ClC ХЛОРНЫЕ КАНАЛЫ

ClC chloride channels
Merritt Maduke
Genome Biology 2001 2(2): reviews3003.1-3003.6

http://genomebiology.com/2001/2/2/reviews/3003


Chloride-проводящие ионные каналы семейства ClC участвуют во многих биологических процессах. Эти политопные мембранные белки формируют водные пути, через которые анионы избирательно проходят, следуя концентрационному градиенту. ClCs обнаружены практически у всех организмов. Известно, что они фундаментально отличаются своей молекулярной конструкцией и механизмом  от хорошо известных К-, Na- и Са-селективных каналов. 4 наследственных заболевания связаны с семейными нарушениями функции ClC.

ORIGINAL RESEARCH PAPER
Dutzler, R. et al. X-ray structure of a ClC chloride channel at 3.0 A reveals the molecular basis of anion selectivity. Nature 415, 287-294 (2002)
FURTHER READING
Jentsch, T. J. et al. The ClC chloride channel family. Pflugers Arch. 437, 783-795 (1999)
Jentsch, T. J. Chloride channels are different. Nature 415, 276-277 (2002)
WEB SITES Encyclopedia of Life Sciences chloride channels


ClC chloride являются распространенным семейством анион-селективных каналов. Мутации ClC-1 вызывают миотонию, а потеря ClC-5 вызывает болезнь Dent's, почечную патологию, при которой появляются аномальные количества белка в моче. В нервной системе отсутствие ClC-3, который обычно экспрессируется в синаптических пузырьках, ведет к дегенерации сетчатки и гиппокампа у мышей.


Stereo view of a bacterial ClC channel. Reproduced with permission from Dutzler et al. © 2002 Macmillan Magazines Ltd.

Подобно др. каналам ClC каналы часто мутируют, но в отличие от некоторых катионовых каналов, ни ClC ни любые др. анионовые каналы не поддаются силовой кристаллографии. Dutzler и др. удалось все-таки выявить кристаллическую структуру двух прокариотических ClC каналов. Их данные выявляют беспрецендентные детали структуры этих белков и помогают объяснить биофизические свойства. Новая структура позволяет понять химическую и физическую основу избирательности анионов.
ClC каналы. как полагают являются димерными и имеют две поры. Dutzler et al. подтвердили это предположение и получили убедительные доказательства того, что каждая пора формируется независимо одним мономером. Более того внутри каждого мономера выявлены структурные особенности: N- и С-терминальные половины структурно сходны и дают внутренне повторяющийся паттерн, который не выявляется при анализе первичных последовательностей. Важно, что две половинки имеют противоположную ориентациюв мембране: они идут антипараллельно, создавая псевдо-ось симметрии. Такое расположение позволяет аминокислотным остаткам, которые составляют chloride-связывающий сайт, находиться в тесной близи, несмотря на то, что они находятся в разных половинках молекулы. Сходно с тем, что было обнаружено в калиевых каналах, хлорид-связывающий сайт в ClC каналах оказывается частично (не полностью) заряжен, этим обеспечиваются благоприятные электростатические условия для анионов, но они предупреждают их от слишком тесного соединения с порой.
Кроме того, Dutzler et al. идентифицировали др. негативный заряд на пути проведения — боковую цепь остатка glutamate. Авт. полагают, что глютамат д. уходить с этого пути, чтобы осуществилось проведение, и считают, что вступление хлорида в пору м. указывать на эту структурную перестройку. Это объясняет, почему chloride необходим для ClC проведения через канал.

Gene organization and evolutionary history

ClC-типа Cl- каналы составляют одно семейство. Их последовательности отличаются полностью от таковых у др анион-проводящих каналов, включая и  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) хлорные каналы, porins, и γ-aminobutyric acid (GABA) рецепторы. Они встерчаютс во всем животном царстве (Рис. 1).


Рис.1.  |  ClC family tree

Широкая идентичность последовательностей среди гомологов ClC связана с небольшими высоко законсервированными участками аминокислот, 'горячими точками,' распределенными по всему белку. В среднем идентичность колеблется в пределах 15-20%, но в горячих точках она намного выше (Рис. 2)


Рис.2.  |  Transmembrane topology and conserved sequences of the ClC chloride channels

В целом паттерны hydrophobicity строго законсервированы у всех известных ClCs.
Гены ClC у прокариот известны только благодаря секвенировнию геномов: их существование не противоречит физиологии или биохимии микробов. В целом около половины секвенированных геномов прокариот содержат 1-2  ClC гена, и за исключением Escherichia coli ClC, ничего неизвестно кроме предполагаемых белковых последовательностей. Дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) имеют один ген ClC, названный GEF1. Высшие растения, представленные Arabidopsis, экспрессируют множественные, близко родственные ClCs.
Животные, включая млекопитающих, экспрессируют три подсемейства ClC (Рис. 1). Канальцевые белки внутри каждого подсемейства очень близки, идентичность варьирует в пределах 50-80%. Напротив, идентичность последовательностей между подсемействами низкая (около 20%), т.е. они дивергировали очень рано у животных. 

У млекопитающих семейство ClC хлорных каналов состоит из 9 известных членов (Рис. 1). У человека гены для этих каналов картированы и распределены среди 6 хромосом. Члены, для которых известна intron/exon структура, содержаи 10-23 экзонов. 3 из этих генов, ClCNKA, ClCNKB, и ClCN6, картируются в одной и той же области, 1p36. Bartter's синдром, наследственное заболевание, в некоторых случаях является следствием неравного кроссинговера ClCNKA и ClCNKB.

Characteristic structural features

ClCs являются α-спиральными мембранными белками, предполагается, что они пронизывают мембрану 10-12 раз. N- и С-терминальные домены (длиной примерно в 50-130 и 170-420 аминокислотных остатков, соотв., у гомологов млекопитающих) являются цитоплазматическими. Трансмембранная топология стержневых последовательностей не соответствует в точности 10-12 трансмембранным спиралям. Точная топология до конца не выяснена; тем не менее, исходное число спиралей, определенное  hydropathy анализом, подтверждается. Трансмембранные спирали 9-12 содержат определенно гидрофобные участки, которые должны пересекать мембрану  или 3 или 5 раз. Две модели ClC топологии показаны на (Рис. 2). Рисунок показывает также последовательности горячих точек среди  ClC гомологов. Эти горячие точки разбросаны по трансмембранной области. С-терминальные цитоплазматические области не содержат горячих точек; у эукариот, однако, последовательрности, по-видимому. содержат два  'CBS domains', небольшие домены с неизвестной, возможно регуляторной функцией. Эти домены обнаружены у широкого круга белков, включая транспортеры Mg2+, протеин киназы, и domain's namesake, cystathionine β-synthase. Структура CBS домена из inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) известна. Этот домен, который не нужен для каталитической активности, является димером, который  отделяет основной домен от центра активности.
Неизвестны белки-партнеры, ассоциирующие с ClC каналами и ясно, что, по крайней мере члены одного семейства, действуют самостоятельно. ClC-0 хлорные каналы м.б. введены из мембран электрического органа  электрического  ската (Torpedo) липидный бислой планарий. Очищенный  от нативных мембран ClC-0 представляет собой полипептид, который формирует хлорный канал, неотличимый от того, что в нативных мембранах. Члены др семейств не изучены столь серьезно, как ClC-0, так что партнерские белки еще м.б. обнаружены. 

Структурно ClC каналы уникальны: они являются дву-поровыми (two-pore) гетеродимерами. Хотя существуют и др модели. В противоположность, все известные  α-спиральные белки ионных каналов, образуют одну пору олигомерами с 4-, 5- или 6-кратной симметрией, где пора появляется по оси симметрии олигомера (Рис. 3).


Рис.3.  |  A comparison between the molecular design of all known ?-helical ion channel proteins and that of the ClC chloride channels, viewed from above the plane of the membrane

Дву-поровая гомодимерная конструкция диктует и основные свойства ClC канала. Во-первых, пору выстилающие остатки должны оязательно возникать из множественных областей первичных последовательностей.  Во-вторых, поры д.б. вне оси симметрии. В противоположность одно-поровым олигомерным каналам,  ClC пора не располагается перпендикулярно к мембране.  Независящая от требований симметрии ClC пора вряд ли имеет прямой ход в белке, скорее она скручена. Свойства проекционной структуры интерпретируются на Рис. 4.


Рис.4.  |  Projection structure of a bacterial ClC-type chloride channel, determined from cryoelectron microscopy of two-dimensional crystals

Localization and function

 ClC-1, который в основном экспрессируется в скелетных мышцах, оказывается мутантным при наследственных миопатиях у человека, коз и мышей; эта ассоциация критическая для установления, что ClC-1 является основным ионным каналом, участвующим в установке и восстановлении вольтажа покоящихся мембран скелетных мышц. Сходным образом выявление ClC-Kb мутаций в качестве причины Bartter's синдрома, наследственной нефропатии с потерей солей, демонстрируют, что эти каналы являются критическим компонентом механизма концентрации мочи в почках. ClC-Ka также, по-видимому. играет важную роль в концентрации мочи, т.к. мыши с нокаутным геном имеют нефрогенный диабет insipidus.
Предполагается, что аномалии при болезни Dent's, плейотропном нарушении почечной ре-абсорбции solute, обусловлены наследственнми мутациями в ClC-5, вызывающими дефектный эндоцитоз  в проксимальных почечных канальцах. ClC-5 в основном локализуются в мембранах внутриклеточных компартментов, как и ClC-4. Эти наблюдаения согласуются с гипотезой, согласно которой ClC-5 служат как 'Cl--шунты' в эндоцитотических пузырьках, делающие возможной ацидификацию без запрещенного разделения зарядов поперек везикулярной мембраны. GEF1, дрожжевой ClC, по-видимому. играет сходную роль . В самом деле, GEF1 обнаруживает больше идентичных последовательностей  с подсемейством млекопитающих, содержащим ClC-5, чем с любым др. подсемейством (Рис. 1).
Хотя физиологическая функция ClCs остается неизвестной, некоторые предположения м. сделать.. ClC-2, который экспрессируется во всех тканях млекопитающих, как полагают, играет роль в клеточном ответе на  volume/osmotic стимулы. Помимо этого, канал ко-оптируется в некоторых нейронах, чтобы модулировать их электрическую возбудимость. ClC-3 также, по-видимому, активируется осмотическими изменениями в среде, посредством фосфориляции, зависимой от протеин киназы A; однако, предполагается, что эти чувствительные к объемц токи обусловлены эндогенными, не-ClC, хлорными каналами.

Mechanism

Все ClCs образуют поры избирательные для ионов хлора среди большого числа органических анионов и непроницаемы для катионов. Детали неизвестны. Возможно, большинсво поры-формирующих остатков законсервировано, т.к. эти остатки обнарживаются в горячих точках (Рис. 2). Показано, что мутации в одной из горячих точке (С-терминальном конце D3 трансмембранном домене, GKEGPFVH (in the single-letter amino-acid code) в ClC-1) оказывают существенное влияние на избирательность канала. Причем эти области доступны с помощью aqueous путей, идущих с обеих сторон мембраны.  Предполагается, что эти остатки формируют часть  'selectivity filter' выстилающего пору канала. Учитывая асимметричную природу  ClC пор, такой избирательный фильтр нуждается в остатках из др частей белка. И в самом деле, мутации многих областей белка затрагивают проницаемость ионов.
Все изученные ClC поры контролируются (открываются и закрываются) с помощью трансмембранного напряжения ( voltage). Это voltage-зависимый контроль, в отличие от катион-селективных каналов, чрезвычайно  поддатливый. Величина и даже направление эффекта строго варьирует между гомологами, даже внутри одного подсемейства. Напр., ClC-1 закрывается в ответ на гиперполяризацию (negative) мембранных потенциалов, тогда как ClC-2 открывается. ClC-0, который закрывается при гиперполяризации, адаптирует противоположную voltage-зависимость, если мутирован по разным, определенно реродственным регионам белка. Структурные свойства, лежащие в основе этой изменчивости, полностью неизвестны.  Некоторые ClCs контролируются др факторами помимо  voltage: pH (ClC-0, -1, -4, and -5), разбухание клеток (ClC-2 and -3), или фосфорилирование (ClC-3).
ClC-0 изучены детеально на уровне одиночного канала. Дано четкое описание некоторых уникальных свойств этого канала. Во-первых,  ClC-0 обладает двумя отдельными voltage-зависимыми контролирующими ворота процессами. Один из них,  'slow gate,' действует на обе поры одновременно, способствуя открытию пор при негативном  (hyperpolarizing) напряжении, и это происходит в течение секунд; второй,  'fast gate,' происходит независимо в каждой из пор, способствуя их запиранию при негативном напряжении и происходит в течение миллисекунд. Voltage-зависимость второго механизма возникает в результате движения постоянных ионов хлора поперек трансмембранного напряжения  (voltage), др уникальное свойство семейства ClC .

Frontiers

Хотя измерение радиоактивных токов показывает, что E. coli ClC являются хлорными каналами, эти типы измерений не сочетаются с механистическими деталями, полученными с помощью электрических регистраций. Остается неясным являются ли каналы прокариот  voltage-зависимыми. Как они контролируются?
Нокаут генов (в форме генетических заболеваний человека) важен для определения физиологии некоторых ClCs. Неожиданно нокаут ClC-3 не оказал влияния на volume-regulated Cl- токи, но еще более неожиданными оказались нокаутные мыши, страдающие от полной дегенерции их гиппокампа. Каналы ClC-3, локализуются во внутриклеточных пузырьках  в этой области головного мозга и их инактивация нарушает ацидификацию синаптических пузырьков. Сходным образом, мутанты мышей (и людей) без гена ClC-7 обнаруживают дефекты регуляции pH; они страдают от тяжелого остеопетроза, болезни вызывающей хрупкость, ломкость костей из-за дефекта  Cl- шунтирования остеокластов - клеток, участвующих в ремоделировании кости. Нокаутные мыши указывают также, что ClCs в ClC-3/4/5и ClC-6/7 подсемейств играют важную роль в регуляции pH во внутриклеточных компартментах.


Сайт создан в системе uCoz