A primer of translation initiation

Контроль трансляции очень часто осуществляется на иниационной ступени, во время которой связывание 40S рибосомальной субъединицы с мРНК является скорость ограниченным.

Рис.1 (animated online)
показывает элементальные свойства инициации для большинства клеточных мРНКs. Структура cap (m⁷GpppN) на 5' конце мРНК облегчает связывание рибосом через взаимодействие с cap-связывающим белковым комплексом. Этот комплекс представлен тремя субъединицами: cap-связывающим белком eIF4E; РНК helicase eIF4A; и modular scaffold белок eIF4G. eIF4G не только связывает eIF4E и eIF4A, но и формирует также мостик между рибосомой и мРНК через взаимодействие с eIF3 . eIF4G соединяется также с poly(A)-связывающим белком (PABP), который облегчает трансляцию poly(A)-содержащих мРНКs.

(Рис.1.) | Translational initiation in eukaryotes.

Сap-связывающий комплекс в комбинации с фактором eIF4B, разворачивает вторичную структуру в 5' untranslated region ( UTR ) мРНК. Это помогает 40S рибосомальной единице проходить через эту область беспрепятственно. Во время этого транзита, eIF3 связывает 40S PRE-INITIATION COMPLEX eIF2 , который формирует четвертичный комплекс с GTP и transfer РНК, которая соединена с заряженным иниационным метионином (Met–tRNA_i). Этот бльшой в 43S комплекс затем скользит в направлении инициирующего AUG кодона, который распознается с помощью антикодона Met–tRNA_i. В этой точке, GTP соединенный с eIF2 гидролизуется, инициирующие факторы высвобождаются и 60S субъединица присоединяется к 40S (для чего необходим eIF5B–GTP). В этой, теперь 80S MONOSOME , eIF5B высвобождается как eIF5B–GDP, и начинается фаза элонгации транскрипции.

Негативные регуляторы трансляции часто участвуют в сборке 48S иниационного комплекса ( мРНК-ассоциированный 43S комплекс). Такие факторы включают eIF4E-связывающие белки (eIF4EBPs), которые не делают различий между мРНКs, или др., которые привязаны — прямо или непрямо — со специфическими последовательностями в 5' или 3' UTRs. Такие мРНК-специфические регуляторы включают iron regulatory protein (IRP) и maskin. Напротив, позитивный регулятор трансляции, PABP, потенциирует сборку 48S комплекса.

Компонентом этой сложности регуляцмии является и клеотчная среда, в которой это происходит, т.к. обычно мРНКs имеется в избытке и конкруирует с др. за ограниченную механику синтеза белка. Следовательно, опреденные свойства мРНК, такие как long 5' UTR с расширенной вторичной структурой, часто затрагивают эффективность трансляции. Хотя это кажется очевидным, что 5' UTR м. влиять на эффективность трансляции, более строгий контроль трансляции осуществляется с помощью 3' UTR. С механистической точки зрения имеется мало хорошо охарактеризованых примеров 3'-UTR-опосредованного трансляционного контроля (Рис.2).

(Рис.2.) | 3'–5' interactions: circles of мРНК.

Oocyte maturation и early embryogenesis

Полностью выросшие ооциты, которые синтезируют и хранят сложную популяцию мРНКs, арестовываются в PROPHASE I (diplotene). Прежде чем они будут оплодотворены, они повторно должны вступить в мейотические деления (созревание ооцитов) и это стимулируется прогестероном. Созревание — которое сопровождается прекращением транскрипции и сложной сетью активаций трансляции и репрессии сохраняемых материнских мРНКs — заканчивается в METAPHASE II, во время которой ооцитыi ожидают оплодотворения еще прежде, чем они закончат финальное мейотическое деление и начнут эмбриональные клеточные деления (Рис.3). Митозы у эмбрионов непохожи на др. тем, что отсутствуют ощутимые G1 или G2 фаза. Когда развивающийся эмбрион представлен 4,000 клеток, происходит mid-blastula transition, который характеризуется несколькими трансформациями, включая удлиннение клеточного цикла и включение в цикл G1 и G2, асинхронность клеточных делений и индукцию транскрипции.

(Рис.3.) | Key events during Xenopus laevis oocyte maturation и early embryogenesis.

Ключевой молекулой, которая действует очень рано во время процесса созревания является Mos (Рис.3) serine/threonine киназа, которая имеет несколько функций. Одна из них индукция каскада mitogen-activated protein kinase (MAPK), который прямо или косвенно ведет к активации M-phase promoting factor (MPF), гетеродимера cyclin B и CDC2 , которые ответственны за многие проявления созревания, такие как разрыв ядерной оболочки (зародышевого пузырька). Mos, по-видимому, участвует также в трансляционной активации CYCLIN B1 мРНК. Вновь синтезированный cyclin B1 собирается в небольшие количества активных MPF, которые индуцируют петлю авто-амплификации путем активации хранимых pre-MPF, тем самым ингибируется синтез ДНК между двумя мейотическими делениями. Наконец, Mos является компонентом cytostatic factor (CSF), который арестовывает созревание в метафазе II для гарантии, что ооцит не будет делиться PARTHENOGENETICALLY , благодаря активации киназы p90^rsk.

Эти критические функции Mos предполагают обильное содержание этого белка в ооците — фактически же они его не содержат. Однако, ооциты содержат дремлющую mos мРНК, которая должна транслироваться для осуществления созревания. Активация mos (и др.) мРНК(s) iобеспечивается цитоплазматическим полиаденилированием (Рис.3.).

Cytoplasmic polyadenylation

Mos, cyclin B1 и некоторые др. дремлющие мРНКs в ооците содержат короткие poly(A) хвосты (~20–40 нуклеотидов длиной), и только когда эти хвосты удлинняются (до~150 нуклеотидов), происходит трансляция. Для полиаденилирования необходимы два элемента в 3' UTR: гексануклеотид AAUAAA, который необходим также для расщепления ядерной pre-мРНК и полиаденилирования; и соседний (обычно в 20–30 нуклеотидов) cytoplasmic polyadenylation element (CPE).

Последовательности CPE изменчивы и содержат последовательности от таких как UUUUAUдо UUUUAACA. Однако, в общем имеется консенсус UUUUUAU. Некоторые мРНКs (напр., cyclin B1) содержат несколько CPEs, и это объясняет зависимость Mos и cdc2 от их способности быть полиаденилированными. В общем, точные последовательности CPE, количество копий CPE, расстояние между CPE и гексануклеотидом или последовательностями соседними к CPE (таким как nanos response element (NRE) в cyclin B1 мРНК), м. регулировать время полиаденилирования.

CPE связывается с CPEB (Рис.4) , высоко законсервированным ZINC FINGER и РНК-RECOGNITION MOTIF (RRM)-type РНК-связывающим белком

(Box 1) | A closer look at CPEB

. Инициация полиаденилирования с помощью этого белка нуждается в киназе Eg2, энзиме, который активируется вскоре после того как ооцит подвергается действию прогестерона и который, по-видимому, в дальнейшем активируется при созревании. Eg2, член семейства AURORA serine/threonine протеин киназ, фосфрилирует CPEB по сериновому остатку 174, это увеличивает сродство CPEB к cleavage и polyadenylation specificity factor (CPSF). Однако, сайт Eg2 фосфорилирования, по-видимому, отсутствует у беспозовоночных (Box 1), поэтому если CPEB активируется у них, то д.б. другая киназа, такая как MAPK. CPSF связывается с AAUAAA последовательностью, это взаимодействие вероятно стабилизируется с помощью CPEB, и присоединяет poly(A) polymerase к концу мРНК.

(Рис.4.) | CPEB-mediated translational control.

Ооциты Xenopus подобно соматическим клеткам содержат многие формы poly(A) polymerase. Одна из этих форм не имеет С-терминальной порции, которая содержит NUCLEAR LOCALIZATION SIGNAL и основной сайт распознавания cdc2. Такие сайты становятся фосфорилитрованными, когда клетка вступает в М фазу и, как следствие, полимераза инактивируется. Неукороченная poly(A) полимераза, которая имеется как в цитоплазме, так и ядре ооцита Xenopus, становится фосфорилированной и скорее всего инактивированной, когда происходит созревание (M phase). Это указывает на то, что короткая форма poly(A) полимеразы м. уникально катализировать цитоплазматическое полмденилирование (Рис.4). Бр4 class=my>CPE-mediated translational repression

Т.к. CPE-содержащие мРНКs в большинстве своем инактивированы в ооцитах, то вряд ли CPE используются в трансляционной репрессии (маскировании) , а также в полиаденилировании. В самом деле, простая инъекция CPE-cодержащей РНК в ооцит вызывает трансляционную репрессию — unmasks — эндогенной CPE-содержащей cyclin B1 мРНК. Кроме того, репортерная РНК, содержащая CPE в 3' UTR маскируется после инъекции. Это указывает на то, что CPEB является маскирующим фактором, также как и индуцирующим полиаденилирование фактором.

Маскирующая функция CPEB лишь косвенная. Др. ингибирующий белок. называемый maskin, по-видимому, ключ к регуляции трансляции мРНК — он взаимодействует одовременно с CPEB и eIF4E (Рис.4). Взаимодействие maskin и eIF4E обеспечивается с помощью eIF4E-связывающего мотива, который присутствует во всех eIF4Gs метазоа и в др. eIF4EBPs. Итак, этот мотив, maskin и eIF4G (и eIF4EBPs и eIF4G) конкурируют за связь с одной и той же областью eIF4E. Следовательно, конкуренция между maskin и eIF4G за eIF4E обеспечивает трансляцию; если maskin соединяется с eIF4E, то трансляция (или точнее, образование eIF4G-необходимого 48S комплекса) репрессируется. Бр4 class=my>Polyadenylation-induced translation

Итак, демаскирование мРНК должно вызывать диссоциацию maskin от eIF4E. Эта диссоциация происходит во время цитоплазматического полиаденилирования. Значит, эти два события м. совпадать с цитоплазматическим полиаднилированием. Однако вряд ли справделиво полагать, что полиаденилирование индуцирует трансляцию путем доиссоциации maskin от eIF4E.

Исходя из того, что 5' cap и poly(A) хвост действуют синергично, чтимулируя трансляцию, предполагается, что такой синергизм отражает стабилизацию eIF4E–eIF4G взаимодействия с помощью PABP, который взаимодействует непосредственно с eIF4G (Рис.4.). В созревающем ооците вновь элонгированные poly(A) хвосты м. ассоциировать с PABP, который в свою очередь м. помочь eIF4G и eIF4E сформировать комплекс. который является более стабильным, чем maskin–eIF4E комплекс. Это будет вызывать инициацию трансляции. Хотя 'классический' PABP, по-видимому, присутствует в небольших количествах в ооцитах, имеется в ооцитах и ранних эмбрионах форма, которая также содержит предполагаемый сайт связывания eIF4G. Более того, пост-трансляционные модификации CPEB, eIF4G или даже maskin, сами по себе все м. влиять на сборку 48S иниационного комплекса.

Др. путь полиаденилирования в ооцитах обеспечивается cap-specific 2'-O-метлилированием (Рис.5.) Структурные m⁷GpppN cap на 5' концах мРНКs обычно метилируются по base (N) или ribose. Как следствие - непрерывная poly(A) элонгация (as opposed to a static poly(A) tail), структура cap 0 (отсутствие метилирования рибозы) по крайней мере одной мРНК превращается в cap I и cap II, которые отличаются метиловыми группами на первой и второй сахарных половинках непосредственно ниже трифосфатного мостика (Рис.5а). Не только отмена метилирования cap ингибирует трансляцию, но и на мРНК уже имеющаяся cap I структура транслируется более эффективно, чем мРНК, содержащая cap 0 после инъекции в ооцит. Однако не все CPE-содержащие мРНКs испытывают метилирование cap рибозы.

(Рис.5.) | Cap-specific 2'-O-methylation.

Хотя взаимосвязь полиаденилирования и метилирования cap рибозы неизвестна, обнаружены примеры Vaccinia virus, у которого вирусная poly(A) polymerase и метилтрнасферазная активность располагаются в одноми том же полипептиде (Рис. 5b). Хотя poly(A) полимераза ооцита вряд ли так же имеет присущую метилтрансферазную активность, но возможно, полиаденирлирование и метилирование рибозы катализируются двумя полипептидами, которые образут гетродеимер (Рис. 5c). Бр4 class=my>Polyadenylation, cell cycle и embryo polarity

Когда происходит полиаденилирование во время созревания ооцитта, то большинство CPEB (~90%) разрушается — действительно все, что остается стабильным относится к ANIMAL POLE BLASTOMERES , где он ассоциирует с веретеном и центросомами. Maskin имеет сходную локализацию. Не удивительно, оба белка связывают микротрубочки и, по крайней мере, CPEB взаимодействие (прямое) обеспечивается малым внутренним PEST (proline, glutamic acid, serine, theonine) доменом. Инъецированные в эмбрион, реагенты, которые, как известно, нарушают трансляцию, индуцированную полиаденилированием (напр., антитела против CPEB, CPEB dominant-negative мутация или 3'-DEOXYADENOSINE , ингибируют клеточные деления и продуцируют аномальные митотические структуры, такие как множественные центросомы, центросомы, отсоединенные от веретена, и триполюсные веретена. Это указывает на то, что эмбриональные клеточные деления м. нуждаться в polyadenylation-induced трансляции, но они не указывают, где такая потребность появляется (напр., расстворимые или ассоциированне с веретеном), или какая мРНК(s) м. использоваться.

мРНК cyclin B1 является ключевой молекулой. Во-первых, он содержит CPE и регулируется с помощью полиаденилировнаия. по крайней мере. в созревающих ооцитах. Во-вторых, его трансляция необходима для клеточных делений. D-третьих, он обнаруживается на веретенах эмбрионов Drosophila. И наконец, циклиновый белок обнаружен на веретенах в HeLa клетках. Неудивительно, что мРНК и белок cyclin B1 обнаружены ассоциированными с веретеном у эмбрионов Xenopus. Эти данные говорят о том, что клеточные деления нуждаются в трансляции cyclin B1 мРНК на веретене. В самом деле, хотя инъекции CPEB мутантного белка без его домена, связывающего микротрубочки, оказывают мало влияния на трансляцию cyclin B1 мРНК, они заставляют эти мРНК диссоциировать от веретена. Следствием этого является потеря белка cyclin B1 из веретена и, как результат, подавление клеточного деления. Следовательно, CPEB контролирует не только трансляцию циклиновой мРНК, но и ее локализацию на веретене.

Сходная картина локального трансляционного контроля выявлена при изучении гомолога CPEB Drosophila, Orb. Orb регулирует трансляцию и локализацию oskar и gurken мРНКs, а также самой orb мРНК. Эта регуляция локальной трансляции является критической для переднезаднего и дорсовентрального паттернирования во время оогенеза Drosophila, а также для формирования яйцевой камеры и втупления в мейооз. Гомолог СРЕВ у рыбок данио, Zorba, также локализуется на дорсальной части эмбриона. У эмбрионов Xenopus, по крайней мере одна мРНК, кодирующая Xwnt-11, подвергается цитоплазматическому полиадденилированию в дорсальном компартменте, что указывает на законсервированный механизм образования паттерна тела у позвоночных.

Polyadenylation и synaptic plasticity

Хотя трансляция , индуцированная полиаденилированием, является характерной для раннего развития metazoans, но присутствие CPEB указывает на его возможность и в соматических клетках. У мышей выявлено превалирование CPEB в головном мозге. CPEB присутствует вгиппокампе, в синапсах культивируемых нейронов гиппокампа, во форакции POSTSYNAPTIC DENSITY. Это важно, т.к. трансляция мРНКs сохраняется в дендритах. В самом деле, стимуляция синапсов индуцирует полиаденилирование и трансляцию CPE-содержащей мРНК в дендритах (кодирующей calcium–calmodulin-dependent kinase II αCAMKII ), но не мРНК, у которых отсуствует CPE (нейрофиламент) . Следовательно, CPEB-контрлируемая трансляция м. влиять на синаптическую пластичность и, возможно, на долговременую память.

TRANSLATIONAL CONTROL BY CPEB: A MEANS TO THE END

Links

A primer of translation initiation

Oocyte maturation и early embryogenesis

Cytoplasmic polyadenylation

Polyadenylation и synaptic plasticity