Химические отпечатки ('Chemical printing') с помощью in situ переваривания трипсином мембран-связанных белков непосредственно на blot являются очень удобным подходом для quantitating белков, т.к. оно нуждается лишь в малых количествах реагентов, которые м.б. высвобождены с точностью, возможно архивирование результатов и что наиболее важно, оно м.б. автоматизировано для целей high-throughput quantitation. Hughes представила информацию о компании Versalinx™ платформе protein array technology, которая использует стеклянные слайды, покрытые phenyl-(di)-boronic кислотой, чтобы связывать необратимо с salicyl hydroxamic кислоту. Эти небиологические химические повехности имеют несколько преимуществ, такие как чрезвычайная стабильность поверхности, прекрасное прикрепление белков, способность связывать все разнообразие белков и униформная сигнальная сила и морфология точек (spot). Этот тип химии само-собирающихся, монослойных поверхностей очень высоко совместим с типами mass spectrometry, такими как matrix absorption laser time-of-flight (MALDI) и surface-enhanced laser time-of-flight (SELDI) спектрометрии. Microarrays for genomics and diagnostics Несколько выступющих касались microarrays для genomics и diagnostics. Elizabeth Winzeler использует систему, базирующуюся на скрининге индивидуальных дрожжевых клеток, в качестве инструмента для выявления лекарств. Используя этот подход, она идентифицировала ингибиторы специфических клеточных процессов и мишени и нашла, что они активны не только у дрожже, но для широкого круга патогенов. Самым большим преимуществом cell-based метода скрининга является его способность скринировать тысячи мишеней одновременно; метод м.б. однако, не очень чувствительным. Используя Affymetrix yeast gene chips® и дрожжи, растущие богатой среде, она идентифицировала новую, еще не-аннотированную открытую рамку считывания и оценила ее экспрессию на уровне мРНК с помощью northern-blot анализа. Используя различные условия роста и обработку nocodazole (который дестабилизирует микротрубочки) она подвергла мониторингу фенотипы и систематически идентифицировала мощные новые открытые рамки считывания. Помимо этого она представила результаты идентификации генов, отвечающих на повреждения ДНК путем обработки дрожжевых клеток УФЛ. Charles Cantor прудставил подход к обнаружению генов с использованием полностью автоматизированного генотипирования с помощью масс спектрометрии. Используя этот метод он идентифицировал apolipoprotein E как маркер болезни Alzheimer's, подтвердив предыдущее исследование. Он отметил, что, используя этот метод, было оценено 190,000 validated assays и 1.3 million single nucleotide polymorphisms (SNPs) за год. Его группа так же разыскивает маркеры различных болезней и биохимические факторы риска в генеральной популяции. Он детализировал стратегию детекции генов, участвующих в сердечно-сосудистых заболеваниях , путем измерения соотношения adenine:guanine в генах липопротеинов высокой плотности и липопротеинов низкой плотности в пуле ДНК от близнецов. В порядке скринирования генетических маркеров для использования в клинических и популяционных исследованиях, они собрали и хранят выборки ДНК от 10,000 здоровых пациентов в своем собственном банке DNA. Towia Libermann продемонстрировал мощь платформы 'multiplexed molecular profiling technology' для идентификации мишеней для epithelial-specific транскрипционных факторов, участвующих в дифференцировке и пролиферации эпителиальных клеток, используя в качестве модели рак простаты. Его группа открыла новое семейство a new family Ets-родственых транскрипционных факторов у человека, которые включают ESE-1, ESE-2, ESE-3, и prostate down-regulated expressed factor (PDEF) и охарактеризовала их и определила локализацию их мРНКс помощью гибридизации in situ. В попытке идентифицировать гены мишени для Ets транскрипционных факторов, LNCaP клеточная линия рака простаты стабильно трансфицировалась PDEF. Избыточная экспресиия PDEF была подтверждена с помощью GeneChip анализа и оценена с помощью real-time PCR. Они анализировали регуляторные пути после обработки клеточной линии interleukin-6, это привело к выделению ядерного фактора kB как потенциальной терапевтической мишени при раке простаты. Были представлены также данные по генотипированию типа 1 диабетичских пациентов, используя Nanogen микроэлектронную chip technology platform; его группа нашла SNPs, которые оказались ассоциированными с Ets генами. Emerging technologies M. Richard Shen представли данные по high-throughput генотипированию, с использованием массивов олигонуклеотидов на микросферах (beads) соединенных с высокой плотности оптическими волокнами. Illumina создала эти олигонуклеотидами покрытые bead массивы с помощью процессов само-сборки, происходящих случайно на конце опто-волоконного пучка. Примерно 2,000 различных олигонуклеотидов м.б. присоединено к каждой микросфере (bead), указывая, что 2,000 испытаний м.б. осуществлено в одном опыте (array). Связанные с bead олигонуклеотиды гибридизируются с комплементарными последовательностями, которые генерируются в опытах по генотипированию, в которых ligation двух меченных олигонуклеотидов определяется с помощью присутствующих аллелей. This technology is cost-effective, robust, accurate, and flexible, but whether it will change the field of microarrays in the near future remains to be seen. David Ward обсуждал метод rolling-circle DNA amplification и применение 'lollypop probe' для обнаружения точковых мутаций in situ. В этом методе, циркулярная ДНК, короткий ДНК праймер (комплементарный части окружности) плюс полимераза (вместе, a 'lollypop') генерируют однонитчатую concatameric молекулу ДНК, которая состоит из тысяч тандемно повторенных копий circle. В отличие от др. техник амплификации этот метод продуцирует одиночный амплифицированный продукт, который остается сцепленным с ДНК праймером и прекрасно выявляется в solid-phase formats, напр., для генерации локализованного сигнала в специфическом microarray местоположении. Интересно, что этот метод был адоптирован к real-time quantitation purposes и позволил выявить менее десяти молекул. Используя in situ гибридизацию и цитометрию вместе с rolling-circle amplification, Ward определил локализацию антигенов спирохеты, которая вызывает болезнь Lyme (Borrelia burgdorferi). Симпозиум продемонстрировал современное состояние генных и протеиновых чипов и их применение в диагностике и геномике.

Surface chemistry

Чтобы создать массив (arrays) белков, необходимы специализированные покрытия для слайдов. Несколько исследователей рассказывало о выполняемых проектах coating chemistry. Pluskal дал обзор основных свойств поверхностей и как они м.б. модифицированы для иммобилизации кДНК, олигонуклеотидов, белков и антител. Он описал покрытия, используемые для металлических поверхностей, особенно таких как золото, включая длинно-цепочечные alkyl thioester мономеры и само-собирающиеся монослои. Поверхность стекла м.б. обработана тонкими слоями silane reagents (aminopropyl-, mercaptopropyl-, methylpropyl-, и epoxy-silane), avidin и streptavidin, poly-L-lysine, glutaraldehyde, или polyacrylamide. Эти покровные химические в-ва используются для создания ДНК chips, массивов белков и surface plasmon resonance sensors. Pluskal обсуждал также piezoelectric liquid dispensing технологию, которая имеет применение в peptide-mass fingerprinting, картировании сайтов N-гликозилирования, обнаружения антигенов и иммунодиагностике. Химические отпечатки ('Chemical printing') с помощью in situ переваривания трипсином мембран-связанных белков непосредственно на blot являются очень удобным подходом для quantitating белков, т.к. оно нуждается лишь в малых количествах реагентов, которые м.б. высвобождены с точностью, возможно архивирование результатов и что наиболее важно, оно м.б. автоматизировано для целей high-throughput quantitation.

Hughes представила информацию о компании Versalinx™ платформе protein array technology, которая использует стеклянные слайды, покрытые phenyl-(di)-boronic кислотой, чтобы связывать необратимо с salicyl hydroxamic кислоту. Эти небиологические химические повехности имеют несколько преимуществ, такие как чрезвычайная стабильность поверхности, прекрасное прикрепление белков, способность связывать все разнообразие белков и униформная сигнальная сила и морфология точек (spot). Этот тип химии само-собирающихся, монослойных поверхностей очень высоко совместим с типами mass spectrometry, такими как matrix absorption laser time-of-flight (MALDI) и surface-enhanced laser time-of-flight (SELDI) спектрометрии.

Microarrays for genomics and diagnostics

Несколько выступющих касались microarrays для genomics и diagnostics. Elizabeth Winzeler использует систему, базирующуюся на скрининге индивидуальных дрожжевых клеток, в качестве инструмента для выявления лекарств. Используя этот подход, она идентифицировала ингибиторы специфических клеточных процессов и мишени и нашла, что они активны не только у дрожже, но для широкого круга патогенов. Самым большим преимуществом cell-based метода скрининга является его способность скринировать тысячи мишеней одновременно; метод м.б. однако, не очень чувствительным. Используя Affymetrix yeast gene chips® и дрожжи, растущие богатой среде, она идентифицировала новую, еще не-аннотированную открытую рамку считывания и оценила ее экспрессию на уровне мРНК с помощью northern-blot анализа. Используя различные условия роста и обработку nocodazole (который дестабилизирует микротрубочки) она подвергла мониторингу фенотипы и систематически идентифицировала мощные новые открытые рамки считывания. Помимо этого она представила результаты идентификации генов, отвечающих на повреждения ДНК путем обработки дрожжевых клеток УФЛ.

Charles Cantor прудставил подход к обнаружению генов с использованием полностью автоматизированного генотипирования с помощью масс спектрометрии. Используя этот метод он идентифицировал apolipoprotein E как маркер болезни Alzheimer's, подтвердив предыдущее исследование. Он отметил, что, используя этот метод, было оценено 190,000 validated assays и 1.3 million single nucleotide polymorphisms (SNPs) за год. Его группа так же разыскивает маркеры различных болезней и биохимические факторы риска в генеральной популяции. Он детализировал стратегию детекции генов, участвующих в сердечно-сосудистых заболеваниях , путем измерения соотношения adenine:guanine в генах липопротеинов высокой плотности и липопротеинов низкой плотности в пуле ДНК от близнецов. В порядке скринирования генетических маркеров для использования в клинических и популяционных исследованиях, они собрали и хранят выборки ДНК от 10,000 здоровых пациентов в своем собственном банке DNA.

Towia Libermann продемонстрировал мощь платформы 'multiplexed molecular profiling technology' для идентификации мишеней для epithelial-specific транскрипционных факторов, участвующих в дифференцировке и пролиферации эпителиальных клеток, используя в качестве модели рак простаты. Его группа открыла новое семейство a new family Ets-родственых транскрипционных факторов у человека, которые включают ESE-1, ESE-2, ESE-3, и prostate down-regulated expressed factor (PDEF) и охарактеризовала их и определила локализацию их мРНКс помощью гибридизации in situ. В попытке идентифицировать гены мишени для Ets транскрипционных факторов, LNCaP клеточная линия рака простаты стабильно трансфицировалась PDEF. Избыточная экспресиия PDEF была подтверждена с помощью GeneChip анализа и оценена с помощью real-time PCR. Они анализировали регуляторные пути после обработки клеточной линии interleukin-6, это привело к выделению ядерного фактора kB как потенциальной терапевтической мишени при раке простаты. Были представлены также данные по генотипированию типа 1 диабетичских пациентов, используя Nanogen микроэлектронную chip technology platform; его группа нашла SNPs, которые оказались ассоциированными с Ets генами.

Emerging technologies

M. Richard Shen представли данные по high-throughput генотипированию, с использованием массивов олигонуклеотидов на микросферах (beads) соединенных с высокой плотности оптическими волокнами. Illumina создала эти олигонуклеотидами покрытые bead массивы с помощью процессов само-сборки, происходящих случайно на конце опто-волоконного пучка. Примерно 2,000 различных олигонуклеотидов м.б. присоединено к каждой микросфере (bead), указывая, что 2,000 испытаний м.б. осуществлено в одном опыте (array). Связанные с bead олигонуклеотиды гибридизируются с комплементарными последовательностями, которые генерируются в опытах по генотипированию, в которых ligation двух меченных олигонуклеотидов определяется с помощью присутствующих аллелей. This technology is cost-effective, robust, accurate, and flexible, but whether it will change the field of microarrays in the near future remains to be seen.

David Ward обсуждал метод rolling-circle DNA amplification и применение 'lollypop probe' для обнаружения точковых мутаций in situ. В этом методе, циркулярная ДНК, короткий ДНК праймер (комплементарный части окружности) плюс полимераза (вместе, a 'lollypop') генерируют однонитчатую concatameric молекулу ДНК, которая состоит из тысяч тандемно повторенных копий circle. В отличие от др. техник амплификации этот метод продуцирует одиночный амплифицированный продукт, который остается сцепленным с ДНК праймером и прекрасно выявляется в solid-phase formats, напр., для генерации локализованного сигнала в специфическом microarray местоположении. Интересно, что этот метод был адоптирован к real-time quantitation purposes и позволил выявить менее десяти молекул. Используя in situ гибридизацию и цитометрию вместе с rolling-circle amplification, Ward определил локализацию антигенов спирохеты, которая вызывает болезнь Lyme (Borrelia burgdorferi).

Симпозиум продемонстрировал современное состояние генных и протеиновых чипов и их применение в диагностике и геномике.

Chips to hits

Surface chemistry

Microarrays for genomics and diagnostics

Emerging technologies